CN113980817B - 一种分枝横梗霉及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的一种分枝横梗霉(Lichtheimia ramosa)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.22463，所述分枝横梗霉具有较高的酸性蛋白酶、纤维素酶、β‑甘露聚糖酶和β‑葡聚糖酶活性，在棕榈粕生物发酵过程中不需要额外添加相关酶，即可降解棕榈粕中的甘露聚糖，改变棕榈粕的粗蛋白、粗脂肪和粗纤维的含量，对棕榈粕的品质改良具有优良的利用价值。

Description

一种分枝横梗霉及其用途
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种分枝横梗霉(Lichtheimia ramosa)及包含其的复合微生物菌剂、制备方法、用途。
背景技术
近年来，随着抗生素全面禁止在饲料中的应用及饲料原料短缺和价格暴涨，使得饲料行业发展面临着一系列的挑战。棕榈粕作为棕榈油工业的副产品，含有13％－20％的纤维，其中58-78％的纤维是不溶性甘露聚糖，适口性差，难以消化。此外，棕榈粕原料容易受霉菌毒素污染，目前主要防治方法为化学防治和生物防治，其中化学防治最直接有效，但长期的应用易引起药害和病原菌的抗药性，甚至污染环境，微生物源生物制剂作为新型无危害的防治策略，被逐渐开发和应用。同时微生物的发酵能够让棕榈粕的理化性质发生变化，提高其营养价值，如抗营养成分(如植酸盐)少、增加适口性，能够提高动物的消化率(低粗纤维和/或多糖含量)和抑制病原体、霉菌等。因此，发酵棕榈粕越来越多地被饲料行业和畜禽养殖企业所关注，实现这一过程很大程度上取决于所使用的发酵菌种和酶制剂的选择和配伍，以及生产工艺。
如中国专利申请号为202011292693.8的专利公开了一种利用酶和微生物制剂厌氧发酵棕榈粕的方法，固态发酵能够为有机废弃物增值，但是该专利文献中使用的酶制剂包括甘露聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶及木聚糖酶，为养殖户增加了额外的使用成本。
中国专利申请号为20190509110.3的专利公开了一种利用酶解方式将棕榈粕中的甘露聚糖酶解提取分离制备甘露寡糖、再进一步酶解制备饲用多肽，最后将残留的纤维类固形物通过进一步发酵制备成饲用膳食纤维，提升了棕榈粕的营养价值。但是该专利在进行酶解的过程中需要控温 50-60℃℃，调整pH4-5，酶解反应12-24h，离心，且没有表明3种配比的复合酶在酶解反应中具体与棕榈粕的使用比例。
中国专利申请号为201911408582.6的专利公开了一种营养发酵棕榈粕及其制备方法，该专利通过165℃高温处理10min后，通过接菌，在30-45℃下发酵。该专利文献中棕榈粕经过发酵后中性洗涤纤维降解率仅≥20％。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于一种分枝横梗霉(Lichtheimia ramosa)及包含其的复合微生物菌剂、制备方法、用途，所述分枝横梗霉 (Lichtheimia ramosa)能够高产复合酶，降解棕榈粕中的甘露聚糖，改变棕榈粕的粗蛋白、粗脂肪和粗纤维的含量，对棕榈粕的品质改良具有优良的利用价值。
为此，本发明提供了如下的技术方案：
一种分枝横梗霉(Lichtheimia ramosa)，该菌株从粉碎树枝污泥堆肥样品中筛选得到，经18S rDNA/ITS分析鉴定为分枝横梗霉(Lichtheimia ramosa)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.22463。所述的分枝横梗霉的生理生化特征为：马铃薯葡萄糖培养基 (PDA)培养基上菌落生长初期为白色，后期浅黄色，菌落质地絮状。在 pH3.0-12.0均能生长，最适pH4.5，在10-37℃条件下均能较好生长，最适合生长温度25-30℃，繁殖速度快。
一种复合微生物菌剂，包括所述的分枝横梗霉(Lichtheimia ramosa)。
可选的，还包括葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)和/或植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
可选的，所述葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)，从利用粉碎树枝污泥堆肥的样品中分离，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.22799；所述的葡萄牙棒孢酵母生理生化特征为：马铃薯葡萄糖培养基(PDA)培养基上生长良好，在10-38℃条件下均能较好生长，最适合温度25-30℃，在pH3.5-9.0均能生长，最适pH4.5。
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，从利用粉碎树枝污泥堆肥的样品中分离，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.15024。所述的植物乳杆菌生理生化特征为：MRS培养基上生长良好，生长温度10-55℃，pH3.0-7.0均能生长，最适生长温度30-35℃。
可选的，所述复合微生物菌剂为液态时，所述分枝横梗霉的液态培养物、葡萄牙棒孢酵母的液态培养物和植物乳杆菌的液态培养物的体积比为 (30-50)：(10-30)：(0-50)；
分枝横梗霉的液态培养物中分枝横梗霉总活菌数为1×106孢子/毫升 -9×106孢子/毫升，优选的为2×106孢子/毫升；
葡萄牙棒孢酵母的液态培养物中葡萄牙棒酵母的总活菌数为 4×109-2×1010个/毫升；
植物乳杆菌的液态培养物中植物乳杆菌的总活菌数为6×109-4×1010个/毫升。
可选的，所述复合微生物菌剂中的菌落总数为≥109CFU/mL。
可选的，所述复合微生物菌剂为固态时，为液态的复合微生物菌剂经发酵制备得到。
可选的，固态复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
1)固态发酵培养基配制：按木薯渣40-50重量份，棕榈粕140-150重量份，豆粕20-30重量份，麸皮100-120重量份，糖蜜5-10重量份，水100-120 重量份，混匀，121℃灭菌20-30min，冷却备用；可选的，按木薯渣40重量份，棕榈粕140重量份，豆粕20重量份，麸皮100重量份，糖蜜4重量份，水100重量份，混匀，121℃灭菌20min，冷却备用；
2)固态培养：按10-20wt％(可选的为10wt％)接种量接入液态的复合微生物菌剂至上述灭菌的固态发酵培养基中，混匀后移至带有透气阀的袋子中放入30-35℃(可选的30℃)恒温箱中培养35-72h，每12-15h(可选的 12h)将袋子整理一次，将发酵产生的气体轻轻按压出来，继续发酵，至 pH5-5.5(可选的pH5)。
3)干燥及粉碎：将上述发酵完成的固体培养物置于45℃-50℃(45℃) 烘箱中烘制含水率低于12％，用粉碎机粉碎、过80-100目筛(100目筛) 后，制备成固体粉末状菌剂，置于干燥、阴凉处保藏，其中，菌剂样品中的活菌数达8×109-4×1010个/g。
一种复合微生物菌剂的制备方法，按照配方选取相应的菌株进行发酵。
可选的，包括：
分枝横梗霉的液态培养物的制备方法：将分枝横梗霉菌种接种于PDA 培养基，在温度25-30℃，pH4.5-7，转速150-180rpm条件下培养48-72 小时(可选的，转速180rpm条件下培养48小时)，制备而成；或
葡萄牙棒孢酵母的液态培养物的制备方法：将葡萄牙棒孢酵母菌种接种于PDA培养基，在温度25-30℃，pH6-7，转速120-150rpm条件下培养18-24小时(可选的，pH6，转速120rpm条件下培养24小时)，制备而成；或
植物乳杆菌的液态培养物的制备方法：将植物乳杆菌菌种接种于发酵培养基，在温度30-35℃，pH6-7，转速100-120rpm条件下培养18-24小时(可选的，pH6，转速115rpm条件下培养24小时)，制备而成。
可选的，所述PDA培养基为：每1000mL由马铃薯浸粉10.0-15.0g，葡萄糖20.0-25.0g和水；可选的，每1000mL由马铃薯浸粉10.0g，葡萄糖20.0g和水组成。
可选的，所述发酵培养基为每1000mL由海藻酸钠3.0-5.0g，葡萄糖 15.0-20.0g，磷酸氢二钾0.5-1.0g，硫酸镁0.2-0.39g，酵母粉5.0-10.0 g和水组成，可选的，每1000mL由海藻酸钠5.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.39g，酵母粉10g和水组成。
所述的分枝横梗霉(Lichtheimia ramosa)所述的复合微生物菌剂或所述的方法制备得到的复合微生物菌剂具有如下任一项的用途：
(1)制备酸性蛋白酶、纤维素酶、β－甘露聚糖酶和/或β－葡聚糖酶中的用途；
(2)降解甘露聚糖的用途；
(3)发酵棕榈粕和/或木薯渣的用途或发酵包含棕榈粕和/或木薯渣的动物饲料的用途；
(4)降解中性洗涤纤维、粗脂肪、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素、半纤维素和/或纤维素的用途，可选的，降解棕榈粕中中性洗涤纤维、粗脂肪、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素、半纤维素和/或纤维素的用途。
一种棕榈粕的发酵方法，包括使用所述的分枝横梗霉(Lichtheimia ramosa)、所述的复合微生物菌剂或所述的方法制备得到的复合微生物菌剂；
可选的，包括：取棕榈粕100-200重量份，糖蜜1-5重量份，复合微生物菌剂10-50体积份，和水100-150重量份，混合均匀，然后30℃-35℃恒温发酵10-15天，pH5-5.5，发酵后活菌总数达5×108-3×109个/g，发酵完成。
可选的，包括：取棕榈粕150重量份，糖蜜2重量份，复合微生物菌剂30体积份，和水130重量份，混合均匀，然后30℃-35℃恒温发酵10-15 天，pH5-5.5，发酵后活菌总数达5×108-3×109个/g，发酵完成。
重量份与体积份的比值关系为g/ml。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的一种分枝横梗霉(Lichtheimia ramosa)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.22463，所述分枝横梗霉具有较高的酸性蛋白酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶活性，在棕榈粕生物发酵过程中不需要额外添加相关酶，即可降解棕榈粕中的甘露聚糖，改变棕榈粕的粗蛋白、粗脂肪和粗纤维的含量，对棕榈粕的品质改良具有优良的利用价值。
2.本发明提供的一种复合微生物菌剂，包括所述的分枝横梗霉 (Lichtheimiaramosa)、葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，本发明利用分枝横梗霉产多种酶及葡萄牙棒孢酵母增香特性，乳酸菌和酵母混合培养产生的长链不饱和脂肪酸酯等代谢产物抑制霉菌生长和霉菌毒素生物合成的特性，同时利用葡萄牙棒酵母和植物乳杆菌互补机制，促进棕榈粕中中性洗涤纤维、粗脂肪、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素、半纤维素和纤维素的降解，综合降解棕榈粕中的甘露聚糖，改变棕榈粕的粗蛋白、粗脂肪和粗纤维的含量，抑制黄曲霉菌毒素效果等，对棕榈粕的品质改良具有高利用价值。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
本发明中的分枝横梗霉(Lichtheimia ramosa)，该菌株从粉碎树枝污泥堆肥的样品中筛选得到，经18S rDNA/ITS分析鉴定为分枝横梗霉 (Lichtheimia ramosa)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.22463，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期为2021年06月29日。所述的分枝横梗霉的生理生化特征为：马铃薯葡萄糖培养基(PDA)培养基上菌落生长初期为白色，后期浅黄色，菌落质地絮状。在pH3.0-12.0均能生长，最适pH4.5，在10-37℃条件下均能较好生长，最适合生长温度 25-30℃，繁殖速度快。
葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)，从利用粉碎树枝污泥堆肥的样品中分离，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为 CGMCC No.22799，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期为2021年06月29日；所述的葡萄牙棒孢酵母生理生化特征为：马铃薯葡萄糖培养基(PDA)培养基上生长良好，在10-38℃条件下均能较好生长，最适合温度25-30℃，在pH3.5-9.0 均能生长，最适pH4.5。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，从利用粉碎树枝污泥堆肥的样品中分离，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为 CGMCC No.15024，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期为2017年12月07日。所述的植物乳杆菌生理生化特征为：MRS培养基上生长良好，生长温度10-55℃， pH3.0-7.0均能生长，最适生长温度30-35℃
实施例1
本实施例提供了复合微生物菌剂的制备方法如下：
(1)制备分枝横梗霉液态培养物
将分枝横梗霉(Lichtheimia ramosa)(保藏编号为CGMCC No.22463) 菌种接种于PDA培养基，在温度25-30℃，pH4.5-7，转速180rpm条件下培养48小时，制备而成。其中PDA培养基为：每1000mL由马铃薯浸粉 10.0g，葡萄糖20.0g和水组成。
(2)制备葡萄牙棒孢酵母液态培养物
将葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)(保藏编号为CGMCC No.22799)菌种接种于PDA培养基，在温度25-30℃，pH6，转速120rpm 条件下培养24小时，制备而成。其中PDA培养基为：每1000mL由马铃薯浸粉10.0g，葡萄糖20.0g和水组成。
(3)制备植物乳杆菌液态培养物
将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(保藏编号为CGMCC No.15024)菌种接种于发酵培养基，在温度30-35℃，pH6，转速115rpm 条件下培养24小时，制备而成。其中发酵培养基为：每1000mL由海藻酸钠5.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.39g，酵母粉10g 和自来水组成。
(4)制备复合微生物菌剂
根据发酵原料将分枝横梗霉液态培养物、葡萄牙棒孢酵母液态培养物和植物乳杆菌液态培养物按照(30-50)：(10-30)：(0-50)体积比进行复配组合后即制备完成，在本实施例中选择比例为50：10：5。
上述，分枝横梗霉的液态培养物中分枝横梗霉总活菌数为(1-9)×106孢子/毫升；
葡萄牙棒孢酵母的液态培养物中葡萄牙棒酵母的总活菌数为 4×109-2×1010个/毫升；
植物乳杆菌的液态培养物中植物乳杆菌的总活菌数为6×109-4×1010个/毫升；
所述复合微生物菌剂中的菌落总数为≥109CFU/mL。
实施例2
本实施例提供了复合微生物菌剂的制备方法如下：
(1)制备分枝横梗霉液态培养物
将分枝横梗霉(Lichtheimia ramosa)(保藏编号为CGMCC No.22463) 菌种接种于PDA培养基，在温度25-30℃，pH4.5-7，转速150rpm条件下培养72小时，制备而成。其中PDA培养基为：每1000mL由马铃薯浸粉 15.0g，葡萄糖25.0g和水组成。
(2)制备葡萄牙棒孢酵母液态培养物
将葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)(保藏编号为CGMCC No.22799)菌种接种于PDA培养基，在温度25-30℃，pH6，转速150rpm 条件下培养18小时，制备而成。其中PDA培养基为：每1000mL由马铃薯浸粉15.0g，葡萄糖25.0g和水组成。
(3)制备植物乳杆菌液态培养物
将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(保藏编号为CGMCC No.15024)菌种接种于发酵培养基，在温度30-35℃，pH6，转速100rpm 条件下培养18小时，制备而成。其中发酵培养基为：每1000mL由海藻酸钠3.0g，葡萄糖15.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.2g，酵母粉5g 和自来水组成。
(4)制备复合微生物菌剂
根据发酵原料将分枝横梗霉液态培养物、葡萄牙棒孢酵母液态培养物和植物乳杆菌液态培养物按照(30-50)：(10-30)：(0-50)体积比进行复配组合后即制备完成，在本实施例中选择比例为30：30：0。
上述，分枝横梗霉的液态培养物中分枝横梗霉总活菌数为(1-9)×106孢子/毫升；
葡萄牙棒孢酵母的液态培养物中葡萄牙棒酵母的总活菌数为 4×109-2×1010个/毫升；
植物乳杆菌的液态培养物中植物乳杆菌的总活菌数为6×109-4×1010个/毫升；
所述复合微生物菌剂中的菌落总数为≥109CFU/mL。
实施例3
本实施例提供了复合微生物菌剂的制备方法如下：
(1)制备分枝横梗霉液态培养物
将分枝横梗霉(Lichtheimia ramosa)(保藏编号为CGMCC No.22463) 菌种接种于PDA培养基，在温度25-30℃，pH4.5-7，转速160rpm条件下培养56小时，制备而成。其中PDA培养基为：每1000mL由马铃薯浸粉 13.0g，葡萄糖23.0g和水组成。
(2)制备葡萄牙棒孢酵母液态培养物
将葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)(保藏编号为CGMCC No.22799)菌种接种于PDA培养基，在温度25-30℃，pH6，转速130rpm 条件下培养22小时，制备而成。其中PDA培养基为：每1000mL由马铃薯浸粉13.0g，葡萄糖23.0g和水组成。
(3)制备植物乳杆菌液态培养物
将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(保藏编号为CGMCC No.15024)菌种接种于发酵培养基，在温度30-35℃，pH6，转速100rpm 条件下培养21小时，制备而成。其中发酵培养基为：每1000mL由海藻酸钠4.0g，葡萄糖18.0g，磷酸氢二钾0.8g，硫酸镁0.25g，酵母粉8g 和自来水组成。
(4)制备复合微生物菌剂
根据发酵原料将分枝横梗霉液态培养物、葡萄牙棒孢酵母液态培养物和植物乳杆菌液态培养物按照(30-50)：(10-30)：(0-50)体积比进行复配组合后即制备完成，在本实施例中选择比例为40：20：25。
上述，分枝横梗霉的液态培养物中分枝横梗霉总活菌数为(1-9)×106孢子/毫升；
葡萄牙棒孢酵母的液态培养物中葡萄牙棒酵母的总活菌数为 4×109-2×1010个/毫升；
植物乳杆菌的液态培养物中植物乳杆菌的总活菌数为6×109-4×1010个/毫升；
所述复合微生物菌剂中的菌落总数为≥109CFU/mL。
实施例4
本实施例提供了固态复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
1)固态发酵培养基配制：按木薯渣40-50g，棕榈粕140-150g，豆粕20-30g，麸皮100-120g，糖蜜5-10g，水100-120g，在本实施例中按木薯渣40g，棕榈粕140g，豆粕20g，麸皮100g，糖蜜4g，水100g，混匀，121℃灭菌20min，冷却备用；
2)固态培养：按10-20wt％(在本实施例中10wt％)接种量接入实施例1 中的液态的复合微生物菌剂至上述灭菌的固态发酵培养基中，混匀后移至带有透气阀的袋子中放入30-35℃(在本实施例中30℃)恒温箱中培养 35-72h，每12-15h(在本实施例中12h)将袋子整理一次，将发酵产生的气体轻轻按压出来，继续发酵，至pH5-5.5(在本实施例中pH5)。
3)干燥及粉碎：将上述发酵完成的固体培养物置于45℃-50℃(在本实施例中45℃)烘箱中烘制含水率低于12％，用粉碎机粉碎、过80-100目筛(在本实施例中100目筛)后，制备成固体粉末状菌剂，置于干燥、阴凉处保藏，其中，菌剂样品中的活菌数达8×109-4×1010个/g。
实施例5
本实施例提供了一种棕榈粕的发酵方法，包括如下步骤：
取棕榈粕100-200g，糖蜜1-5g，复合微生物菌剂10-50ml，和水100-150g，在本实施例中选择取棕榈粕100g，糖蜜5g，实施例2制备的复合微生物菌剂15ml，和水130g，混合均匀，然后30℃-35℃恒温发酵10-15 天，pH5-5.5，发酵后活菌总数达5×108-3×109个/g，发酵完成。
实验例1分枝横梗霉菌株所产纤维素酶活性检测
将实施例1中所得的分枝横梗霉孢子悬浮液以1.0×106个/ml接种浓度，按照菌液与培养基体积比2％的接种量，各自接种于pH3.0、pH4.5、pH6.0、 pH9.0，含100ml PDA液体培养基的250ml锥形瓶中，于30℃、150rpm恒温摇床下培养6d，5000rpm 4℃离心5min，取上清液即为不同pH条件下的粗酶液。
纤维素酶活性检测依照《微生物纤维素酶ELISA检测试剂盒》方法检测。
检测原理：试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被纤维素酶抗体的包被微孔中，依次加入样品、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化呈最终的黄色。颜色的深浅和样品中的纤维素酶呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，计算样品活性。检测结果如下，在pH3.0、pH4.5、pH6.0、pH9.0，30℃培养6d，分枝横梗霉菌株纤维素酶活力，分别为129.8839U/mL、187.7479U/mL、 226.1509U/mL、221.7736U/mL。
实验例2分枝横梗霉菌株所产甘露聚糖酶活性检测
在饲料工业，甘露聚糖酶具有消除抗营养因子β－D－甘露聚糖的作用，促进畜禽生长，提高饲料利用率。
本实施例中，将实施例1中所得的分枝横梗霉孢子悬浮液以1.0×106个/ml接种浓度，按照菌液与培养基体积比2％的接种量，各自接种于pH3.0、 pH4.5、pH6.0、pH9.0，含100mlPDA液体培养基的250ml锥形瓶中，于30℃、 150rpm恒温摇床下培养6d，5000rpm 4℃离心5min，取上清液即为不同pH 条件下的粗酶液。
甘露聚糖酶活性检测依照《微生物甘露聚糖酶ELISA检测试剂盒》方法检测。
检测原理：试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被甘露聚糖酶抗体的包被微孔中，依次加入样品、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化呈最终的黄色。颜色的深浅和样品中的甘露聚糖酶呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，计算样品活性。检测结果如下，在pH3.0、pH4.5、pH6.0、pH9.0，30℃培养 6d，分枝横梗霉菌株甘露聚糖酶活力，分别为311.8605U/L、247.4420U /L、258.6047U/L、251.5116U/L，由此可以看出，分枝横梗霉的甘露聚糖酶的最适反应pH可以由强酸性(pH3)到碱性(pH9)，据文献报道，真菌甘露聚糖酶作用范围一般偏酸，最适反应pH为4.0-5.5，因此与大部分真菌来源的甘露聚糖相比，分枝横梗霉的甘露聚糖酶作用pH范围更为宽泛。
实验例3分枝横梗霉菌株所产酸性蛋白酶活性检测
将实施例1中所得的分枝横梗霉孢子悬浮液以1.0×106个/ml接种浓度，按照菌液与培养基体积比2％的接种量，各自接种于pH3.0、pH4.5、pH6.0、 pH9.0，含100mlPDA液体培养基的250ml锥形瓶中，于30℃、150rpm恒温摇床下培养6d，5000rpm4℃离心5min，取上清液即为不同pH条件下的粗酶液。
酸性蛋白酶活性检测依照《微生物酸性蛋白酶ELISA检测试剂盒》方法检测。以30℃条件下每毫克蛋白每分钟催化水解产生1umol酪氨酸为一个酶活单位，检测结果，分别在pH3.0、pH4.5、pH6.0、pH9.0，在30℃培养6d，分枝横梗霉菌株酸性蛋白酶活力，分别为0.0820U/g、0.0692U/ g、0.0423U/g、0.1009U/g。
实验例4分枝横梗霉所产β-1，3葡聚糖酶活性检测
β-1，3葡聚糖酶是一类广泛存在于微生物、植物乃至动物体内的大分子多糖，具有能增强免疫调节，促进肠道益生菌增殖等，是一种良好的生物效应调节剂，在畜禽生产的饲料中添加，能够增加畜禽的采食量，显著提高畜禽消化道食糜的黏度，提高饲料的转化率，促进动物生长，同时，能够减少肠道内的有害微生物，降低畜禽肠道疾病的发病率，具有极高的应用价值。
本实施例中，将实施例1中所得的分枝横梗霉孢子悬浮液以1.0×106个/ml接种浓度，按照菌液与培养基体积比2％的接种量，各自接种于pH3.0、 pH4.5、pH6.0、pH9.0，含100mlPDA液体培养基的250ml锥形瓶中，于30℃、 150rpm恒温摇床下培养6d，5000rpm 4℃离心5min，取上清液即为不同pH 条件下的粗酶液。
β-1，3葡聚糖酶活性检测依照《β－1，3葡聚糖酶活性检测试剂盒》方法检测。以每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位，检测结果，在pH3.0、pH4.5、pH6.0、pH9.0，30℃培养6d，分枝横梗霉β－1，3葡聚糖酶活力，分别为0.8179U/mL、0.1262U/mL、0.2288U/mL、0.2066U /mL，具有良好的工业化应用前景。
实验例5复合微生物菌剂发酵棕榈粕
设置2组发酵实验，空白组发酵，和添加复合微生物菌剂的实验组发酵。发酵料配方如下：称取棕榈粕300g、糖蜜4g后进行原料的灭菌 (121℃,30min)。原料灭菌完成后，分为两组(每组棕榈粕150g、糖蜜2g)，其中空白组加入160mL水，实验组加入130mL水和30mL复合微生物菌剂(为实施例1中制备的液态复合微生物菌剂比例为分枝横梗霉液态培养物、葡萄牙棒孢酵母液态培养物和植物乳杆菌液态培养物按照体积比50：10：5 混合。按分组将水和菌剂充分与原料翻拌均匀。然后装入自封袋中，自封袋口留小缝隙后叠好放入35℃培养箱发酵，持续观察。发酵完成后观察空白组与实验组的粗脂肪和粗纤维含量的变化。
实验结果表明，实验组棕榈粕发酵气味香气物质丰富，发酵产物呈酸性，pH由最初的pH7变为pH5，发酵后棕榈粕活菌总数达5×108-3×109个 /g(见表一)。空白组有刺鼻气味。实验组棕榈粕经过菌剂发酵，粗纤维和粗脂肪的含量显著下降，其中粗脂肪降解率为48.17％，中性洗涤纤维的降解率为35.29％，酸性洗涤纤维降解率为32.60％，酸性洗涤木质素降低率为 35.77％，半纤维素降解率为39.19％，纤维素降解率为32.11％(见表二)。
表一 棕榈粕发酵后菌落计数结果
Figure RE-GDA0003435882610000161
表二 空白组和实验组部分指标对比
Figure RE-GDA0003435882610000162
Figure RE-GDA0003435882610000171
注：检测方法如下：
粗蛋白质：GB/T 6432-2018饲料中粗蛋白的测定；
粗脂肪：GB 5009.6-2016食品安全国家标准食品中脂肪的测定；
中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素、半纤维素、纤维素：范氏纤维素分析法。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (12)

1. 一种分枝横梗霉（Lichtheimia ramosa），保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.22463。
2.一种复合微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的分枝横梗霉（Lichtheimia ramosa）。
3.根据权利要求2所述的复合微生物菌剂，其特征在于，还包括葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）和/或植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
4.根据权利要求3所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.22799；
所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为 CGMCC No.15024。
5.根据权利要求3或4所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂为液态时，所述分枝横梗霉的液态培养物、葡萄牙棒孢酵母的液态培养物和植物乳杆菌的液态培养物的体积比为（30-50）：（10-30）：（0-50）；
分枝横梗霉的液态培养物中分枝横梗霉总活菌数为（1-9）×106孢子/毫升；
葡萄牙棒孢酵母的液态培养物中葡萄牙棒酵母的总活菌数为4×109-2×1010个/毫升；
植物乳杆菌的液态培养物中植物乳杆菌的总活菌数为6×109-4×1010个/毫升。
6.根据权利要求3或4所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂为固态时，为液态的复合微生物菌剂经发酵制备得到。
7.一种如权利要求2-6任一项所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，
按照配方选取相应的菌株进行发酵。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，包括：
分枝横梗霉的液态培养物的制备方法：将分枝横梗霉菌种接种于PDA培养基，在温度25-30℃，pH4.5-7，转速150-180 rpm条件下培养48-72小时，制备而成；或
葡萄牙棒孢酵母的液态培养物的制备方法：将葡萄牙棒孢酵母菌种接种于PDA培养基，在温度25-30℃，pH6-7，转速120-150 rpm条件下培养18-24小时，制备而成；或
植物乳杆菌的液态培养物的制备方法：将植物乳杆菌菌种接种于发酵培养基，在温度30-35℃，pH6-7，转速100-120rpm条件下培养18-24小时，制备而成。
9.权利要求1所述的分枝横梗霉（Lichtheimia ramosa）、权利要求2-6任一项所述的复合微生物菌剂或权利要求7-8任一项所述的方法制备得到的复合微生物菌剂具有如下任一项的用途：
（1）制备酸性蛋白酶、纤维素酶、β－甘露聚糖酶和/或 β－葡聚糖酶中的用途；
（2）降解甘露聚糖、葡聚糖或酸性蛋白的用途；
（3）发酵棕榈粕和/或木薯渣的用途或发酵包含棕榈粕和/或木薯渣的动物饲料的用途；
（4）降解中性洗涤纤维、粗脂肪、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素、半纤维素和/或纤维素的用途。
10.一种棕榈粕的发酵方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的分枝横梗霉（Lichtheimia ramosa）、权利要求2-6任一项所述的复合微生物菌剂或权利要求7-8任一项所述的方法制备得到的复合微生物菌剂。
11.根据权利要求10所述的棕榈粕的发酵方法，其特征在于，
包括：取棕榈粕100-200重量份，糖蜜1-5重量份，复合微生物菌剂10-50体积份，和水100-150重量份，混合均匀，然后30℃-35℃恒温发酵10-15天，pH5-5.5，发酵后活菌总数达5×108-3×109个/g，发酵完成；
重量份与体积份的比值关系为g/ml。
12.根据权利要求11所述的棕榈粕的发酵方法，其特征在于，
包括：取棕榈粕150重量份，糖蜜2重量份，复合微生物菌剂30体积份，和水130重量份，混合均匀，然后30℃-35℃恒温发酵10-15天，pH5-5.5，发酵后活菌总数达5×108-3×109个/g，发酵完成；
重量份与体积份的比值关系为g/ml。
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