CN102533913A - 一种采用共固定化双酶水解鱼鳞胶原蛋白制备抗氧化活性肽的方法 - Google Patents

一种采用共固定化双酶水解鱼鳞胶原蛋白制备抗氧化活性肽的方法 Download PDF

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Abstract

一种采用共固定化双酶水解鱼鳞胶原蛋白制备抗氧化活性肽的方法，包括以下步骤：（1）交联法共固定化双酶；（2）鱼鳞预处理；（3）共固定化酶定向水解鱼鳞蛋白；（4）脱色脱腥；（5）鱼鳞多肽超滤分离；（6）真空浓缩；（7）冷冻干燥。本发明所制备的抗氧化活性肽可作为天然抗氧化剂用于食品抗氧化保鲜中，且无毒副作用，安全性高；所用方法酶解效率高，酶可以多次利用，酶解产物易于纯化；为淡水鱼废弃物的有效利用提供了一条新途径；产品可用于药品、食品和化妆品。

Description

一种采用共固定化双酶水解鱼鳞胶原蛋白制备抗氧化活性肽的方法
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，涉及制备生物活性肽的方法。
背景技术
我国鱼类资源十分丰富，淡水鱼养殖量居世界第一位。目前，淡水鱼加工主要局限在鱼体肌肉加工方面，如鱼糜，鱼丸等。受传统观念和加工技术的制约，在鱼肉加工过程中产生的大量下脚料如鱼鳞、内脏等很少被利用，而是当作垃圾扔弃。据估计，我国每年废弃的鱼鳞达30万吨，不仅浪费了资源，还污染了环境。
鱼鳞含有丰富的蛋白质，占鱼鳞总质量的50%-70%，主要是胶原蛋白，其次为角蛋白和其它的粘蛋白等。研究发现鱼鳞中胶原蛋白含有丰富的甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸，具有低过敏性、分子结构较脆弱、酶解较容易等特点，其水解产物中含有生物活性肽。而胶原蛋白肽具有分子量低、易吸收、低黏度等特性，同时具有免疫调节、抗血栓、降血压、降胆固醇以及抗氧化等生理功能。因此，胶原蛋白肽已被广泛应用于医药、食品、日用化工等领域。
目前，由胶原蛋白制备生物活性肽的方法有化学法和酶解法，由于酶解法具有作用温和、高效、易控、安全等优势，在蛋白质深加工和活性成分提取领域被广泛应用。特别是利用酶固定化技术可增大酶对温度和pH的适应范围，提高了酶的使用效率，且在反应结束后，很容易将酶与反应液分开，简化了产物的分离纯化。近年来，随着酶工程技术的发展，在单酶固定化技术的基础上又建立了多酶共固定化技术，多酶共固定化体系拥有固定化酶的高稳定性和连续操作能力，又具有多酶的协同作用，该技术已展现了十分广阔的应用前景。根据查阅已有文献，国内尚未有关利用多酶共固定化技术加工水产品的相关报道。本发明以草鱼鱼鳞为原料，将其进行浸酸脱钙、浸碱脱杂蛋白处理，然后经共固定化双酶酶解，再通过超滤和真空浓缩等分离纯化，最后经冷冻干燥得到抗氧化活性多肽。本发明对于提高淡水鱼加工的附加值，实现鱼鳞废弃物的综合利用具有重要意义。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种共固定化双酶酶解鱼鳞中胶原蛋白制备抗氧化活性肽方法。
本发明为解决其技术问题所采取的技术方案如下。
（1）交联法共固定化双酶。
以木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、Flavourzyme风味蛋白酶、Alcalase碱性蛋白酶中任意两种酶组成复合蛋白酶，按照活力比为1:1-1:3将两种酶溶于磷酸盐缓冲液中配制成质量浓度为1.0-5.0%蛋白酶溶液，取配制的蛋白酶溶液加入pH4-10、质量浓度为2.0-6.0%的海藻酸钠溶液中，蛋白酶溶液与海藻酸钠溶液体积比为1:1-1:5。待充分搅拌均匀后，加入质量浓度为0.5-5.0%的氯化钙（CaCl2）溶液中，移入4℃冰箱硬化2-6 h，过滤洗涤。然后加入体积分数为0.1-3%戊二醛溶液中，振荡0.5 h，于4-25℃静置交联4-6 h，用磷酸盐缓冲液将残余戊二醛和未固定化的酶洗去，用冷风吹干表面水分得共固定化双酶。
共固定化酶活力的测定。
在具塞试管中加入固定化酶0.3 g，3 mL酶激活剂 (0.1mol/ L，pH7.2的磷酸缓冲液中含20 mmol/L半胱氨酸和1 mmol/ LEDTA，现配)，37℃水浴中预热10 min，加入酪蛋白溶液10 mL，搅匀后在37℃水浴中精确反应10 min，然后加入10 mL三氯醋酸溶液，剧烈摇动后，37℃水浴放置30 min，在275 nm处测定吸光度。
（2）鱼鳞预处理。
将新鲜鱼鳞浸泡洗净其表面粘附物，烘干，然后粉碎并过筛网。称取鱼鳞粉放入酸溶液中匀速搅拌脱钙，然后用碱浸泡处理，脱除附着在鱼鳞表面的鱼银、色素物质和可溶性杂蛋白。
（3）共固定化酶定向水解鱼鳞蛋白。
控制温度为40-60℃，pH在6-10，按鱼鳞质量比1-5%加入固定化双酶酶解，酶解时间为2-6 h，期间不断搅拌并加入酸液或碱液使反应体系维持在初始值pH值，酶水解反应结束后升温至100℃，保持10 min灭活，快速冷却反应液，然后采用离心机转速5000 r/min，离心分离15-20 min，得到上层的酶解液。
（4）脱色脱腥
采用粉状活性炭吸附脱色脱腥，在酶解液中加入质量比为0.5-3%食品级粉状活性炭，将水解液置于50℃的水浴锅内处理60 min，然后经5000 r/min离心获得上清液（即鱼鳞蛋白酶解液）。
（5）鱼鳞多肽超滤分离。
脱色脱腥后的鱼鳞蛋白酶解液经10 kDa超滤膜截流分离，保留浓缩液；将滤液再经3kDa超滤膜截流分离，保留浓缩液和滤液。超滤过程中组件最大工作压力不超过0.15 MPa，依次得到分子量为10 kDa以上、3-10 kDa、3 kDa以下的鱼鳞多肽溶液。
（6）真空浓缩。
将超滤得到的各部分溶液在真空度为0.08 MPa、温度为50℃进行真空浓缩，浓缩至固形物在60%以上，分别测定各浓缩物抗氧化活性。
多肽抗氧化活性评价。
本发明多肽抗氧化活性通过邻苯三酚氧化法测定超氧阴离子自由基清除率进行评价。
（7）冷冻干燥。
高抗氧化活性组分在-40 ℃预冻12 h，冷阱温度为-65℃，真空度100 Pa，加热板温度50 ℃，真空冷冻干燥24 h，水分含量在5%以下，干燥后所得粉末即为鱼鳞蛋白抗氧化活性肽。
本发明的优点是：1、本发明所制备的抗氧化活性肽是鱼鳞蛋白经共固定化双酶酶解后产生的小分子肽，可作为天然抗氧化剂用于食品抗氧化保鲜中，且无毒副作用，安全性高；2、双酶共固定化体系拥有固定化酶的高稳定性和连续操作能力，又具有多酶的协同作用，因此其酶解效率高，酶可以多次利用，酶解产物易于纯化。3、本发明原料是鱼鳞蛋白，是淡水鱼加工的废弃物，本发明的技术转化为淡水鱼废弃物的有效利用提供了一条新途径； 4、本发明所得产品可用于药品、食品和化妆品加工中。
具体实施方式
本发明将通过以下具体实施例作进一步说明。
实施例1。
（1）按照活力比为1:1的比例将木瓜蛋白酶和Alcalase碱性蛋白酶溶于磷酸盐缓冲液中，配制质量浓度为1.0%蛋白酶溶液；同时，配制pH7.0质量浓度为2.0%海藻酸钠溶液，取配制的蛋白酶溶液加入海藻酸钠溶液中，蛋白酶溶液与海藻酸钠溶液体积比为1:1。待充分搅拌均匀后，加入质量浓度为0.5%的CaCl2溶液中，移入4℃冰箱硬化6 h，过滤洗涤。然后加入体积分数为0.1%戊二醛溶液中，振荡0.5 h，于25℃静置交联4 h，用磷酸盐缓冲液将残余戊二醛和未固定化的酶洗去，用冷风吹干表面水分得共固定化双酶。
（2）以新鲜草鱼鱼鳞为原料，通过浸泡洗净鱼鳞表面粘附物，40℃烘干，然后将洗净干燥后的鱼鳞粉碎成细粉，并过60目的筛网。称取500 g鱼鳞，放入4%盐酸溶液中匀速搅拌脱钙12 h后，弃去溶液，用水冲洗固形物。
将脱钙后的鱼鳞用3% Ca(OH)2溶液浸泡处理12 h，使胶原分子得以释放，同时脱除附着在鱼鳞表面的鱼银、色素物质和可溶性杂蛋白。
（3）按鱼鳞质量比为1.0%加入固定化双酶进行酶解，酶解温度为60℃，pH为7.0，期间不断搅拌并加入酸液或碱液以使反应体系pH值维持在7.0左右，酶解时间2 h后，升温至100℃，保持10 min灭活，采用离心机于5000 r/min，离心分离15-20 min，得到上层的酶解液。
（4）在酶解液中加入质量比为3%粉状活性炭，将水解液置于50℃的水浴锅内处理60 min，然后经5000 r/min离心获得清液。
（5）脱色脱腥后的鱼鳞蛋白酶解液经10 kDa超滤膜截流分离，保留浓缩液；将滤液再经3kDa超滤膜截流分离，保留浓缩液和滤液。超滤过程中组件最大工作压力不超过0.15 MPa，依次制备分子量为10 kDa以上、3-10 kDa、3 kDa以下的鱼鳞多肽溶液。
（6）真空浓缩。
将超滤得到的各部分溶液在真空度为0.08 MPa、温度为50℃进行真空浓缩，浓缩至固形物在60%以上，分别检测各浓缩物抗氧化活性。
（7）高抗氧化活性组分在-40 ℃预冻12 h，冷阱温度为-65℃，真空度100 Pa，加热板温度50 ℃，真空冷冻干燥24 h，水分含量在5%以下，干燥后所得粉末即为鱼鳞胶原蛋白抗氧化活性肽。
实施例2。
（1）按照活力比为1:2的比例将中性蛋白酶和Alcalase碱性蛋白酶溶于磷酸盐缓冲液中，配制质量浓度为3.0%蛋白酶溶液；同时，配制pH9.0质量浓度为4.0%海藻酸钠溶液，取配制的蛋白酶溶液加入海藻酸钠溶液中，蛋白酶溶液与海藻酸钠溶液体积比为1:3。待充分搅拌均匀后，加入质量浓度为2.5%的CaCl2溶液中，移入4℃冰箱硬化4 h，过滤洗涤。然后加入体积分数为1.5%戊二醛溶液中，振荡0.5 h，于15℃静置交联5 h，用磷酸盐缓冲液将残余戊二醛和未固定化的酶洗去，用冷风吹干表面水分得共固定化双酶。
（2）以新鲜草鱼鱼鳞为原料，通过浸泡洗净鱼鳞表面粘附物，40℃烘干，然后将洗净干燥后的鱼鳞粉碎成细粉，并过60目的筛网。称取500 g鱼鳞，放入4%盐酸溶液中匀速搅拌脱钙12 h后，弃去溶液，用水冲洗固形物。
将脱钙后的鱼鳞用3% Ca(OH)2溶液浸泡处理12 h，使胶原分子得以释放，同时脱除附着在鱼鳞表面的鱼银、色素物质和可溶性杂蛋白。
（3）按鱼鳞质量比为2.5%加入固定化双酶进行酶解，酶解温度为50℃，pH为9.0，期间不断搅拌并加入酸液或碱液以使反应体系pH值维持在9.0左右，酶解时间4 h后，升温至100℃，保持10 min灭活，采用离心机于5000 r/min，离心分离15-20 min，得到上层的酶解液。
（4）在酶解液中加入质量比为2%粉状活性炭，将水解液置于50℃的水浴锅内处理60 min，然后经5000 r/min离心获得清液。
（5）脱色脱腥后的鱼鳞蛋白酶解液经10 kDa超滤膜截流分离，保留浓缩液；将滤液再经3kDa超滤膜截流分离，保留浓缩液和滤液。超滤过程中组件最大工作压力不超过0.15 MPa，依次制备分子量为10 kDa以上、3-10 kDa、3 kDa以下的鱼鳞多肽溶液。
（6）真空浓缩。
将超滤得到的各部分溶液在真空度为0.08 MPa、温度为50℃进行真空浓缩，浓缩至固形物在60%以上，分别检测各浓缩物抗氧化活性。
（7）高抗氧化活性组分在-40 ℃预冻12 h，冷阱温度为-65℃，真空度100 Pa，加热板温度50 ℃，真空冷冻干燥24 h，水分含量在5%以下，干燥后所得粉末即为鱼鳞胶原蛋白抗氧化活性肽。
实施例3。
（1）按照活力比为1:3的比例将中性蛋白酶和木瓜蛋白酶溶于磷酸盐缓冲液中，配制质量浓度为5.0%蛋白酶溶液；同时，配制pH6.0质量浓度为6.0%海藻酸钠溶液，取配制的蛋白酶溶液加入海藻酸钠溶液中，蛋白酶溶液与海藻酸钠溶液体积比为1:5。待充分搅拌均匀后，加入质量浓度为5.0%的CaCl2溶液中，移入4℃冰箱硬化2 h，过滤洗涤。然后加入体积分数为3.0%戊二醛溶液中，振荡0.5 h，于4℃静置交联6 h，用磷酸盐缓冲液将残余戊二醛和未固定化的酶洗去，用冷风吹干表面水分得共固定化双酶。
（2）以新鲜草鱼鱼鳞为原料，通过浸泡洗净鱼鳞表面粘附物，40℃烘干，然后将洗净干燥后的鱼鳞粉碎成细粉，并过60目的筛网。称取500 g鱼鳞，放入4%盐酸溶液中匀速搅拌脱钙12 h后，弃去溶液，用水冲洗固形物。
将脱钙后的鱼鳞用3% Ca(OH)2溶液浸泡处理12 h，使胶原分子得以释放，同时脱除附着在鱼鳞表面的鱼银、色素物质和可溶性杂蛋白。
（3）按鱼鳞质量比为5.0%加入固定化双酶进行酶解，酶解温度为40℃，pH为6.0，期间不断搅拌并加入酸液或碱液以使反应体系pH值维持在6.0左右，酶解时间6 h后，升温至100℃，保持10 min灭活，采用离心机于5000 r/min，离心分离15-20 min，得到上层的酶解液。
（4）在酶解液中加入质量比为1%粉状活性炭，将水解液置于50℃的水浴锅内处理60 min，然后经5000 r/min离心获得清液。
（5）脱色脱腥后的鱼鳞蛋白酶解液经10 kDa超滤膜截流分离，保留浓缩液；将滤液再经3kDa超滤膜截流分离，保留浓缩液和滤液。超滤过程中组件最大工作压力不超过0.15 MPa，依次制备分子量为10 kDa以上、3-10 kDa、3 kDa以下的鱼鳞多肽溶液。
（6）真空浓缩。
将超滤得到的各部分溶液在真空度为0.08 MPa、温度为50℃进行真空浓缩，浓缩至固形物在60%以上，分别检测各浓缩物抗氧化活性。
（7）高抗氧化活性组分在-40 ℃预冻12 h，冷阱温度为-65℃，真空度100 Pa，加热板温度50 ℃，真空冷冻干燥24 h，水分含量在5%以下，干燥后所得粉末即为鱼鳞胶原蛋白抗氧化活性肽。
本发明多肽抗氧化活性采用超氧阴离子自由基清除率评价，通过邻苯三酚氧化法测定超氧阴离子自由基清除率。

Claims (1)

1.一种采用共固定化双酶水解鱼鳞胶原蛋白制备抗氧化活性肽的方法，其特征是按以下步骤：
（1）以木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、Flavourzyme风味蛋白酶、Alcalase碱性蛋白酶中任意两种酶组成复合蛋白酶，按照活力比为1:1-1:3将两种酶溶于磷酸盐缓冲液中配制成质量浓度为1.0-5.0%蛋白酶溶液，取配制的蛋白酶溶液加入pH4-10、质量浓度为2.0-6.0%的海藻酸钠溶液中，蛋白酶溶液与海藻酸钠溶液体积比为1:1-1:5；待充分搅拌均匀后，加入质量浓度为0.5-5.0%的氯化钙溶液中，移入4℃冰箱硬化2-6 h，过滤洗涤；然后加入体积分数为0.1-3%戊二醛溶液中，振荡0.5 h，于4-25℃静置交联4-6 h，用磷酸盐缓冲液将残余戊二醛和未固定化的酶洗去，用冷风吹干表面水分得共固定化双酶；
（2）将新鲜鱼鳞浸泡洗净、烘干、粉碎、筛网、脱钙，脱除鱼银、色素物质和可溶性杂蛋白；
（3）控制温度为40-60℃，pH在6-10，按鱼鳞重量比1-5%加入固定化双酶酶解，酶解时间为2-6 h，期间不断搅拌并加入酸液或碱液使反应体系维持在初始值pH值，酶水解反应结束后升温至100℃，保持10 min灭活，快速冷却反应液，然后采用离心机转速5000 r/min，离心分离15-20 min，得到上层的酶解液；
（4）在酶解液中加入质量比为0.5-3%食品级粉状活性炭，将水解液置于50℃的水浴锅内处理60 min，然后经5000 r/min离心获得上清液，即鱼鳞蛋白酶解液；
（5）鱼鳞蛋白酶解液经10 kDa超滤膜截流分离，保留浓缩液；将滤液再经3kDa超滤膜截流分离，保留浓缩液和滤液；超滤过程中组件最大工作压力不超过0.15 MPa，依次得到分子量为10 kDa以上、3-10 kDa、3 kDa以下的鱼鳞多肽溶液；
（6）真空浓缩；
（7）冷冻干燥。
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