CN103740681B - 一种添加有纤维素酶生长猪专用酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生长猪专用酶及其制备方法，属于饲料酶制剂领域。所述生长猪专用酶由以下重量份数的组分组成：中草药粉0.5‑2份，木聚糖酶20‑40份，蛋白酶5‑8份，果胶酶2‑5份，纤维素酶8‑16份，β‑葡聚糖酶10‑20份，中温α‑淀粉酶2‑6份。其中纤维素酶的生产菌种为里氏木霉(Trichoderma reesei)601‑17，保藏编号为CCTCC M2013540，制备方法如下：斜面菌株培养获得液体种子；发酵阶段采用低温、逐级接种相结合的方法；发酵液经离心，收集、浓缩、过滤、干燥获得纤维素酶。纤维素酶经过浓缩干燥后其单位活性和活力进一步提高，有效的补充了内源酶的不足，促进营养物质的消化吸收，提高了饲料利用率。

Description

一种添加有纤维素酶生长猪专用酶及其制备方法

技术领域

本发明属于酶制剂领域，具体涉及一种复合酶及其制造方法。

背景技术

前苏联科学家在早期断奶仔猪日粮中添加淀粉糊精酶，使得日增重提高14.6%，碳水化合物消化率提高77.2%。据美国有关资料报道，Collier在早期断奶仔猪日粮中补充酶制剂（含蛋白酶、淀粉酶、葡聚糖酶），结果实验组比对照组日增重提高了25%，饲料转化率提高了15.5%。西德学者曾多次进行育肥猪添加复合酶制剂的实验研究，在以大麦为主的日粮中，添加0.1%的复合酶制剂，结果为：实验组比对照组生长速度提高5.1%，饲料利用率提高4.1%。可见，淀粉酶能显著提高畜禽对饲料的消化吸收，促进生长，降低饲料成本，并且作为一种绿色饲料添加剂，它的使用具有安全性，有利于畜牧业生产走上经济节约型的发展道路。

名称为猪用复合酶饲料添加剂，申请号为200910067312.3的专利，本发明是猪用复合酶饲料添加剂,其添加物料及其重量比是脂肪酶10-20%,纤维素酶15-35%,甘露聚糖酶25-35%,木聚糖酶10-35%。每999千克猪全价配合饲料的添加量为1千克。该添加剂可提高猪饲料消化利用率。本发明的特点是:增进食欲、促进饲料消化,提高机体免疫功能,改善肉质,是一种无毒副作用、无药物残留的安全饲料添加剂。

目前，市场上针对饲料的复合酶多种多样，但是有的酶配比不合理，达不到应有的效果，导致畜禽生长缓慢，生产力低下；有的酶活性低，添加量大，导致饲养成本成本高。鉴于粮食的短缺是困扰我国饲料工业发展的主要因素，因此，要选择有利于节约粮食资源的畜牧业发展道路，提高饲料利用率，充分利用有限的粮食资源获得尽可能多的畜产品。

发明内容

本发明的目的在于针对上述缺陷提供一种配比合理，活性高的单一酶种复配的生长猪专用酶及其制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种生长猪专用酶，由以下重量份数的组分组成：中草药粉0.5-2份，木聚糖酶20-40份，蛋白酶5-8份，果胶酶2-5份，纤维素酶8-16份，β-葡聚糖酶及其培养物10-20份，中温α-淀粉酶2-6份。

所述木聚糖酶、蛋白酶、果胶酶和中温α-淀粉酶均为湖南鸿鹰翔生物工程股份有限公司产品；

所述中草药为黄芪、党参或柴胡中至少一种，使用时将其粉碎即可；

所述纤维素酶制备方法如下：

所述纤维素酶的生产菌种为里氏木霉(Trichodema reesei)601-17，保藏编号为CCTCC NO：M2013540，里氏木霉菌株接种到斜面活化培养基上，逐级扩大培养制备种子液，培养时间为72-96小时；种子液按发酵液体积5-10％的接种量接种于发酵培养基中，20-35℃培养96-144小时，即里氏木霉发酵生产纤维素酶结束；将发酵液在4000-600orpm离心，收集所得液体为粗酶液；得到的粗酶液进行超浓缩过滤、干燥获得纤维素酶。

优选的，一种生长猪专用酶按如下重量份数组成：由以下重量份数的组分组成：黄芪粉1份，木聚糖酶30份，蛋白酶6份，果胶酶4份，纤维素酶10份，β-葡聚糖酶及其培养物15份，中温α-淀粉酶5份。

一种生长猪专用酶的生产方法，将中草药粉，木聚糖酶，蛋白酶，果胶酶，纤维素酶，β-葡聚糖酶及其培养物，中温α-淀粉酶按照比例混合后包装或造粒后包装；所述纤维素酶制备方法如下：所述纤维素酶的生产菌种为里氏木霉(Trichodema reesei)601-17，保藏编号为CCTCC NO：M2013540，里氏木霉菌株接种到斜面活化培养基上，逐级扩大培养制备种子液，培养时间为72-96小时；种子液按发酵液体积5-10％的接种量接种于发酵培养基中，20-35℃培养96-144小时，即里氏木霉发酵生产纤维素酶结束；将发酵液在4000-600orpm离心，收集所得液体为粗酶液；得到的粗酶液进行超浓缩过滤、干燥获得纤维素酶。

所述β-葡聚糖酶及其培养物制备方法如下：

（1）种子培养

将地衣芽孢杆菌斜面菌种经三级摇瓶发酵剂一级种子罐发酵；

所述种子培养的培养基为：酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，海藻糖1-3%，硫酸钙1g,氯化镁2g,柠檬酸钠1-3g，不足部分纯净水补足，pH4.5-7.0，121-123℃灭菌30-40min。

（2）发酵罐发酵

将一级种子罐发酵液以3%接种量接入含有3L发酵培养基的发酵罐中，培养温度35-45℃，搅拌速度200-300r/min，通风量（V/V）1:1-3,培养时间10-15h；然后将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35-45℃时恒温培养15-20h；此时，将一级种子罐发酵液以2%接种量追加接入发酵罐，恒温培养10-15h；继续将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35-45℃时恒温培养10-15h；

所述发酵培养基组成为：麦麸75g，玉米粉55g，米糠25g，豆饼粉20g，β-葡聚糖2g，中草药剂粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水l000mL，pH值4.5-7.0，121℃灭菌20min；

所述发酵培养基的调配方法为：按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值3-7，加入中温淀粉酶（3u/g玉米粉）与高温淀粉酶（30u/g玉米粉），同时边搅拌边升温至70℃保温15-30min，然后缓慢升温至90℃保温15-30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始PH3-7，121-123℃灭菌30-40min备用。

溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15-30%；

PH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在3-7；

补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml；

放罐标准：60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。

（3）发酵液经离心分离、浓缩、精滤、干燥得β-葡聚糖酶，离心所获得地衣芽孢杆菌菌体经清洗后冷冻干燥获得地衣芽孢杆菌菌体，将β-葡聚糖酶和地衣芽孢杆菌菌体混合获得β-葡聚糖酶及其培养物。

所述地衣芽孢杆菌具体为地衣芽孢杆菌（Βacillus licheniformis）β-10-25。该菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编430072），保藏号为CCTCC NO：M2013538，分类命名为地衣芽孢杆菌β-10-25Βacillus licheniformisβ-10-25。

该菌株由一株本公司实验室保藏的产β-葡聚糖酶的地衣芽孢杆菌（Βacillus licheniformis）β-10原始出发菌种→试管活化→紫外线（UV）-氯化锂（LiCl）-硫酸二乙酯（DES）复合诱变→平板初筛(高产)→摇瓶复筛(高产)→热稳定性测定→传代稳定性试验等步骤筛选获得，特点如下：

所述菌株在固体平板上菌落为白色，边缘不整齐，表面干燥不透明，镜检为革兰氏阳性细菌，细胞形态呈短杆状，芽孢中生，椭圆形，不膨大。

所述菌株生理生化特征：V-P试验（+），淀粉水解（+），酪素水解（+），明胶水解（+），硝酸盐还原（+），吲哚试验（-），利用柠檬酸盐（+），硝酸还原（+），甘露醇（+），木糖（+）。

所述生长猪专用酶适用于饲料加工厂和养殖场自配饲料，使用时应与饲料中的其它原料混合均匀。建议每吨全价料添加量为80-200g（饲料中小麦用量低于30%，添加量为100g/t，小麦用量超过30%，添加量为120-150g/t）。

有益效果：

本发明中添加了具有良好生物性能的纤维素酶，特别适合动物体内环境，经过浓缩干燥后其单位活性和活力进一步提高。混合后的酶制剂对于分解利用饲料原料具有良好的作用效果。本发明中添加了中草药粉剂，其具有天然抗菌和增强免疫力的作用，可以有效的提高畜禽动物的抗应激能力、免疫功能以及抗病防御机能。另外，中草药粉剂中添加了具有抗热应激原作用的黄芩、柴胡，使得本发明产品具有更好的稳定性和保存活性，较没有添加中草药粉剂的产品在长时间高温条件下的保存活性提高了15%。发明产品中β-葡聚糖酶及其培养物含有益生菌地衣芽孢杆菌对于维护动物肠道健康具有良好作用；本发明配比合理，有效的补充了内源酶的不足，促进营养物质的消化吸收，提高了饲料利用率，节约了饲养成本。

具体实施方式

所述纤维素酶的生产菌种为里氏木霉(Trichodema reesei)601-17，该菌株于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013540，分类命名为里氏木霉601-17Trichodema reesei601-17，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072。

所述菌株产纤维素酶的最适pH3.0-6.0；最适温度为23～35℃。

所述菌株生理生化特征：

该菌株在PDA固体培养基上生长，形成的菌落特征为菌落呈棉絮状，菌落呈淡绿色，菌落扁平，高0.1-0.75mm，菌落边缘白色，整齐；生长速度快，48h菌落直径达1.0-8.5mm,72h达30-50mm；菌丝白色，有隔膜，菌丝壁光滑，直径在2-5ūm。分生孢子梗从菌丝的短侧枝发生，侧枝上对生。分生孢子梗呈瓶状，直立，无色，孢子呈球形，绿色，直径20-100ūm。

该菌株可在麦麸上生长，主要代谢产物为纤维素酶（内切纤维素酶、外切纤维素酶和葡萄糖苷酶）。根据《An Introduction industrial mycology》（George Smith1954）、《真菌鉴定手册》（魏景超1982）、《常见与常用真菌》（中科院微生物研究所1973)，鉴定该菌株为：里氏木霉。

利用里氏木霉菌株，通过紫外诱变、培养、发酵生产纤维素酶的方法如下。

菌种初筛：原始菌株里氏木霉HYX01采自津市市保河堤食用菌培植基地中的土样筛选分离出。里氏木霉菌株接种到斜面活化培养基上，活化菌种；培养活化后的菌种，挑取单菌落制备孢子悬浮液，并用紫外照射孢子悬浮液，诱变得到孢子菌落；适当稀释将孢子浓度调节为10³个/mL，取最后稀释度的菌液0.2mL，稀释涂布于纤维素-刚果红平板筛选培养基上。在30℃培养3天后挑取透明圈/菌落直径较大的菌株200支。（所述纤维素-刚果红平板筛选培养基组成如下：纤维素粉10g、刚果红0.2g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、明胶2g、琼脂20g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min）。

复筛：将获得的200株菌分别用无菌牙签接种于斜面培养基，30℃培养至孢子铺满斜面。分别将孢子以无菌水洗下接种于装有50mL复筛培养基的250mL三角瓶中进行发酵，接种量10％（v/v），30℃、100r/min培养96h，分别测定各菌株的纤维素酶活性。（所述复筛培养基组成如下：纤维素粉50g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min）。选取纤维素酶酶活力最高的菌株进行放大实验。

复筛选出菌株为里氏木霉(Trichodema reesei)601-17，保藏编号为CCTCC NO：M2013540。

培养特征：该菌株产纤维素酶的最适pH3.0-6.0；最适温度为23～35℃。

遗传稳定性试验：将该菌株在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。

放大试验

种子培养：将纤维素酶酶活力最高的菌株接入500mL三角瓶中，种子培养基装量100毫升，30℃、150rpm摇床培养72-96h。

种子罐培养：将种子液以10%（v/v）接种量接入装有7.5L发酵培养基的10L发酵罐中，控制pH值恒定为5.0±0.2，培养温度27±0.1℃，搅拌速度300rpm，通风量（v/v）1:0.8-1.2,培养时间104h，溶解氧20-30%。所述发酵培养基制备方法为：纤维素粉10%、硫酸铵0.5%、硫酸镁0.025%、磷酸二氢钾0.1%、氯化钠0.01%、其余为水，pH值5-6，121℃灭菌20min。

发酵结束后，取发酵上清液（粗酶液）进行酶活力检测，经测定，外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到680U/mL、1389U/mL、486U/mL和792U/mL。

实施例2

优选的，一种生长猪专用酶按如下重量份数组成：由以下重量份数的组分组成：黄芪粉1份，木聚糖酶30份，蛋白酶6份，果胶酶4份，纤维素酶10份，β-葡聚糖酶及其培养物15份，中温α-淀粉酶5份。

实施例3：由以下重量份数的组分组成：中草药粉2份，木聚糖酶40份，蛋白酶5份，果胶酶2份，纤维素酶16份，β-葡聚糖酶及其培养物20份，中温α-淀粉酶5份。中草药粉所述中草药由黄芪和党参组成，黄芪和党参的质量比例为1:1,使用时将其粉碎即可。

实施例4效果对比实验

选取120头生长猪，按体重、血统及性别无差异分为实验组和对照组，每组3个重复，每个重复20头猪。实验期为28天，实验组和对照组每吨饲料均添加复合酶制剂120g，实验组所用复合酶制剂为实施例3所述复合酶制剂，对照组所用复合酶制剂为市售同类复合酶。

相对对照组，实验组日采食量提高显著，比对照组增加了40g/d,日增重达到218.89g，比对照组提高了45g，料重比增加为1.36，对照组为1.48；腹泻率也极大减少，实验组为7次，对照组为12次，五分制皮肤和毛色评分（5分为最高），实验组达到4.2分，而对照组为3.4分，以上数据结果表明本发明饲料产品具有良好饲喂价值。可以有效提高饲喂效果和效益。

实施例5中草药粉剂对酶保存活性的影响

以实施例3中所述的制备方法获得的生长猪专用酶为样品1，以去除实施例3中所有的中草药粉剂的制备方法获得的生长猪专用酶为样品2，比较两种样品的保存活性。在45℃下保存上述样品18h，之后测定酶活，结果表明：样品1的残余酶活在75%以上，样品2的残余酶活保持在60%左右。

Claims (3)

1.一种生长猪专用酶，由以下重量份数的组分组成：中草药粉2份，木聚糖酶40份，蛋白酶5份，果胶酶2份，纤维素酶16份，β-葡聚糖酶及其培养物10份，中温α-淀粉酶5份，所述纤维素酶由里氏木霉(Trichoderma reesei)601-17，保藏编号为CCTCC NO：M 2013540经发酵培养制备；所述中草药由黄芪和党参组成，黄芪和党参的质量比例为1:1；纤维素酶制备方法如下：所述纤维素酶的生产菌种为里氏木霉(Trichoderma reesei)601-17，保藏编号为CCTCC NO：M 2013540，里氏木霉菌株接种到斜面活化培养基上，逐级扩大培养制备种子液，培养时间为72-96小时；种子液按发酵液体积5-10％的接种量接种于发酵培养基中，20-35℃培养96-144小时，即里氏木霉发酵生产纤维素酶结束；将发酵液在4000-6000rpm离心，收集所得液体为粗酶液；得到的粗酶液进行超浓缩过滤、干燥获得纤维素酶；β-葡聚糖酶及其培养物为β-葡聚糖酶和地衣芽孢杆菌菌体的混合物。

2.根据权利要求1所述生长猪专用酶的制备方法，其包括如下步骤：将中草药粉，木聚糖酶，蛋白酶，果胶酶，纤维素酶，β-葡聚糖酶及其培养物，中温α-淀粉酶按照比例混合后包装；所述纤维素酶制备方法如下：生产菌种为里氏木霉(Trichoderma reesei)601-17，保藏编号为CCTCC NO：M 2013540，里氏木霉菌株接种到斜面活化培养基上，逐级扩大培养制备种子液，培养时间为72-96小时；种子液按发酵液体积5-10％的接种量接种于发酵培养基中，20-35℃培养96-144小时，即里氏木霉发酵生产纤维素酶结束；将发酵液在4000-6000rpm离心，收集所得液体为粗酶液；得到的粗酶液进行超浓缩过滤、干燥获得纤维素酶。

3.根据权利要求2所述生长猪专用酶的制备方法，所述β-葡聚糖酶及其培养物制备方法如下：

地衣芽孢杆菌培养获得发酵液经离心分离、浓缩、精滤、干燥得β-葡聚糖酶，离心所获得地衣芽孢杆菌冷冻干燥获得地衣芽孢杆菌菌体，将β-葡聚糖酶和地衣芽孢杆菌菌体混合获得β-葡聚糖酶及其培养物；地衣芽孢杆菌(Βacillus licheniformis)保藏号为CCTCC NO：M2013538。