CN107267282A - 固定化复合磷脂酶酶法脱胶工艺 - Google Patents

固定化复合磷脂酶酶法脱胶工艺 Download PDF

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郭宏涛
王剑英
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Abstract

本发明公开了一种固定化复合磷脂酶酶法脱胶工艺，包括以下步骤：A、制备固定化复合磷脂酶；B、将所述固定化复合磷脂酶用于油脂脱胶；所述复合磷脂酶由磷脂酶A1、磷脂酶C、脂肪酶和蛋白酶组成。本发明的固定化复合磷脂酶酶法脱胶工艺，先将用于脱胶的磷脂酶A1、磷脂酶C、脂肪酶和蛋白酶同时固定在同一大孔树脂上，然后将同时固定有磷脂酶A1、磷脂酶C、脂肪酶和蛋白酶的大孔树脂用于油脂脱胶，磷脂酶A1、磷脂酶C、脂肪酶和蛋白酶发挥协同作用对油脂脱胶，不仅可以重复运用该固定化复合磷脂酶脱胶，而且油脂中没有酶残留，脱胶效率高，得油率高。

Description

固定化复合磷脂酶酶法脱胶工艺
技术领域
本发明涉及油脂酶法脱胶技术领域，特别是涉及一种运用固定化复合磷脂酶对油脂进行酶法脱胶的工艺。
背景技术
经压榨、浸出等方法从油料种子中提取的毛油含有蛋白质、糖类、磷脂、色素、金属离子、游离脂肪酸等杂质，通常不能直接食用，需要经过一系列油脂精炼工序将这些不利于油脂品质的杂质去除，才能得到符合国家要求的食用油。毛油中所含的磷脂、蛋白质和粘液质等统称为胶质，毛油中的胶质以磷脂为主，故脱胶也称为脱磷。要满足物理精炼的要求，必须在脱胶过程中将油脂的磷含量控制在10mg/kg以内，否则磷脂进入脱臭塔后在高温下易结焦，附着在设备内壁，并且产生黑色物，影响精炼油的色泽。传统的脱胶方法主要包括水化脱胶和酸法脱胶：水化脱胶只能除去毛油中的水化磷脂（HP），脱胶后油中磷含量约为 80~200 mg/kg，难以满足物理精炼的要求；酸法脱胶主要是利用酸化作用将毛油中的非水化磷脂（NHP）转化为HP，再通过加入适量水将磷脂去除。根据毛油品种和品质的差异，经过酸法脱胶之后，油中磷含量约为15~80 mg/kg，也难以满足物理精炼的要求。
近年来，酶法脱胶技术因其在提高油脂工业的经济、环保性能等方面具有巨大的应用价值而受到广泛关注。磷脂酶是一类广泛存在于动物、植物和微生物中，能够特异性水解甘油磷脂的酶，根据磷脂酶与磷脂作用位点的不同，可将磷脂酶分为磷脂酶A1（PLA1）、磷脂酶A2（PLA2）、磷脂酶B（PLB）、磷脂酶C（PLC）和磷脂酶D（PLD）。目前，在植物油脱胶过程中，主要使用的是PLA1、PLA2、PLB和PLC。PLA1和PLA2能特异性水解磷脂的Sn-1或Sn-2位酯键，生成相应的溶血磷脂；PLB能将Sn-1和Sn-2位的酯键都水解，生成相应的甘油酰磷脂，溶血磷脂和甘油酰磷脂都具有很强的亲水性，通过水合作用可以方便地除去。PLC能特异性水解磷脂Sn-3位上甘油磷酸酯键，生成相应的甘二酯（DAG）和磷酯酸，而DAG作为中性油在后续的精炼过程中不会被去除，因而能有效提高油脂精炼后的得率。
研究表明，虽然单一的磷脂酶对毛油中磷脂具有很好的脱除效果，但反应用时较长，因而限制了其在油脂脱胶工业中的应用。为此，人们研究利用多种磷脂酶对毛油进行脱胶。例如，中国专利CN105038978公开了将PLA和PLC一起用于酶反应以去除油中存在的磷脂的方法，发现当两种酶一起使用时，酶反应的动力学远快于任何一种酶单独使用时的情况，即使未对至少一种酶的反应条件进行优化时，该反应仍比预期更为迅速，脱胶反应可在小于一小时的时间内进行，且脱胶反应时间可快达约30 分钟。虽然PLA和PLC共同脱胶可大大提高脱胶速度，但PLA和PLC会残留在油中，且无法重复利用。在酶法脱胶中，为能重复利用磷脂酶，中国专利CN105132147公开了一种用固定化PLC对大豆油脱胶的方法，同时解决了PLC的一次性使用和产物分离纯化难等问题，但还是运用单一的磷脂酶，脱胶时间长；中国专利CN104560387公开了一种固定化PLA1和固定化PLC 联合应用对大豆毛油进行脱，使用6个批次后，固定化酶相对活力仍保持在80％左右，但该方法中PLA1和PLC不是同时固定在同一载体上，实际上还是固定化PLA1和固定化PLC先后单独起脱胶作用，并没有发挥PLA1和PLC的协同作用；中国专利CN102776066公开了一种用固定化PLA2 脱胶的方法，该固定化酶重复使用7 次后活力可以保持54%以上，同样的是运用单一的磷脂酶，脱胶时间长。
因此，为提高毛油的酶法脱胶效率，减少酶在油中的残留，如何重复运用复合酶脱胶，是本领域研究的一个新方向。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种固定化复合磷脂酶酶法脱胶工艺，先将用于脱胶的PLA1、PLC、脂肪酶和蛋白酶同时固定在同一大孔树脂上，然后将同时固定有PLA1、PLC、脂肪酶和蛋白酶的大孔树脂用于油脂脱胶，PLA1、PLC、脂肪酶和蛋白酶发挥协同作用对油脂脱胶，不仅可以重复运用复合磷脂酶脱胶，而且油脂中没有酶残留，脱胶效率高，得油率高。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种固定化复合磷脂酶酶法脱胶工艺，包括以下步骤：
A、制备固定化复合磷脂酶；
B、将所述固定化复合磷脂酶用于油脂脱胶；
所述复合磷脂酶由磷脂酶A1、磷脂酶C、脂肪酶和蛋白酶组成。
进一步地，所述A步骤中，将磷脂酶A1、磷脂酶C、脂肪酶和蛋白酶固定化在同一大孔树脂上。
更进一步地，在步骤A中，将所述磷脂酶A1、磷脂酶C、脂肪酶和蛋白酶按质量比为4~5:4~5:1:1称取后固定化在同一大孔树脂上。
本发明将PLA1、PLC、脂肪酶和蛋白酶同时固定在同一大孔树脂上，实现重复运用固定化复合磷脂酶对油脂脱胶，脱胶效率高，得油率高，脱胶油中没有酶残留。其中，PLA1能特异性水解磷脂的Sn-1位酯键，生成相应的溶血磷脂；脂肪酶能将Sn-1和Sn-3位的酯键都水解，生成相应的甘油酰磷脂；溶血磷脂和甘油酰磷脂都具有很强的亲水性，通过水合作用可以方便地除去；PLC能特异性水解磷脂Sn-3位上甘油磷酸酯键，生成相应的甘二酯（DAG）和磷酯酸，而DAG作为中性油在后续的精炼过程中不会被去除，因而能有效提高油脂精炼后的得率；蛋白酶可以分解油脂中的蛋白杂质，尤其可以分解油脂中的磷脂-蛋白质复合体中的蛋白质，促进PLA1、PLC和脂肪酶分解磷脂，提高脱胶效果。本发明的固定化复合磷脂酶重复使用5次后活力可以保持70%以上。
进一步地，所述大孔树脂为D101、AB-8、D3520中的一种。
进一步地，在所述B步骤之前，还包括对所述油脂进行预处理的步骤。
更进一步上，所述预处理步骤为：在分离混合器中将油脂搅拌加热至65~70℃，添加0.2g的质量分数为50％的丙酸溶液后剪切1分钟，再搅拌1 小时；再将混合物冷却至30~35℃后添加0.2毫升4 mol/L氢氧化钠溶液，剪切混合10 秒。所述丙酸钙为丙酸杆菌发酵制得，本发明的实施例中，丙酸钙的制得参见中国专利CN103667373所公开的方法。
进一步地，所述B步骤中，添加所述油脂重量的1%~2.5%的固定化复合磷酯酶对油脂脱胶。
进一步地，所述B步骤中，在pH为5.0~7.0、温度为32~36℃下所述固定化复合磷脂酶对油脂脱胶0.5~1小时。
进一步地，在所述B步骤之后，还包括分离固定化复合磷脂酶、脱胶油和胶质沉淀物的步骤。
进一步，所述脂肪酶为Sn-1，3专一性脂肪酶。Sn-1，3专一性脂肪酶能特定地水解磷脂的Sn-1或Sn-3位酯键，生成相应的溶血磷脂，促进NHP转化为HP。
根据本发明进行处理的油包括但不限于：卡诺拉油、蓖麻油、椰子油、玉米油、棉子油、榛子油、大麻籽油、亚麻籽油、芒果仁油、白芒花油、牛蹄油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈软脂、花生油、菜籽油、米糠油、红花油、山茶花油、大豆油和葵花籽油。
本发明所处理的油既可以是粗制油，也可以是水脱胶油。
本发明的有益效果是：针对现有技术缺乏重复运用复合酶脱胶的方法、脱胶后酶残留于油脂中的情况，本发明的固定化复合磷脂酶酶法脱胶工艺，先将用于脱胶的PLA1、PLC、脂肪酶和蛋白酶同时固定在大孔树脂上，然后将同时固定有PLA1、PLC、脂肪酶和蛋白酶的大孔树脂用于油脂脱胶，PLA1、PLC、脂肪酶和蛋白酶发挥协同作用对油脂脱胶，不仅可以重复运用固定化复合磷脂酶脱胶，而且食用油中没有酶残留，脱胶效率高，得油率高。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述：
实施例1
用大孔树脂D101制备固定化复合磷脂酶。
一、大孔树脂的预处理
吸附用大孔树脂D101的预处理方法为：
（1）质量分数为10%的NaCl溶液浸泡4 h，水洗抽滤；
（2）体积分数为95%的乙醇浸泡4 h，水洗抽滤；
（3）质量分数为5%的HCl溶液浸泡4h，水洗抽滤，至中性；
（4）质量分数为2%的NaOH溶液浸泡4h，水洗抽滤，至中性；
（5）去离子水浸泡于4℃冰箱中保存备用。
二、原酶液的准备
分别称取PLA1、PLC、L03脂肪酶和蛋白酶8 g 、8 g 、2 g和2 g，分别用pH9.0的100mL甘氨酸-氢氧化纳缓冲溶液浸提1h，2000 r/min离心30min除去杂质，取上清液（即为原酶液）于4℃冰箱短时间保存待用。
三、复合磷脂酶的固定化
移取24mL原酶液（PLA1、PLC、L03脂肪酶和蛋白酶的原酶液各6mL），加入6.0g预处理好的大孔树脂D101，采用物理吸附法对PLA1、PLC、L03脂肪酶和蛋白酶组成的复合磷脂酶进行固定化，加入20.0mL的质量分数为0.1 %的CaCl2溶液，于30℃、pH 6.5、200r/min水浴摇床中振荡3h，真空抽滤除去酶液，再用pH9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液抽滤洗涤数次，冷冻干燥得固定化复合磷脂酶。
干燥后测得固定化复合磷脂酶的蛋白吸附率为79%，干燥后测得的固定化复合磷脂酶的酶活分别是：PLA1的酶活为6710 U/g，PLC的酶活为10165 U/g，脂肪酶的酶活为55425 U/g，蛋白酶的酶活25420 U/g。
实施例2
用大孔树脂AB-8制备固定化复合磷脂酶。
一、大孔树脂的预处理
吸附用大孔树脂AB-8的预处理方法为：
（1）质量分数为10%的NaCl溶液浸泡4 h，水洗抽滤；
（2）体积分数为95%的乙醇浸泡4 h，水洗抽滤；
（3）质量分数为5%的HCl溶液浸泡4h，水洗抽滤，至中性；
（4）质量分数为2%的NaOH溶液浸泡4h，水洗抽滤，至中性；
（5）去离子水浸泡于4℃冰箱中保存备用。
二、原酶液的准备
分别称取PLA1、PLC、L03脂肪酶和蛋白酶8 g 、8 g 、2 g和2 g，分别用pH9.0的100mL甘氨酸-氢氧化纳缓冲溶液浸提1h，2000 r/min离心30min除去杂质，取上清液（即为原酶液）于4℃冰箱短时间保存待用。
三、复合磷脂酶的固定化
移取20mL原酶液（PLA1、PLC、L03脂肪酶和蛋白酶的原酶液各5mL），加入6.0g预处理好的大孔树脂AB-8，采用物理吸附法对PLA1、PLC、L03脂肪酶和蛋白酶组成的复合磷脂酶进行固定化，加入16.0 mL的质量分数为0.1 %的CaCl2溶液，于30℃、pH 7.0、200r/min水浴摇床中振荡3h，真空抽滤除去酶液，再用pH9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液抽滤洗涤数次，冷冻干燥得固定化复合磷脂酶。
干燥后测得固定化复合磷脂酶的蛋白吸附率为81%，固定化复合磷脂酶的酶活分别是： PLA1的酶活为6520 U/g，PLC的酶活为9165 U/g，脂肪酶的酶活为51240 U/g，蛋白酶的酶活22310 U/g。
实施例3
用大孔树脂D3520制备固定化复合磷脂酶。
一、大孔树脂的预处理
吸附用大孔树脂D3520的预处理方法为：
（1）质量分数为10%的NaCl溶液浸泡4 h，水洗抽滤；
（2）体积分数为95%的乙醇浸泡4 h，水洗抽滤；
（3）质量分数为5%的HCl溶液浸泡4h，水洗抽滤，至中性；
（4）质量分数为2%的NaOH溶液浸泡4h，水洗抽滤，至中性；
（5）去离子水浸泡于4℃冰箱中保存备用。
二、原酶液的准备
分别称取PLA1、PLC、L03脂肪酶和蛋白酶10 g 、10 g 、2 g和2 g，分别用pH9.0的100mL甘氨酸-氢氧化纳缓冲溶液浸提1h，2000 r/min离心30min除去杂质，取上清液（即为原酶液）于4℃冰箱短时间保存待用。
三、复合磷脂酶的固定化
移取30mL原酶液（PLA1、PLC、L03脂肪酶和蛋白酶的原酶液各7.5mL），加入6.0g预处理好的大孔树脂D3520，采用物理吸附法对PLA1、PLC、L03脂肪酶和蛋白酶组成的复合磷脂酶进行固定化，加入25.0 mL的质量分数为0.1 %的CaCl2溶液，于30℃、pH 7.0、200r/min水浴摇床中振荡3h，真空抽滤除去酶液，再用pH9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液抽滤洗涤数次，冷冻干燥得固定化复合磷脂酶。
干燥后测得固定化复合磷脂酶的蛋白吸附率为85%，固定化复合磷脂酶的酶活分别是：PLA1的酶活为8520 U/g，PLC的酶活为12165 U/g，脂肪酶的酶活为59440 U/g，蛋白酶的酶活为28650 U/g。
实施例1~3中，大孔树脂为D101、AB-8购自安徽三星树脂科技有限公司，D3520购自南开大学化工厂；PLA1、PLC、L03脂肪酶和蛋白酶可以从市场上购买，例如从深圳市绿微康生物工程有限公司购买。固定化复合磷脂酶的蛋白吸附率的测定参考 Bradford 法（考马斯亮蓝染色法）。PLA1的磷脂酶活力的测定依据 Yang 等人的方法（Degumming of vegetable oil by a new microbial lipase. Food Technol. Biotechnol. 2006, 44, 101-104.微生物脂肪酶对植物油的脱胶.食品技术.生物技术.）；PLC酶活的测定依据高林等报道的方法（高林. 磷脂酶 C 高产菌株的筛选，鉴定和培养条件的优化研究[D]: [硕士学位论文].合肥:安徽农业大学，2007.）；脂肪酶的酶活测定方法参照中国专利CN103525797中公开的脂肪酶活力测定方法；蛋白酶的酶活测定方法参照国家标准GB/T 23527-2009。
实施例4
（1）在分离混合器中将200g的粗制大豆油在正常搅拌下加热至65~70℃，添加0.2g的质量分数为50％的丙酸溶液，将该混合物剪切1分钟，然后在正常速度下搅拌1 小时；
（2）将混合物冷却至30~35℃，然后添加0.2毫升4mol/L氢氧化钠溶液，将混合物剪切混合10 秒；
（3）添加6.5g去离子水、实施例1制备的固定化复合磷脂酶2g，调节pH为 5.0，将全部混合物剪切1分钟，在约36℃的温度下将油混合物以正常速度搅拌45分钟；
（4）将油混合物中的固定化复合磷脂酶去除后离心该油混合物，收集分离的油，获得3.5ppm 残留磷的脱胶油。
实施例5
（1）在分离混合器中将200g的粗制大豆油在正常搅拌下加热至65~70℃，添加0.2g的质量分数为50％的丙酸溶液，将该混合物剪切1分钟，然后在正常速度下搅拌1 小时；
（2）将混合物冷却至30~35℃，然后添加0.2毫升4mol/L氢氧化钠溶液，将混合物剪切混合10 秒；
（3）添加7.0g去离子水、实施例2制备的固定化复合磷脂酶3.5g，调节pH为6.0，将全部混合物剪切1分钟，在约32℃的温度下将油混合物以正常速度搅拌30分钟；
（4）将油混合物中的固定化复合磷脂酶去除后离心该油混合物，收集分离的油，获得4.7ppm 残留磷的脱胶油。
实施例6
（1）在分离混合器中将200g的粗制大豆油在正常搅拌下加热至65~70℃，添加0.2g的质量分数为50％的丙酸溶液，将该混合物剪切1分钟，然后在正常速度下搅拌1 小时；
（2）将混合物冷却至40~45℃，然后添加0.2毫升4mol/L氢氧化钠溶液，将混合物剪切混合10 秒；
（3）添加8.0g去离子水、实施例3制备的固定化复合磷脂酶5g，调节pH为7.0，将全部混合物剪切1分钟，在约34℃的温度下将油混合物以正常速度搅拌60分钟；
（4）将油混合物中的固定化复合磷脂酶去除后离心该油混合物，收集分离的油，获得2.6ppm 残留磷的脱胶油。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.一种固定化复合磷脂酶酶法脱胶工艺，其特征在于，包括以下步骤：
A、制备固定化复合磷脂酶；
B、将所述固定化复合磷脂酶用于油脂脱胶；
所述复合磷脂酶由磷脂酶A1、磷脂酶C、脂肪酶和蛋白酶组成。
2.根据权利要求1所述的固定化复合磷脂酶酶法脱胶工艺，其特征在于，所述A步骤中，将磷脂酶A1、磷脂酶C、脂肪酶和蛋白酶固定化在同一大孔树脂上。
3.根据权利要求2所述的固定化复合磷脂酶酶法脱胶工艺，其特征在于，在步骤A中，将所述磷脂酶A1、磷脂酶C、脂肪酶和蛋白酶按质量比为4~5:4~5:1:1称取后固定化在同一大孔树脂上。
4.根据权利要求3所述的固定化复合磷脂酶酶法脱胶工艺，其特征在于，所述大孔树脂为D101、AB-8、D3520中的一种。
5.根据权利要求1所述的固定化复合磷脂酶酶法脱胶工艺，其特征在于，在所述B步骤之前，还包括对所述油脂进行预处理的步骤。
6.根据权利要求5所述的固定化复合磷脂酶酶法脱胶工艺，其特征在于，所述预处理步骤为：在分离混合器中将油脂搅拌加热至65~70℃，添加0.2g的质量分数为50％的丙酸溶液后剪切1分钟，再搅拌1 小时；再将混合物冷却至30~35℃后添加0.2毫升4mol/L氢氧化钠溶液，剪切混合10 秒。
7.根据权利要求1所述的固定化复合磷脂酶酶法脱胶工艺，其特征在于，所述B步骤中，添加所述油脂重量的1%~2.5%的固定化复合磷酯酶对油脂脱胶。
8.根据权利要求7所述的固定化复合磷脂酶酶法脱胶工艺，其特征在于，所述B步骤中，在pH为5.0~7.0、温度为32~36℃下所述固定化复合磷脂酶对油脂脱胶0.5~1小时。
9.根据权要求1所述的固定化复合磷脂酶酶法脱胶工艺，其特征在于，在所述B步骤之后，还包括分离固定化复合磷脂酶、脱胶油和胶质沉淀物的步骤。
10.根据权利要求1~9任一项所述的固定化复合磷脂酶酶法脱胶工艺，其特征在于，所述脂肪酶为Sn-1，3专一性脂肪酶。
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