CN104140992B - 一种鱼鳞ⅰ型胶原蛋白肽的规模化制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的规模化制备方法。其以海洋鱼类鱼鳞或淡水鱼类鱼鳞为原料，经碱、酸预处理除杂后，采用一步生物酶解技术直接将鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白定向酶解成分子量分布较为集中的Ⅰ型胶原蛋白肽，再利用连续离心分离协同膜分离技术在常温下对定向酶液分离、纯化和浓缩，得到纯度≥95%，分子量在1000道尔顿以下的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽溶液，最后利用喷雾干燥技术快速干燥成品。本发明方法流程整体简单可行，高效节能，生产周期短，适合大规模生产；本发明方法生产出来的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽产品的纯度高，质量好，其分子量低于1000道尔顿的肽含量达到97%以上。

Description

一种鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的规模化制备方法

技术领域

本发明涉及到一种分子量在1000道尔顿以下的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽（也称低聚肽）的规模化制备方法，属于生物提取技术领域。

背景技术

以前，胶原蛋白肽的制备生产原料主要来源于陆生动物的骨和皮。近年来，由于疯牛病、口蹄疫等传染性疾病的发生和流行，导致人们对来源于牲畜的胶原蛋白肽的安全性发生了怀疑，另外，在信仰伊斯兰教、回教的地区,来源于牲畜的胶原蛋白肽由于宗教的原因，其应用也会受到很大的限制，而在我国这么个渔业大国的水产品加工过程中，不可避免地会产生大量的废弃物——鱼鳞，造成环境污染和资源浪费。所以，综合考虑原料的安全性、成本和环境保护等多方面因素，水产品加工废弃物鱼鳞成为制备胶原蛋白肽的重要原料。

鱼鳞中主要的胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋白，所以定向酶解鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白所得到的胶原蛋白肽，即鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽。在化妆品方面，相关文献研究表明，构成人体皮肤真皮层的胶原蛋白主要分为两类：Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白；人体在生命过程中，皮肤胶原蛋白的含量和比例会发生明显改变；年轻时胶原蛋白含量较为丰富，婴儿及青年人的皮肤Ⅰ型胶原蛋白：Ⅲ型胶原蛋白约为7：3；随着年龄的增长，皮肤逐渐衰老，胶原蛋白的含量逐渐降低且两者比例逐渐倒置，胶原蛋白变粗，出现异常交联，结缔组织物理化学性质改变，皮肤出现皱纹。由此可见，Ⅰ型胶原蛋白是年轻皮肤维持皮肤张力的最主要物质，也是随年龄增长皮肤主要流失的一类胶原蛋白。来源于鱼鳞的I型胶原蛋白的鱼鳞I型胶原蛋白肽正是人体皮肤所急需的。另外，在食品、保健品方面，I型胶原蛋白肽不仅可以作为肉制品改良剂，人工肠衣和可食性蛋白膜等食品材料，还可以作为诸如补钙、减肥、降血脂、降血压等功能性保健品。

而分子量小于1000道尔顿的胶原蛋白肽是构成胶原蛋白的小分子片断， 它是由二肽(由两个氨基酸缩合而成的肽称为二肽)、三肽直至七肽组成的具有生物活性的小分子混合寡肽（氨基酸的平均分子量约为130）。所以，相对于其他较大分子量片段的I型胶原蛋白肽，来源于鱼鳞I型胶原蛋白的鱼鳞I型胶原蛋白肽具有更加显著的皮肤渗透性和更强的生物活性。

目前，制备生产鱼鳞胶原蛋白肽最主要的方法有酸法、碱法、酶法，以及多种方法结合使用。利用酸、碱水解法提取胶原蛋白肽，产品分子量分布广泛，均匀度差，为了制备分子量较小的胶原蛋白肽，在提取过程中必须消耗大量的酸和碱，并且提取产品成分非常复杂，后续纯化处理麻烦。除了酸、碱法外，还有酶解法可以提取胶原蛋白肽，它还可以根据所需各种不同的胶原蛋白肽产品的结构特点，选择恰当的蛋白酶和合适的酶解条件进行制备，产品的分子量分布较为集中，附加值高；另外，在制备过程中，只要注意在预处理时除去鱼鳞中大量的无机盐、脂肪等杂质，避免这些杂质影响酶的活度，就可实现在短时间内进行快速的定向酶解反应，获得较高的得率；同时酶解法避免了大量的酸和碱的消耗，更加安全环保，更能满足产业化放大和大规模生产的要求。所以，酶法提取是目前相当热门的一类蛋白肽制备方法。

发明内容

本发明瞄准当今的热点生物技术，提供一种方法简便、安全环保、低成本、高产率、产品纯度高、分子量绝大部分分布在1000道尔顿以下的鱼鳞I型胶原蛋白肽的规模化制备方法，实现水产品下脚料——鱼鳞的高值化利用。

为解决上述技术问题，本发明的技术解决方案是：

一种鱼鳞I型胶原蛋白肽的规模化制备方法，包括以下步骤：

（1）预处理

将鱼鳞投入反应釜中，加入鱼鳞重量2—10倍的碱溶液，搅拌1—12小时，除掉鱼鳞的脂肪和其他杂质，用水洗净，加入鱼鳞重量2—10倍的酸溶液，搅拌1—12小时，再用去离子水洗净，其中碱溶液的质量体积浓度为1—4%，酸溶液的质量体积浓度为3—8%；

（2）酶解提取

利用合适的蛋白酶定向酶解获得鱼鳞I型胶原蛋白肽。将经过预处理并洗净的鱼鳞置于反应釜中，加去离子水，加入浓碱液调节pH值6～8之间，加入鱼鳞投料重量1%～5%的蛋白酶，反应温度为45～65℃，反应2～8小时；酶解结束后升温至70～80℃，保温20～30分钟灭酶，得到鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解液。

（3）分离纯化

离心机分离协同膜分离方法技术纯化鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解液。鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解液高速离心，所得清液用相对分子质量为10kD～5kD的纳滤膜去除大分子杂质，再用相对分子质量为1kD～200DA的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，并浓缩得到纯度≥95%，分子量在1000道尔顿以下的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽溶液。

（4）快速干燥

利用喷雾干燥快速干燥蛋白肽溶液，得到鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽成品。

所述步骤（1）原料预处理所使用的鱼鳞可以是海洋鱼类鱼鳞或淡水鱼类鱼鳞。

所述步骤（1）预处理和所述步骤（2）加入浓碱液调节pH值所使用的碱为碳酸氢钠（钾）或氢氧化钠（钾）；酸为盐酸或硝酸。

所述步骤（2）中加水量为鱼鳞重量的10倍。

所述步骤（3）中所使用的蛋白酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶中的一种或两种组合。

所述步骤（3）中所使用的相对分子质量为10kD～5kD的纳滤膜流速为5～14立方米/小时，膜压力为0.552-0.931Mpa，温度为20～50℃；所使用的相对分子质量为1kD～200DA的纳滤膜流速为5～14立方米/小时，膜压力为0.483～2.758Mpa，温度为20～50℃。

所述步骤（3）中所使用的离心机为10000～15000rpm的连续流离心机。

所述步骤（4）中所使用的喷雾干燥的进风温度为120～180℃、出风温度为70～90℃。

所述预处理步骤前，先对鱼鳞进行清洗以除去颗粒杂质。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明选择主要含有Ⅰ型胶原蛋白的鱼鳞作为原料，保证了酶提的胶原蛋白肽是源自单一构型蛋白的Ⅰ型胶原蛋白肽。

2.本发明的制备方法完全使用生物酶定向酶解技术，一方面有效杜绝化学法中强酸、强碱和高热对产品结构造成破坏，保证了产品的稳定性，同时不产生任何有毒有害物质；另一方面，生物酶定向酶解技术还可以避免化学法所带来的环境污染和巨大的能源消耗，显著降低了生产成本。

3.本发明的规模化生产方法不仅保证了产品的高得率，而且高效、安全、环保。

4.本发明方法简便可行，即在预处理步骤之后，直接采用一步生物酶定向酶解技术将传统的提取和酶切两步合二为一，得到分子量分布较为集中的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽初提取液，再利用连续流离心分离协同膜分离技术在常温下对酶解液分离、纯化和浓缩，得到纯度≥95%，分子量在1000道尔顿以下的鱼鳞Ⅰ型纳米胶原蛋白肽溶液，最后利用喷雾干燥技术快速干燥获得成品。方法高效节能，生产周期短，适合大规模生产。

5.本发明方法生产出来的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白的纯度高，其分子量低于1000道尔顿的肽含量达到97%以上，由于产品的分子量小，人体容易吸收，且安全无毒副作用，不仅可以作为化妆品的功能原料，还可作为临床营养品、保健食品、运动食品以及蛋白营养补充剂直接食用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详述。

实施例1：

一种鱼鳞I型胶原蛋白肽的制备方法，步骤如下：

（1）预处理

将海洋鱼类鱼鳞或淡水鱼类鱼鳞投入反应釜中，加入鱼鳞重量10倍的碱溶液，搅拌1小时，用水洗净，加入鱼鳞重量10倍的酸溶液，搅拌2小时，再用去离子水洗净，其 中碱溶液的质量体积浓度为3%，酸溶液的质量体积浓度为5%；

（2）酶解提取

将经过预处理并洗净的鱼鳞置于反应釜中，加去离子水，加入浓碱液调节pH为6.5，加入鱼鳞投料重量2%的木瓜蛋白酶，反应温度为55℃，反应3小时；酶解结束后升温至70℃，保温20分钟灭酶，得到鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解液。

（3）分离纯化

鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解液用连续流离心机在14000rpm下高速离心，所得清液用相对分子质量为10kD的纳滤膜去除大分子杂质，流速为8立方米/小时，膜压力为0.931Mpa，温度为30℃；再用相对分子质量为200DA的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，流速为5立方米/小时，膜压力为2.758Mpa，温度为30℃，浓缩得到纯度=97%，分子量在1000道尔顿以下的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽溶液。

（4）快速干燥

喷雾干燥快速干燥蛋白肽溶液，设定进风温度为160℃，出风温度为90℃。得到鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽粉成品。

实施例2：

一种鱼鳞I型胶原蛋白肽的制备方法，步骤如下：

（1）预处理

将海洋鱼类鱼鳞或淡水鱼类鱼鳞先粉碎，再投入反应釜中，加入鱼鳞重量10倍的碱溶液，搅拌3小时，用水洗净，加入鱼鳞重量10倍的酸溶液，搅拌6小时，再用去离子水洗净，其中碱溶液的质量体积浓度为1%，酸溶液的质量体积浓度为4%；

（2）酶解提取

将经过预处理并洗净的鱼鳞置于反应釜中，加去离子水，加入浓碱液调节pH为7.0，加入鱼鳞投料重量3%的中性蛋白酶，反应温度为50℃，反应4小时；酶解结束后升温至75℃，保温20分钟灭酶，得到鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解液。

（3）分离纯化

鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解液用连续流离心机在14000rpm下高速离心，所得清液用相 对分子质量为5kD的纳滤膜去除大分子杂质，流速为6立方米/小时，膜压力为0.931Mpa，温度为35℃；再用相对分子质量为200DA的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，流速为5立方米/小时，膜压力为2.758Mpa，温度为30℃，浓缩得到纯度=96%，分子量在1000道尔顿以下的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽溶液。

（4）快速干燥

喷雾干燥快速干燥蛋白肽溶液，设定进风温度为150℃，出风温度为85℃。得到鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽成品。

实施例3：

一种鱼鳞I型胶原蛋白肽的制备方法，步骤如下：

（1）预处理

将海洋鱼类鱼鳞或淡水鱼类鱼鳞投入反应釜中，加入鱼鳞重量10倍的碱溶液，搅拌12小时，用水洗净，加入鱼鳞重量10倍的酸溶液，搅拌12小时，再用去离子水洗净，其中碱溶液的质量体积浓度为4%，酸溶液的质量体积浓度为6%；

（2）酶解提取

将经过预处理并洗净的鱼鳞置于反应釜中，加去离子水，加入浓碱液调节pH为6.5，加入鱼鳞投料重量2.5%的风味蛋白酶，反应温度为53℃，反应3小时；酶解结束后升温至75℃，保温20分钟灭酶，得到鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解液。

（3）分离纯化

鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解液用连续流离心机在14000rpm下高速离心，所得清液用相对分子质量为5kD的纳滤膜去除大分子杂质，流速为6立方米/小时，膜压力为0.931Mpa，温度为35℃；再用相对分子质量为500DA的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，流速为8立方米/小时，膜压力为2.5Mpa，温度为35℃，浓缩得到纯度=96%，分子量在1000道尔顿以下的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽溶液。

（4）快速干燥

喷雾干燥快速干燥蛋白肽溶液，设定进风温度为165℃，出风温度为88℃。得到鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽粉成品。

实施例4：

一种鱼鳞I型胶原蛋白肽的制备方法，步骤如下：

（1）预处理

将海洋鱼类鱼鳞或淡水鱼类鱼鳞先粉碎，再投入反应釜中，加入鱼鳞重量5倍的碱溶液，搅拌10小时，用水洗净，加入鱼鳞重量5倍的酸溶液，搅拌10小时，再用去离子水洗净，其中碱溶液的质量体积浓度为3%，酸溶液的质量体积浓度为5%；

（2）酶解提取

将经过预处理并洗净的鱼鳞置于反应釜中，加去离子水，加入浓碱液调节pH为8，加入鱼鳞投料重量3.5%的胰蛋白酶或糜蛋白酶，反应温度为50℃，反应4小时；酶解结束后升温至80℃，保温30分钟灭酶，得到鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解液。

（3）分离纯化

鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解液用连续流离心机在14000rpm下高速离心，所得清液用相对分子质量为10kD的纳滤膜去除大分子杂质，流速为8立方米/小时，膜压力为0.931Mpa，温度为25℃；再用相对分子质量为500DA的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，流速为5立方米/小时，膜压力为2.758Mpa，温度为40℃，浓缩得到纯度=95%，分子量在1000道尔顿以下的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽溶液。

（4）快速干燥

喷雾干燥快速干燥蛋白肽溶液，设定进风温度为165℃，出风温度为92℃。得到鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽成品。

Claims (8)

1.一种鱼鳞I型胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，为以下步骤：

(1)预处理

将鱼鳞投入反应釜中，加入鱼鳞重量2-10倍的碱溶液，搅拌1-12小时，除掉鱼鳞的脂肪和其他杂质，用水洗净，加入鱼鳞重量2-10倍的酸溶液，搅拌1-12小时，再用去离子水洗净，其中碱溶液的质量体积浓度为1-4％，酸溶液的质量体积浓度为3-8％；

(2)酶解提取

利用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶中的任意一种定向酶解鱼鳞I型胶原蛋白肽；将经过预处理并洗净的鱼鳞置于反应釜中，加去离子水，加入浓碱液调节pH值6～8之间，加入鱼鳞投料重量1％～5％的蛋白酶，反应温度为45～65℃，反应2～8小时；酶解结束后升温至70～80℃，保温20～30分钟灭酶，得到鱼鳞I型胶原蛋白肽酶解液；

(3)分离纯化

离心分离协同膜分离方法技术纯化鱼鳞I型胶原蛋白肽酶解液：鱼鳞I型胶原蛋白肽酶解液高速离心，所得清液用相对分子质量为10kD～5kD的纳滤膜去除大分子杂质，再用相对分子质量为1kD～200DA的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，并浓缩得到纯度≥95％、分子量在1000道尔顿以下的鱼鳞I型胶原蛋白肽溶液；

(4)快速干燥

利用喷雾干燥快速干燥蛋白肽溶液，得到鱼鳞I型胶原蛋白肽粉成品。

2.根据权利要求1所述鱼鳞I型胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)原料预处理所使用的鱼鳞为海洋鱼类鱼鳞或淡水鱼类鱼鳞。

3.根据权利要求1所述鱼鳞I型胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)预处理和所述步骤(2)加入浓碱液调节pH值所使用的碱为碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾；酸为盐酸或硝酸。

4.根据权利要求1所述鱼鳞I型胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中加水量为鱼鳞重量的10倍。

5.根据权利要求1所述鱼鳞I型胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中所使用的相对分子质量为10kD～5kD的纳滤膜流速为5～14立方米/小时，膜压力为0.552-0.931Mpa，温度为20～50℃；所使用的相对分子质量为1kD～200DA的纳滤膜流速为5～14立方米/小时，膜压力为0.483～2.758Mpa，温度为20～50℃。

6.根据权利要求1所述鱼鳞I型胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中所使用的离心机为10000～15000rpm的连续流离心机。

7.根据权利要求1所述鱼鳞I型胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中所使用的喷雾干燥的进风温度为120～180℃、出风温度为70～90℃。

8.根据权利要求1～7任一项所述鱼鳞I型胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述预处理步骤前，先对鱼鳞进行清洗以除去颗粒杂质。