CN100999713A - 一种黑曲霉菌株及其nsp酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黑曲霉菌株(Aspergillus niger)及其NSP酶的制备方法。该菌株已保藏在中国微生物菌保中心，保藏号CGMCC NO.1578。其菌落在查氏培养基上生长迅速，25℃ 7天直径40～50毫米；质地丝绒状或稍带絮状；分生孢子结构大量，褐黑色，无渗出液；菌落反面略带黄色。本发明应用所提供的该菌株，采用所述的制酶方法，获得了以高活性木聚糖酶为优势，富含果胶酶、纤维素酶、β－葡聚糖酶、甘露聚糖酶等多种NSP酶的制品，适用于作为饲料添加剂使用，特别是对降解非常规饲料中的抗营养因子具有针对性。本发明具有以下优点：(1)酶系广、酶活高；(2)针对性强、实效性好；(3)成本低廉、效益显著；(4)安全、环保、无残留、无污染。

Description

一种黑曲霉菌株及其NSP酶的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物及其用途，尤其是涉及一种黑曲霉菌株(Aspergillusniger v.Tiegh.)及其NSP酶的制备方法。

背景技术

饲用酶制剂包括动物内源性补充酶和动物自身不能分泌的、用于消除饲料抗营养因子作用的外源性酶，其中主要为非淀粉多糖(Non-starchpolysaccharide，NSP)酶，其应用范围和作用远远超过前者。NSP酶包括半纤维素酶、纤维素酶和果胶酶等，半纤维素酶类又包括木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶等，各种酶起着相互协调相互补充的作用。目前我国饲料资源的现状，一方面由于受玉米地域性种植和价格因素的影响，我国主要能量饲料资源短缺，另一方面全国每年有大麦、小麦(包括麸皮、次粉)、稻谷(包括米糠、糙米)、黑麦、燕麦等2000多万吨，这是一项大宗的饲料资源，因此今后的饲料工业将出现玉米饲料和稻麦饲料并举的格局。但这些能量饲料不同程度都含有抗营养因子，主要有木聚糖(存在于小麦、黑麦、米糠中)和β-葡聚糖(存在于大麦、燕麦中)以及其它NSP，是影响畜禽养分利用的一个重要因素。因此，关键是要针对不同饲粮背景进行酶制剂系列化开发，其中获得性能优良的高产NSP酶的菌种是至关重要的，再辅以相配套的制备工艺，才能大幅度降低生产成本，酶才有可能够廉价地应用于饲料工业。

发明内容

本发明的目的是提供一种黑曲霉菌株(Aspergillus niger v.Tiegh.)及其NSP酶的制备方法。

黑曲霉菌株(Aspergillus niger v.Tiegh.)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC NO.1578。

菌落在查氏培养基上生长迅速，25℃ 7天直径40～50毫米；质地丝绒状或稍带絮状；分生孢子结构大量，褐黑色，无渗出液；菌落反面略带黄色。分生孢子头球形至辐射形，直径150～450微米；分生孢子梗发生于基质，孢梗茎1000～3000×12～20微米，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近球形，直径40～70微米，全部表面可育；产孢结构双层，梗基10～20×4.5～7.0微米，瓶梗6～10×2.5～3.5微米，分生孢子球形或近球形，直径3～4.5微米，褐色，壁粗糙。

以麸皮、玉米芯为主要原料制备NSP酶的步骤为：

①斜面菌种制备：斜面培养基采用查氏培养基，121℃灭菌30min，从砂土管中接种黑曲霉菌株(Aspergillus niger v.Tiegh.)，置于28℃下培养4～5d，待表面长满褐黑色孢子后置4℃冰箱中贮存备用；

②三角瓶种子制备：采用500ml三角瓶，装入种子培养基15g，加水15ml，松散搅匀，经121℃灭菌30min后，自然冷却，接种后置28℃下培养4～5d，待培养基上长满褐黑色孢子后放入4℃冰箱中冷藏备用。使用时制成孢子悬浮液，在每只种瓶中，加入无菌水500～1000ml浸泡，捣碎搅拌均匀，用二层纱布过滤，滤液即孢子悬浮液用于生产接种；

③发酵产酶：发酵培养基由麸皮76％、玉米芯18％、豆粕4.5％、无机盐1.5％混合组成，物料加水比1∶1.1～1.2，pH自然，经121℃高压蒸汽灭菌30～40min，冷却后按0.1～0.3％(w/w)接入孢子悬浮液，松散拌匀，置于发酵室内温度保持在28～30℃，相对湿度保持在80～90％条件下，培养50～54h出曲，期间随着菌体的消长变化和产酶量的增加，及时调控培养温度、湿度及通风量；

④后处理：发酵产物经在40～45℃下烘干，粉碎过80目筛，加入载体，混合后包装。

本发明具有以下几方面优点：

(1)酶系广、酶活高

该菌株的发酵产物所含酶系广，可同时产生木聚糖酶、果胶酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶等多种NSP酶，尤其是木聚糖酶活性在查新检索范围内处领先水平，同时其酶学特性(反应pH和温度)与动物消化道环境基本相吻合，能在畜禽消化中保持发挥较高的酶活力。

(2)针对性强、实效性好

该菌株的发酵产品，是针对动物不同生长阶段的消化生理特点和畜禽日粮中抗营养因子的不同种类和含量而设计研制，能有效降解饲料原料特别是非常规饲料中所含的主要抗营养因子NSP，促进动物对饲料养分的吸收利用，广泛适用于各类畜禽、水产养殖。

(3)成本低廉、效益显著

该菌株经发酵能产生较高的多种酶活性，且产酶性能稳定；生产原材料主要为普通农副产物，价廉易得，适于大规模工业化生产；而且产品附加值较高，能产生较好的经济、社会及生态效益。

(4)安全、环保、无残留、无污染

采用纯天然原料，经微生物发酵精制而成，绝不含毒素、激素等不良因子。生产过程中不产生“三废”，而且畜禽使用后还能降低粪便中有机物的排泄量，减少污染，保护环境。

附图说明

附图是由黑曲霉菌株AS-34发酵生产饲用NSP酶制剂的工艺流程图。

具体实施方式

本发明提供的黑曲霉菌株AS-34，其菌落在查氏培养基上生长迅速，25℃ 7天直径40～50毫米；质地丝绒状或稍带絮状；分生孢子结构大量，褐黑色，无渗出液；菌落反面略带黄色。分生孢子头球形至辐射形，直径150～450微米；分生孢子梗发生于基质，孢梗茎1000～3000×12～20微米，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近球形，直径(30-)40～70微米，全部表面可育；产孢结构双层，梗基10～20×4.5～7.0微米，瓶梗6～10×2.5～3.5微米，分生孢子球形或近球形，直径3～4.5(-5)微米，褐色，壁粗糙。

本发明所述的NSP酶的制备方法为，采用固体发酵法，以来源广泛、价格低廉的麸皮、玉米芯等农副产品及其副产品为主要生产原材料，物料加水比1∶1.1～1.2，pH自然，经121℃高压灭菌30～40min，冷却，按0.1～0.3％(w/w)的接种量，接入本发明提供的黑曲霉菌株AS-34的孢子悬浮液，松散拌匀。在相对无菌条件下，一般于温度28～30℃、相对湿度80～90％下，经50～54h的发酵周期即可，期间随着菌体的消长变化和产酶量的增加，须及时调控培养温度、湿度及通风量，此乃发酵成败的技术关键所在。发酵产物(曲块)经适当粗捣碎，采用适宜的干燥设备，控制干燥温度在40～45℃之间烘干。然后经80目粉碎，混和后得干曲制品，制成NSP酶制剂。

该黑曲霉菌株主产高活性的木聚糖酶(酶活力可高达76万u/g以上)，以及还同时产生果胶酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶等多种NSP酶。

1.黑曲霉菌株AS-34的诱变选育

对黑曲霉出发菌株，采用先进的育种技术手段——⁶⁰Co高能辐射结合NTG化学诱变，交替理化诱变进行复合处理，定向选育出一株高产NSP酶的黑曲霉菌株，编号为AS-34。具体流程为：

①⁶⁰Co辐照诱变：出发菌株→斜面培养(28℃，4～5d)→用无菌生理盐水制成孢子悬浮液(10⁶～10⁷个/ml)→分别采用7～15万rad剂量进行γ射线辐照处理→逐级稀释涂布平板→平皿培养(28℃，4～5d)→挑取形态变异的菌落供筛选→三角瓶培养(28℃，50h)→酶活测定→初筛出进一步待诱变的出发菌株。

②NTG诱变：选定的下一步诱变的出发菌株→斜面培养(28℃，4～5d)→用无菌磷酸缓冲液制成孢子悬浮液(10⁶～10⁷个/ml)→分别等量加入浓度为1～3mg/ml的NTG溶液(于30～40℃振荡处理20～40min)→逐级稀释涂布平板→平皿培养(28℃，4～5d)→挑取形态变异的菌落供筛选→三角瓶培养(28℃，50h)→酶活测定→优选若干菌株供复筛。

③诱变株的筛选：将获得的变异株进行三角瓶产酶发酵试验，在10g基础产酶培养基中接种1ml斜面孢子悬浮液，搅拌均匀后置28℃生化培养箱中培养50h，测定酶活性，经三次以上的复筛，从中选出高产株——黑曲霉菌株AS-34，埋于砂土管中保藏。

2.黑曲霉菌株AS-34的特征

①形态特征：AS-34菌株经中国科学院微生物研究所鉴定，分类命名为黑曲霉(Aspergillus niger v.Tiegh.)，此株黑曲霉经过诱变而来，已于2005年12月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国.北京.中国科学院微生物研究所内，其保藏登记号为CGMCC NO.1578。该菌株的菌落在查氏培养基上生长迅速，25℃ 7天直径40～50毫米；质地丝绒状或稍带絮状；分生孢子结构大量，褐黑色，无渗出液；菌落反面略带黄色。分生孢子头球形至辐射形，直径150～450微米；分生孢子梗发生于基质，孢梗茎1000～3000×12～20微米，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近球形，直径(30-)40～70微米，全部表面可育；产孢结构双层，梗基10～20×4.5～7.0微米，瓶梗6～10×2.5～3.5微米，分生孢子球形或近球形，直径3～4.5(-5)微米，褐色，壁粗糙。

②培养特性：AS-34菌株适合于在查氏培养基上生长，长势迅速，在25℃下培养7天，菌落直径可达到40～50毫米。

③遗传特性：考察了AS-34诱变菌株的传代性能，从砂土管接出至试管斜面，连续转接7代进行产酶发酵试验，均保持较高的产酶性能，具良好的遗传稳定性。

3.黑曲霉菌株AS-34的生理特性

①碳氮源对产酶的影响：可选用富含半纤维素的麸皮、玉米芯粉、玉米皮、米糠等天然化合物作为供试碳源，小分子碳化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇等则不利于产酶。单一碳源中麸皮产酶能力最强，而复合碳源又显著优于单一碳源，其中尤以麸皮+玉米芯组成的复合碳源为佳。有机氮源促进产酶的能力依次为豆粕＞花生饼粉＞蚕蛹粉＞酵母粉＞鱼粉，而蛋白胨、酵母膏则抑制其产酶。

②无机盐对产酶的影响：硫酸铵有显著的促进产酶作用，其次为多种硝酸盐类有利于产酶，磷酸盐对产酶也有一定的促进作用，而氯化铵则明显抑制其产酶。

③培养基pH对产酶的影响：黑曲霉菌株AS-34在偏酸性培养基上产较高酶活，其适合的初始pH范围在5.0～6.5之间，以麸皮等天然物为主原料的生产性培养基中采用自然pH即可。

④培养温度对产酶的影响：黑曲霉菌株AS-34适合在25～32℃之间培养生长，最适培养温度为28～30℃。低于25℃培养发酵缓慢，高于35℃培养发酵周期明显缩短，随之产酶量也急剧下降。

⑤发酵时间对产酶的影响：在适合培养条件下，一般接种该黑曲霉菌株16～18h后，开始产生白色菌丝并结成块状，继续培养至28h后开始产酶，36h后产酶量快速增长，发酵至50～54h达到产酶高峰。其产酶性能不同于有些黑曲霉菌种，随孢子生成量的增多而酶活增加，该诱变菌株的产酶量与产孢量关联度不大，发酵终止时，总体上基本不产孢或仅培养基表层可见少量褐黑色孢子。

4.黑曲霉菌株AS-34的生化特性

①温度对酶活力的影响：以木聚糖酶为对象，其适宜作用温度范围在40～50℃之间，而以47～48℃为最适，低于35℃或高于55℃酶活急骤下降。

②pH对酶活力的影响：以木聚糖酶为对象，其适宜作用pH范围在3.5～6.0之间，而最适反应pH为4.4～4.8。

③液体酶的热稳定性：以木聚糖酶为对象，该液体酶在50℃下基本稳定，超过55℃酶活迅速下降，60min后残存酶活力为67.3％，60℃处理30min仍保持有35.7％的活力，表明该酶在液体条件下也具有较好的热稳定性。

④固体酶的热稳定性：以木聚糖酶为对象，将该固体酶制剂分别置于75℃、85℃、95℃不同温度下处理10min，然后按常规方法测定其酶活残存率，依次为93.4％、84.2％、71.7％，可见该酶对干热有较强的耐受能力，以适应饲料制粒时的高温环境条件。

⑤固体酶制剂的贮存稳定性：以木聚糖酶为对象，将该固体酶制剂在室温条件下保存8个月，其酶活还残存88.4％，表明该酶具有良好的贮存稳定性。

5.黑曲霉菌株AS-34的产酶特性

该菌株在适合培养条件下，发酵产物经酶系分析，不仅所含酶谱广泛，几乎包含了饲用酶中重要的NSP酶类，包括木聚糖酶、果胶酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶等，而且所产酶活性普遍较高，尤其是其中的主酶——木聚糖酶活性极高，并且其酶学性质表明，其适宜作用温度范围在40～50℃之间，适宜作用pH范围在3.5～6.0之间，与动物消化道环境基本相吻合，适用于作为饲料添加剂使用，这些NSP酶对降解各种饲粮类型特别是非常规饲料中的抗营养因子具有十分针对性。

6.黑曲霉菌株AS-34的安全性

该菌株的发酵产物，经浙江省疾病预防控制中心毒理检测，小鼠急性经口毒性试验表明，该酶制剂小鼠急性经口LD₅₀大于10g/kg体重，根据急性毒性分级标准，其小鼠急性经口毒性属于实际无毒类，饲用安全。

7.黑曲霉菌株AS-34生产NSP酶的方法

①斜面菌种制备：斜面培养基采用查氏培养基，蔗糖3％，NaNO₃ 0.3％，K₂HPO₄0.1％，KCl 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，FeSO₄·7H₂O 0.001％，琼脂2.0％，pH6.7。经121℃灭菌30min，从砂土管中接种后，置于28℃下培养4～5d，待表面长满褐黑色孢子后置4℃冰箱中贮存备用。

②三角瓶种子制备：采用500ml三角瓶，装入种子培养基15g，加水15ml，松散搅匀，经121℃灭菌30min后，自然冷却，接种后置28℃下培养4～5d，待培养基上长满褐黑色孢子后放入4℃冰箱中冷藏备用。使用时制成孢子悬浮液，在每只种瓶中，加入无菌水500～1000ml浸泡，捣碎搅拌均匀，用二层纱布过滤，滤液即孢子悬浮液用于生产接种。

③发酵产酶：发酵培养基(即生产原材料)采用麸皮76％、玉米芯18％、豆粕4.5％、无机盐1.5％，物料加水比1∶1.1～1.2，pH自然，经121℃高压蒸汽灭菌30～40min，冷却后按0.1～0.3％(w/w)接入孢子悬浮液，松散拌匀，置于发酵室内温度保持在28～30℃，相对湿度保持在80～90％条件下，培养50～54h出曲，期间随着菌体的消长变化和产酶量的增加，及时调控培养温度、湿度及通风量。

④后处理：发酵产物经在40～45℃下烘干，粉碎过80目筛，加入载体，混合后包装，制成NSP酶制剂。

实施例1：饲用NSP酶制剂的制备

①产酶菌种：黑曲霉菌株AS-34。

斜面菌种制备：采用查氏培养基，蔗糖3％，NaNO₃ 0.3％，K₂HPO₄ 0.1％，KCl 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，FeSO₄·7H₂O 0.001％，琼脂2.0％，pH6.7。经121℃灭菌30min，从砂土管接种后，置于28℃下培养4d，待表面长满褐黑色孢子后置4℃冰箱中贮存备用。

三角瓶种子制备：采用500ml三角瓶，装入种子培养基15g，加水15ml，松散搅匀，经121℃灭菌30min后，自然冷却，接种后置28℃下培养5d，待培养基上长满褐黑色孢子后放入4℃冰箱中冷藏备用。使用时制成孢子悬浮液，在每只种瓶中，加入无菌水500ml浸泡，捣碎搅拌均匀，用二层纱布过滤，滤液即孢子悬浮液用于生产接种。

②小试发酵生产：在实验室采用小盘固体发酵法生产。

每个试验处理配制发酵培养料1000g，采用麸皮76％、玉米芯18％、豆粕4.5％、无机盐1.5％，物料加水比1∶1.1，pH自然，经121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却后分别按0.1％、0.2％、0.3％(w/w)的接种量接入孢子悬浮液，松散拌匀，装盘后置于28℃生化培养箱内，发酵过程中适当调控培养温度和湿度，培养50h出曲。发酵产物在40℃烘箱中干燥，用小型电动粉碎机粉碎得干酶制品。连续进行3批次小试，经检测，其中主酶——木聚糖酶活力平均为78.3万u/g，还含有果胶酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶等多种NSP酶。

实施例2：饲用NSP酶制剂的制备

①供试菌种：黑曲霉菌株AS-34。

斜面菌种制备：采用查氏培养基，蔗糖3％，NaNO₃ 0.3％，K₂HPO₄ 0.1％，KCl 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，FeSO₄·7H₂O 0.001％，琼脂2.0％，pH6.7。经121℃灭菌30min，从砂土管接种后，置于28℃下培养5d，待表面长满褐黑色孢子后置4℃冰箱中贮存备用。

三角瓶种子制备：采用500ml三角瓶，装入种子培养基15g，加水15ml，松散搅匀，经121℃灭菌30min后，自然冷却，接种后置28℃下培养4d，待培养基上长满褐黑色孢子后放入4℃冰箱中冷藏备用。使用时制成孢子悬浮液，在每只种瓶中，加入无菌水1000ml浸泡，捣碎搅拌均匀，用二层纱布过滤，滤液即孢子悬浮液用于生产接种。

②中试发酵生产：在工厂采用大盘固体发酵法生产。

按每间曲房投料200Kg计，生产原材料由麸皮76％、玉米芯18％、豆粕4.5％、无机盐1.5％混合组成，物料加水比1∶1.2，pH自然，经121℃高压蒸汽灭菌40min，冷却后按0.2％(w/w)接入孢子悬浮液，松散拌匀。分装后置于曲房内，分别在温度28℃、30℃和相对湿度80％、90％条件下，培养52h出曲，期间随着菌体的消长变化和产酶量的增加，及时调控培养温度、湿度及通风量。发酵产物在40℃烘房中经低温气流干燥，80目粉碎，混合后得干酶制品。连续进行4批发酵产酶试验，经检测，其中主酶——木聚糖酶活力平均为76.6万u/g，还含有果胶酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶等多种NSP酶。

实施例3：饲用NSP酶制剂的制备

①生产菌种：黑曲霉菌株AS-34。

斜面菌种制备：采用查氏培养基，蔗糖3％，NaNO₃ 0.3％，K₂HPO₄ 0.1％，KCl 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，FeSO₄·7H₂O 0.001％，琼脂2.0％，pH6.7。经121℃灭菌30min，从砂土管接种后，置于28℃下培养5d，待表面长满褐黑色孢子后置4℃冰箱中贮存备用。

三角瓶种子制备：采用500ml三角瓶，装入种子培养基15g，加水15ml，松散搅匀，经121℃灭菌30min后，自然冷却，接种后置28℃下培养5d，待培养基上长满褐黑色孢子后放入4℃冰箱中冷藏备用。使用时制成孢子悬浮液，在每只种瓶中，加入无菌水1000ml浸泡，捣碎搅拌均匀，用二层纱布过滤，滤液即孢子悬浮液用于生产接种。

②工厂化发酵生产：在酶制剂厂采用改进的固体发酵法生产。

每批投料800Kg，生产原材料采用麸皮76％、玉米芯18％、豆粕4.5％、无机盐1.5％麸皮、物料加水比1∶1.2，pH自然，经高压蒸煮锅121℃灭菌40min，冷却后按0.25％(w/w)的接种量用接种机接入孢子悬浮液，松散拌匀，把物料送入特制的固体发酵装置中，于温度29℃，相对湿度85％条件下，培养54h出曲。期间随着菌体的消长变化和产酶量的增加，及时调控培养温度、湿度及通风量。发酵产物采用45℃以下沸腾干燥，经80目粉碎，在饲料混和机中混合均匀，得干酶制品。连续进行3批次生产性发酵试验，经检测，其中主酶——木聚糖酶活力平均为80.4万u/g，还含有果胶酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶等多种NSP酶。

Claims (4)

1.一种黑曲霉菌株(Aspergillus niger v.Tiegh.)，其特征在于菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCCNO.1578。

2.根据权利要求书1所述的一种黑曲霉菌株，其特征在于，菌落在查氏培养基上生长迅速，25℃7天直径40～50毫米；质地丝绒状或稍带絮状；分生孢子结构大量，褐黑色，无渗出液；菌落反面略带黄色。分生孢子头球形至辐射形，直径150～450微米；分生孢子梗发生于基质，孢梗茎1000～3000×12～20微米，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近球形，直径40～70微米，全部表面可育；产孢结构双层，梗基10～20×4.5～7.0微米，瓶梗6～10×2.5～3.5微米，分生孢子球形或近球形，直径3～4.5微米，褐色，壁粗糙。

3.一种NSP酶的制备方法，其特征在于以麸皮、玉米芯为主要原料制备NSP酶的步骤为：

①斜面菌种制备：斜面培养基采用查氏培养基，121℃灭菌30min，从砂土管中接种黑曲霉菌株(Aspergillus niger v.Tiegh.)，置于28℃下培养4～5d，待表面长满褐黑色孢子后置4℃冰箱中贮存备用；

②三角瓶种子制备：采用500ml三角瓶，装入种子培养基15g，加水15ml，松散搅匀，经121℃灭菌30min后，自然冷却，接种后置28℃下培养4～5d，待培养基上长满褐黑色孢子后放入4℃冰箱中冷藏备用。使用时制成孢子悬浮液，在每只种瓶中，加入无菌水500～1000ml浸泡，捣碎搅拌均匀，用二层纱布过滤，滤液即孢子悬浮液用于生产接种；

③发酵产酶：发酵培养基由麸皮76％、玉米芯18％、豆粕4.5％、无机盐1.5％混合组成，物料加水比1∶1.1～1.2，pH自然，经121℃高压蒸汽灭菌30～40min，冷却后按0.1～0.3％(w/w)接入孢子悬浮液，松散拌匀，置于发酵室内温度保持在28～30℃，相对湿度保持在80～90％条件下，培养50～54h出曲，期间随着菌体的消长变化和产酶量的增加，及时调控培养温度、湿度及通风量；

④后处理：发酵产物经在40～45℃下烘干，粉碎过80目筛，加入载体，混合后包装。

4.根据权利要求书3所述的一种NSP酶的制备方法，其特征在于所述的黑曲霉菌株(Aspergillus niger v.Tiegh.)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC NO.1578。

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