CN106008701B - 高纯超螺旋结构ⅰ型胶原蛋白的快速制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的快速制备方法,方法包括选取主要含有Ⅰ型胶原蛋白的鱼鳞作为原料,经碱处理,酸处理,当提取酸溶性Ⅰ型胶原蛋白,预处理后的鱼鳞添加弱酸溶液作为提取剂,使用匀浆技术提取并伴随搅拌散热以维持提取所需的低温;当提取酶溶性Ⅰ型胶原蛋白,预处理后的鱼鳞添加弱酸溶液作为提取剂,使用匀浆技术提取,加入胃蛋白酶,并伴随搅拌散热以维持提取所需的低温,同时根据鱼鳞残渣的粒径设计不同的过滤工艺;然后将以上两种Ⅰ型胶原蛋白粗提液各自通过膜分离技术纯化,再用冷冻干燥,即得。本发明所制备的胶原蛋白产品,构型明确,三螺旋结构完整,通过SDS‑PAGE检测,为电泳纯度≥95%的Ⅰ型胶原蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及到具有三螺旋结构的高纯Ⅰ型胶原蛋白的快速制备工艺,包括具有三螺旋结构的酸溶性高纯Ⅰ型胶原蛋白的快速制备工艺,和具备三螺旋结构酶溶性高纯Ⅰ型胶原蛋白,即低抗原性高纯Ⅰ型胶原蛋白的快速制备工艺,属于生物提取技术领域。
背景技术
胶原蛋白是动物支持结构中最主要也是最重要的一类蛋白质,在人体的皮肤、血管、骨骼、软骨以及结缔组织中广泛分布。根据其在肽链序列、分子量、空间结构和功能活性的差异,胶原蛋白被分为29个亚型。它们都具有特殊的三螺旋结构,也称为超螺旋结构,即由三条左手螺旋α链通过右手螺旋的方式互相缠绕而成。同时,胶原蛋白的甘氨酸含量几乎占了1/3,脯氨酸和羟脯氨酸的含量为各种蛋白质中含量最高,胶原蛋白还拥有其它蛋白质不存在的羟基赖氨酸。胶原蛋白特有的空间结构和化学组成,使其具备很强的生物活性和独特的生物功能,在食品、保健品、化妆品、生物医药等众多领域中都有十分广泛的应用。
特别是在高端的生物医药领域,高纯超螺旋结构胶原蛋白是细胞外基质(EMC)的主要化合物,具有其他材料所不具备的低毒性、低免疫抗原性、高生物相容性、可生物降解性等优势,它能参与细胞的迁移、分化和增殖,并使骨、腱、软骨和皮肤具有一定的机械强度,可作为生物材料,具有巨大的市场价值。据统计,全球市场每年要销售超过40亿美元的以胶原蛋白为原料的生物医用材料。
本发明选择生物体内,特别是人体内含量最为丰富和市场潜力最为巨大的Ⅰ型胶原蛋白作为目标产品,同时,近年来由于疯牛病、口蹄疫等疾病在全球范围内肆虐,人们逐渐对原来以猪、牛等陆生哺乳动物的皮、腱等为原料提取的胶原蛋白的安全性产生置疑,以及由于特定宗教原因,在信仰伊斯兰教、印度教和犹太教地区的人民对源自牲畜的胶原蛋白始终存在固有排斥。有鉴于此,本发明挑选主要含有Ⅰ型胶原蛋白的鱼鳞,特别是海洋鱼鳞,作为制备原料。
目前,制备高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的技术瓶颈在于:所制备的Ⅰ型胶原蛋白既要保持固有的三螺旋结构,又要较高的纯度保证,即,经由十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称:SDS-PAGE)检定,至少要在文献和专利、以及同类型市场产品普遍认可的电泳纯度级别上达到高纯。在此基础上,尽可能地提高Ⅰ型胶原蛋白的提取产率和制备工艺效率。
为提高Ⅰ型胶原蛋白的提取产率和工艺效率,现有技术中提取胶原蛋白工艺基本采取物理和化学两种方法。
物理方法:预先将鱼鳞粉碎,再依次进行碱和酸的除杂工艺,由于鱼鳞含有大量的钙盐——羟基磷灰石。特别是海洋鱼鳞,可看成由Ⅰ型胶原蛋白纤维与羟基磷灰石形成的坚韧的复合材料,所以,粉碎鱼鳞时不可避免的产生大量的热量。在实际操作过程中,一般采取添加液氮或将鱼鳞预先冷冻的方式来抵消粉碎放热,且由于鱼鳞中羟基磷灰石相对于胶原蛋白占有较大的比例,粉碎鱼鳞所需要功在很大程度上是用于粉碎羟基磷灰石,这本质上是一种能量和资源浪费;同时鱼鳞在预处理前粉碎,大量胶原蛋白被提前暴露在碱和酸除杂试剂中,导致胶原蛋白不必要的损失;另外,如果鱼鳞被粉碎得过于细碎,在液体中很容易由于水的张力影响而发生团聚现象,造成鱼鳞预处理除杂效果不佳。
化学方法:采取酶溶法,即在鱼鳞浸提过程中,添加特定的蛋白酶——胃蛋白酶定向去除胶原蛋白尾端非螺旋部分的端肽,使鱼鳞胶原蛋白相对于酸溶法大量溶出,而制得的酶溶性胶原蛋白由于分子内氢键仍能保持三螺旋结构。这种经典的提高产率的方法被大量文献和专利采纳。当然,化学方法最大的优势还在于酶溶性胶原蛋白去除胶原蛋白的主要抗原决定基团,而大部分专利尚未在工艺设计方面,关注酸溶和酶溶两种提取方法对胶原蛋白产品抗原性的影响并有所区分。
生物制品的抗原性将大大限制其在食品、化妆品、药品等领域的应用。相关文献显示以鱼鳞或鱼皮为原料制备胶原蛋白,如果采取酸溶提取或因处理不当而导致胶原蛋白变性成为明胶,均有可能使制品的抗原性增大。而酶溶提取可以去除胶原蛋白的主要抗原决定基团——位于非螺旋部分的端肽,这样既可以保持胶原蛋白的三螺旋结构,又可以有效降低胶原蛋白制品的抗原性,保证胶原蛋白在食品、保健品、化妆品、生物医药领域的广泛应用。正因如此,它被大量中外文献推崇使用。
而且,现有技术中胶原蛋白的分离工艺基本都是将酸溶性胶原蛋白粗提液或酶溶性胶原蛋白粗提液加入大量的盐(氯化钠或是硫酸铵)进行盐析沉淀,或是调解pH至中碱性条件凝絮成蛋白质凝胶,再将蛋白沉淀或凝胶用酸溶解,然后装入透析袋中,使用蒸馏水或0.02M磷酸氢二钠进行长时间的反复透析,透析后得到的胶原蛋白液体通过冷冻干燥得到最终的酸溶性胶原蛋白或酶溶性胶原蛋白。这些制备工艺的缺陷在于:工艺流程繁琐复杂,分离纯化周期冗长,制备成本高,工艺很难放大并实施规模化生产。
最后,现有技术制备的胶原蛋白构型不明确,三螺旋结构是否完整不清楚,高纯超螺旋结构单一构型胶原蛋白产品的得率也不高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足,提供一种产率更加高效,工艺选择更为多样,成本更为低廉,周期更为紧凑,后续放大规模化生产更为容易,同时保证产品的纯度和特有的三螺旋结构的酸溶性高纯Ⅰ型胶原蛋白和酶溶性高纯Ⅰ型胶原蛋白的制备工艺,为大宗鱼类水产下脚料——鱼鳞突破制约高值开发的技术瓶颈,在食品、保健品、化妆品和药品,特别在高端生物材料领域的高值开发利用开拓新的途径。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的快速制备工艺,所述的“高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白”包括酸溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白和酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白,其中,酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白为低抗原性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白;需要特别说明的是,与酸溶提取的Ⅰ型胶原蛋白相比,酶溶提取的Ⅰ型胶原蛋白仅去除位于非螺旋部分的端肽,依靠分子内氢键保持特定的三螺旋结构,从这个角度上看,酶溶性胶原蛋白可视为酸溶性胶原蛋白的定向酶解产物。按照传统的提取工艺,酶溶性Ⅰ型胶原蛋白的提取率一般都高于酸溶性Ⅰ型胶原蛋白,但本发明工艺却能大幅提高酸溶性Ⅰ型胶原蛋白的提取产率。尽管根据本发明工艺,酶溶性Ⅰ型胶原蛋白的提取率仍然高于酸溶性Ⅰ型胶原蛋白,当酸溶性Ⅰ型胶原蛋白具备一定的产量的时候,则从酸溶性Ⅰ型胶原蛋白定向酶解制备酶溶性Ⅰ型胶原蛋白,也就成为一种可能。所以本发明将酸溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的快速制备工艺也归纳在内。所述的“高纯”为在国内外文献和专利、以及市场产品普遍认可的电泳纯度级别,经过SDS-PAGE检测,Ⅰ型胶原蛋白的电泳纯度≥95%,方法包括以下步骤:
(1)原料预处理
将鱼鳞投入反应釜中,加入鱼鳞重量2~10倍的碱溶液,搅拌0.5~12小时,除掉鱼鳞的脂肪和杂蛋白等杂质,用水洗净,加入鱼鳞重量2~10倍的酸溶液,搅拌0.5~12小时,再用水洗净,其中碱溶液的质量体积浓度为1~4%,酸溶液的质量体积浓度为3~8%,预处理温度控制在0~25℃之间;
(4)Ⅰ型胶原蛋白提取与过滤
向预处理后的原料中添加0.05~10mol/L的弱酸作为提取剂,原料与提取剂的重量比为1:1~1:10,同时进行0.5~6小时的匀浆提取,匀浆速度为1000~28000转/分,伴随搅拌散热以维持提取温度为0~10℃。如果提取液中残渣的粒径≥0.5mm,先进行原汁快速榨取,再进行冷冻离心过滤或加压快速过滤;如果提取液中残渣的粒径<0.5mm,先进行冷冻离心过滤,再进行加压快速过滤;如果不考虑提取液中残渣粒径,则可以直接进行冷冻离心过滤。过滤得到的残渣回收后重复进行提取过滤步骤0~5次,所得的上清液混合汇总,即为酸溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液。
向预处理后的原料中添加0.05~10mol/L的弱酸作为提取剂,原料与提取剂的重量比为1:1~1:10,同时加入原料重量0.05%~5%的胃蛋白酶并进行0.5~6小时的匀浆提取,匀浆速度为1000~28000转/分,伴随搅拌散热以维持提取温度为0~10℃,如果提取液中残渣的粒径≥0.5mm,先进行原汁快速榨取,再进行冷冻离心过滤或加压快速过滤;如果提取液中残渣的粒径<0.5mm,先进行冷冻离心过滤,再进行加压快速过滤;如果不考虑提取液中残渣粒径,则可以直接进行冷冻离心过滤。过滤得到的残渣回收后重复进行提取过滤步骤0~5次,所得的上清液混合汇总,即为酶溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液。
(5)Ⅰ型胶原蛋白分离纯化
膜分离工艺技术纯化酸溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液或酶溶性I型胶原蛋白粗提液,粗提液先用孔径为1~0.2μm的微滤膜去除肉眼未见的细微残渣或可能的热原,透过液再用孔径为0.1~0.05μm或相对分子量为150KD~100KD的超滤膜去除残余的胃蛋白酶、小分子杂质和无机盐,浓缩得到电泳纯度≥95%,具备三螺旋结构的高纯酸溶性I型胶原蛋白溶液或高纯酶溶性I型胶原蛋白溶液;
(4)Ⅰ型胶原蛋白冷冻干燥
冷冻干燥热敏性的酸溶性Ⅰ型胶原蛋白溶液,得到高纯超螺旋结构酸溶性Ⅰ型胶原蛋白成品;冷冻干燥热敏性的酶溶性Ⅰ型胶原蛋白溶液,得到高纯超螺旋结构酶溶性Ⅰ型胶原蛋白成品。
在本发明中,所述步骤(1)原料预处理所使用的鱼鳞为海洋鱼类鱼鳞或部分淡水鱼类鱼鳞。本发明所述的海洋鱼类包括但不限于美国红鱼、二长慈鲷、羊头鲷、真鲷、大黄鱼、小黄鱼、黑鼓鱼、海鲈鱼、沙丁鱼、马鲭鱼、黄鲻鱼、尖吻平鲉、无斑拟羊鱼、秋刀鱼、赤鯮、狗母鱼和大西洋飞鱼等;本发明所述的淡水鱼类包括但不限于罗非鱼、野鲮、卡特拉鲃、鳙鱼、鲤鱼、白斑狗鱼、白鲢等。只要所选的鱼类鱼鳞能够被匀浆处理。
在本发明中,所述步骤(1)原料预处理所使用的碱为碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾;酸为盐酸或硝酸。
在本发明中,所述步骤(2)Ⅰ型胶原蛋白提取所使用的弱酸为醋酸、柠檬酸、草酸或苹果酸。
在本发明中,所述步骤(2)中所使用的原汁快速榨取机转速为0~100转/分;加压快速过滤的压力为0.1~0.6Mpa;所使用的离心机为6000~15000rpm的大型高速冷冻离心机。
在本发明中,所述步骤(3)分离纯化所使用的孔径为1~0.2μm的微滤膜流速为100~2000立方米/(小时×平方米),膜压力为0.1~0.6Mpa,温度为0~10℃;分离纯化所使用的孔径为0.1~0.05μm或相对分子量为150KD~100KD的超滤膜流速为100~1200立方米/(小时×平方米),膜压力为0.1~0.6Mpa,温度为0~10℃。
在本发明中,所述步骤(2)中离心过滤和步骤(3)分离纯化的温度为0~10℃。
在本发明中,所述步骤(4)中所使用的冷冻干燥的隔板温度为-10~-20℃、真空度为13.33Pa、冻干时间为12~36小时。
在本发明中,所述的高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白包括酸溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白和酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白。其中酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白为低抗原性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白。无论是酸溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白还是酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白,均通过SDS-PAGE检测,电泳纯度均≥95%,都具备三螺旋结构的高纯Ⅰ型胶原蛋白。
在本发明中,所述预处理步骤前,优选先对鱼鳞进行清洗以除去颗粒杂质。
与现有技术和产品相比,本发明具有以下优点:
1.本发明选择主要含有Ⅰ型胶原蛋白的鱼鳞,特别是海洋鱼鳞,作为原料,保证了提取的胶原蛋白是具备明确单一构型的Ⅰ型胶原蛋白。
2.本发明的提取与过滤步骤中使用低温匀浆提取工艺,大大提高了酸溶性Ⅰ型胶原蛋白和酶溶性Ⅰ型胶原蛋白的得率,针对同一体积的料液,原来要花45~60天连续搅拌浸提工艺提取的Ⅰ型胶原蛋白产量,使用本发明的匀浆提取工艺仅需2~3小时便可达到。由此推导可得,在相同时间内,使用匀浆提取工艺处理单位体积的料液,其Ⅰ型胶原蛋白产量就可以与传统工艺处理几十倍体积的料液所得到的Ⅰ型胶原蛋白产量相当。
3.本发明的提取与过滤步骤中根据鱼鳞残渣的粒径大小,使用不同的过滤工艺,如:原汁快速榨取、加压过滤和冷冻离心过滤,以实现鱼鳞残渣与Ⅰ型胶原蛋白最大限度的固液分离,保证Ⅰ型胶原蛋白的产率。
4.本发明的提取过滤分离纯化步骤全程低温(0~10℃)控制并结合冷冻干燥技术,保证提取的Ⅰ型胶原蛋白特有的三螺旋结构的完整性。
5.本发明摒弃了传统工艺中常用的Tris试剂和用于盐析步骤的大量中性盐,节约了生产成本。
6.本发明运用超滤膜膜分离技术纯化Ⅰ型胶原蛋白,快速去除残余的胃蛋白酶、小分子杂质和无机盐,大大缩短了纯化时间和生产周期;同时运用微滤膜去除Ⅰ型胶原蛋白粗提液中肉眼未见的细微残渣或可能的热原。
7.本发明工艺流程简单合理,工艺方案选择多样,工艺得率高,适合规模化生产。
8.本发明得到的胶原蛋白具有完整超螺旋结构和明确单一构型的海洋源高纯Ⅰ型胶原蛋白,通过SDS-PAGE检测,其电泳纯度≥95%。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图。图中:(a):不考虑鱼鳞残渣粒径的工艺流程图;(b):鱼鳞残渣粒径≥0.5mm的工艺流程图;(c):鱼鳞残渣粒径<0.5mm的工艺流程图。
图2是本发明得到的酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白和酸溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白与市场上购买的高纯Ⅰ型胶原蛋白对照品的SDS-PAGE电泳图。图中:Marker:SDS-PAGE蛋白质高分子量标准蛋白;1:鼠尾I型胶原蛋白(电泳纯度≥95%),Sigma化学试剂公司(St.Louis,MO,USA);2:酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白,本发明实施例1制得;3:酸溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白,本发明实施例1制得。
图3是本发明实施例1得到的酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白和酸溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的傅里叶红外光谱图。图中:1.酸溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白;2.酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白。
图4是本发明实施例3得到的酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白和酸溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白与传统工艺制备的酶溶性Ⅰ型胶原蛋白和酸溶性Ⅰ型胶原蛋白的样品图。图中:1.酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白,本发明实施例3制得;2.酸溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白,本发明实施例3制得;3.传统专利工艺制备的酶溶性Ⅰ型胶原蛋白;4.传统专利工艺制备的酸溶性Ⅰ型胶原蛋白。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详述。
实施例1:
高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的快速制备工艺,步骤如下:
(1)原料预处理
洗净的美国红鱼鱼鳞2kg,投入反应釜中,加入鱼鳞重量10倍的碱溶液,搅拌1小时,用水洗净,加入鱼鳞重量10倍的酸溶液,搅拌1小时,再用水洗净,其中碱溶液的质量体积浓度为3%,酸溶液的质量体积浓度为5%,预处理温度为25℃;
(2)Ⅰ型胶原蛋白提取与过滤
向预处理后的原料中添加0.5mol/L的醋酸作为提取剂,原料与提取剂的重量比为1:3,同时进行3小时的匀浆提取,匀浆速度为25000转/分,伴随搅拌散热以维持提取温度为4℃。由于提取液中残渣的粒径<0.5mm,先进行冷冻离心过滤,离心机转速设定为10000rpm,离心时间15分钟,离心温度4℃;再进行加压快速过滤,过滤压力为0.3Mpa;过滤得到的残渣回收后重复进行提取过滤步骤3次,所得的上清液混合汇总,即为酸溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液。
向预处理后的原料中添加0.5mol/L的醋酸作为提取剂,原料与提取剂的重量比为1:3,同时加入原料重量0.5%的胃蛋白酶并进行3小时的匀浆提取,匀浆速度为24000转/分,伴随搅拌散热以维持提取温度为4℃,由于提取液中残渣的粒径<0.5mm,先进行冷冻离心过滤,离心机转速设定为10000rpm,离心时间15分钟,离心温度4℃;再进行加压快速过滤,过滤压力为0.3Mpa;过滤得到的残渣回收后重复进行提取过滤步骤3次,所得的上清液混合汇总,即为酶溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液。
(3)Ⅰ型胶原蛋白分离纯化
用孔径为0.2μm的微滤膜去除酸溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液或酶溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液中肉眼未见的细微残渣或可能的热原,微滤膜流速为1200立方米/(小时×平方米),膜压力为0.3Mpa,温度为4℃;透过液再用孔径为0.05μm的超滤膜截留,超滤膜流速为600立方米/(小时×平方米),膜压力为0.3Mpa,温度为4℃;浓缩得到电泳纯度≥95%,具备三螺旋结构的高纯酸溶性I型胶原蛋白溶液或高纯酶溶性I型胶原蛋白溶液。
(4)Ⅰ型胶原蛋白冷冻干燥
冷冻干燥高纯酸溶性I型胶原蛋白溶液或高纯酶溶性I型胶原蛋白溶液,设定隔板温度为-10℃、真空度为13.33Pa、冻干时间为24小时。即得高纯酸溶性I型胶原蛋白固体成品或高纯酶溶性I型胶原蛋白固体成品。
实施例2:
高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的快速制备工艺,步骤如下:
(1)原料预处理
将洗净的罗非鱼鱼鳞5kg投入反应釜中,加入鱼鳞重量8倍的碱溶液,搅拌10小时,用水洗净,加入鱼鳞重量8倍的酸溶液,搅拌3小时,再用水洗净,其中碱溶液的质量体积浓度为2%,酸溶液的质量体积浓度为6%,预处理温度为20℃;
(2)Ⅰ型胶原蛋白提取与过滤
向预处理后的原料中添加0.25mol/L的柠檬酸作为提取剂,原料与提取剂的重量比为1:2,同时进行2.5小时的匀浆提取,匀浆速度为10000转/分,伴随搅拌散热以维持提取温度为6℃。由于提取液中残渣的粒径≥0.5mm,先进行原汁快速榨取,原汁快速榨取机转速为38转/分,再进行冷冻离心过滤,离心机转速设定为8000rpm,离心时间30分钟,离心温度4℃;过滤得到的残渣回收后重复进行提取过滤步骤3次,所得的上清液混合汇总,即为酸溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液。
向预处理后的原料中添加0.25mol/L的柠檬酸作为提取剂,原料与提取剂的重量比为1:2,同时加入原料重量1%的胃蛋白酶并进行2.5小时的匀浆提取,匀浆速度为10000转/分,伴随搅拌散热以维持提取温度为6℃,由于提取液中残渣的粒径≥0.5mm,先进行原汁快速榨取,原汁快速榨取机转速为38转/分,再进行冷冻离心过滤,离心机转速设定为8000rpm,离心时间30分钟,离心温度4℃;过滤得到的残渣回收后重复进行提取过滤步骤3次,所得的上清液混合汇总,即为酶溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液。
(3)Ⅰ型胶原蛋白分离纯化
用孔径为0.4μm的微滤膜去除酸溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液或酶溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液中肉眼未见的细微残渣或可能的热原,微滤膜流速为1800立方米/(小时×平方米),膜压力为0.3Mpa,温度为5℃;透过液再用相对分子量为150KD的超滤膜截留,超滤膜流速为450立方米/(小时×平方米),膜压力为0.2Mpa,温度为5℃;浓缩得到电泳纯度≥95%,具备三螺旋结构的高纯酸溶性I型胶原蛋白溶液或高纯酶溶性I型胶原蛋白溶液。
(4)Ⅰ型胶原蛋白冷冻干燥
冷冻干燥I型胶原蛋白溶液,设定隔板温度为-15℃、真空度为13.33Pa、冻干时间为20小时。即得高纯酸溶性I型胶原蛋白固体成品或高纯酶溶性I型胶原蛋白固体成品。
实施例3:
高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的快速制备工艺,步骤如下:
(1)原料预处理
将洗净的美国红鱼鱼鳞0.5kg投入反应釜中,加入鱼鳞重量6倍的碱溶液,搅拌1小时,用水洗净,加入鱼鳞重量6倍的酸溶液,搅拌4小时,再用水洗净,其中碱溶液的质量体积浓度为1%,酸溶液的质量体积浓度为8%,预处理温度为15℃;
(2)Ⅰ型胶原蛋白提取与过滤
向预处理后的原料中添加1mol/L的醋酸作为提取剂,原料与提取剂的重量比为1:1,同时进行4小时的匀浆提取,匀浆速度为28000转/分,伴随搅拌散热以维持提取温度为8℃。由于提取液中残渣的粒径<0.5mm,进行加压快速过滤,过滤压力为0.25Mpa;过滤得到的残渣回收后重复进行提取过滤步骤3次,所得的上清液混合汇总,即为酸溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液。
向预处理后的原料中添加1mol/L的醋酸作为提取剂,原料与提取剂的重量比为1:1,同时加入原料重量2%的胃蛋白酶并进行4小时的匀浆提取,匀浆速度为28000转/分,伴随搅拌散热以维持提取温度为8℃,由于提取液中残渣的粒径<0.5mm,进行加压快速过滤,过滤压力为0.25Mpa;过滤得到的残渣回收后重复进行提取过滤步骤3次,所得的上清液混合汇总,即为酶溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液。
(3)Ⅰ型胶原蛋白分离纯化
用相对分子量为150KD的超滤膜截留酸溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液或酶溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液,超滤膜流速为700立方米/(小时×平方米),膜压力为0.3Mpa,温度为5℃;浓缩得到电泳纯度≥95%,具备三螺旋结构的高纯酸溶性I型胶原蛋白溶液或高纯酶溶性I型胶原蛋白溶液。
(4)Ⅰ型胶原蛋白冷冻干燥
冷冻干燥I型胶原蛋白溶液,设定隔板温度为-20℃、真空度为13.33Pa、冻干时间为24小时。即得高纯酸溶性I型胶原蛋白固体成品或高纯酶溶性I型胶原蛋白固体成品。
实施例4:
高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的快速制备工艺,步骤如下:
(1)原料预处理
洗净的狗母鱼鱼鳞10kg投入反应釜中,加入鱼鳞重量10倍的碱溶液,搅拌8小时,用水洗净,加入鱼鳞重量10倍的酸溶液,搅拌8小时,再用水洗净,其中碱溶液的质量体积浓度为4%,酸溶液的质量体积浓度为6%,预处理温度为10℃;
(2)Ⅰ型胶原蛋白提取与过滤
向预处理后的原料中添加2mol/L的苹果酸作为提取剂,原料与提取剂的重量比为1:5,同时进行4小时的匀浆提取,匀浆速度为1000转/分,伴随搅拌散热以维持提取温度为4℃。由于提取液中残渣的粒径≥0.5mm,进行冷冻离心过滤,离心机转速设定为15000rpm,离心时间30分钟,离心温度4℃;过滤得到的残渣回收后重复进行提取过滤步骤4次,所得的上清液混合汇总,即为酸溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液。
向预处理后的原料中添加2mol/L的苹果酸作为提取剂,原料与提取剂的重量比为1:5,同时加入原料重量4%的胃蛋白酶并进行4小时的匀浆提取,匀浆速度为1000转/分,伴随搅拌散热以维持提取温度为4℃,由于提取液中残渣的粒径≥0.5mm,进行冷冻离心过滤,离心机转速设定为15000rpm,离心时间30分钟,离心温度4℃;过滤得到的残渣回收后重复进行提取过滤步骤4次,所得的上清液混合汇总,即为酶溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液。
(3)Ⅰ型胶原蛋白分离纯化
用孔径为0.2μm的微滤膜去除酸溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液或酶溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液中肉眼未见的细微残渣或可能的热原,微滤膜流速为1000立方米/(小时×平方米),膜压力为0.2Mpa,温度为4℃;透过液再用相对分子量为200KD的超滤膜截留,超滤膜流速为600立方米/(小时×平方米),膜压力为0.3Mpa,温度为4℃;浓缩得到电泳纯度≥95%,具备三螺旋结构的高纯酸溶性I型胶原蛋白溶液或高纯酶溶性I型胶原蛋白溶液。
(4)Ⅰ型胶原蛋白冷冻干燥
冷冻干燥I型胶原蛋白溶液,设定隔板温度为-15℃、真空度为13.33Pa、冻干时间为36小时。即得高纯酸溶性I型胶原蛋白固体成品或高纯酶溶性I型胶原蛋白固体成品。
实施例5:
高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的快速制备工艺,步骤如下:
(1)原料预处理
洗净的罗非鱼鱼鳞20kg投入反应釜中,加入鱼鳞重量6倍的碱溶液,搅拌3小时,用水洗净,加入鱼鳞重量8倍的酸溶液,搅拌8小时,再用水洗净,其中碱溶液的质量体积浓度为6%,酸溶液的质量体积浓度为6%,预处理温度为15℃;
(2)Ⅰ型胶原蛋白提取与过滤
向预处理后的原料中添加1mol/L的草酸作为提取剂,原料与提取剂的重量比为1:5,同时进行3小时的匀浆提取,匀浆速度为16000转/分,伴随搅拌散热以维持提取温度为6℃。由于提取液中残渣的粒径≥0.5mm,先进行原汁快速榨取,原汁快速榨取机转速为48转/分,再进行加压快速过滤,过滤压力为0.5Mpa;过滤得到的残渣回收后重复进行提取过滤步骤5次,所得的上清液混合汇总,即为酸溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液。
向预处理后的原料中添加1mol/L的草酸作为提取剂,原料与提取剂的重量比为1:5,同时加入原料重量5%的胃蛋白酶并进行3小时的匀浆提取,匀浆速度为16000转/分,伴随搅拌散热以维持提取温度为4℃,由于提取液中残渣的粒径≥0.5mm,先进行原汁快速榨取,原汁快速榨取机转速为48转/分,再进行加压快速过滤,过滤压力为0.5Mpa;过滤得到的残渣回收后重复进行提取过滤步骤5次,所得的上清液混合汇总,即为酶溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液。
(3)Ⅰ型胶原蛋白分离纯化
用孔径为0.2μm的微滤膜去除酸溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液或酶溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液中肉眼未见的细微残渣或可能的热原,微滤膜流速为1000立方米/(小时×平方米),膜压力为0.2Mpa,温度为4℃;透过液再用孔径为0.05μm的超滤膜截留,超滤膜流速为650立方米/(小时×平方米),膜压力为0.3Mpa,温度为4℃;浓缩得到电泳纯度≥95%,具备三螺旋结构的高纯酸溶性I型胶原蛋白溶液或高纯酶溶性I型胶原蛋白溶液。
(4)Ⅰ型胶原蛋白冷冻干燥
冷冻干燥Ⅰ型胶原蛋白溶液,设定隔板温度为-25℃、真空度为13.33Pa、冻干时间为48小时。即得高纯酸溶性Ⅰ型胶原蛋白固体成品或高纯酶溶性Ⅰ型胶原蛋白固体成品。
将本发明得到的酸溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白和酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳检测,发现其构型明确:是典型的Ⅰ型胶原蛋白——包含两组不同的α链(α1链、α2链)和两者的二聚体(β链);同时与市场上购买到的高纯Ⅰ型胶原蛋白对照品——美国Sigma公司制备的鼠尾Ⅰ型胶原蛋白对比,本发明制备的酸溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白和酶溶性高纯Ⅰ型胶原蛋白在电泳级别上的纯度与鼠尾Ⅰ型胶原蛋白(电泳纯度≥95%)基本相同。其中,实施例1的结果参照图2。电泳方法可参见以下文章:
1)陈思谨,易瑞灶,洪碧红,陈晖,陈俊德,乐卿清,高效液相色谱法测定鱼鳞中的Ⅰ型胶原蛋白的含量.中国海洋药物(2013,Vol.32,No.3),54-58。
2)Chen,S.J.,Chen,H.,Xie,Q.N.,Hong,B.H.,Chen,J.D.,Fang H.,Bai,K.K.,He,J.L.,Yi,R.Z.,&Wu,H.Rapid isolation of high purity pepsin-soluble type Icollagen from scales of red drum fish(Sciaenops ocellatus).FoodHydrocolloids,52,2016,468-477.
3)Ogawa,M.,Portier,R.J.,Moody,M.W.,Bell,J.,Schexnayder,M.A.,&Losso,J.N.(2004).Biochemical properties of bone and scale collagens isolated fromthe subtropical fish black drum(Pogonia cromis)and sheeps head seabream(Archosargus probatocephalus).Food Chemistry,88(4),495-501.
4)Nagai,T.,Izumi,M.,&Ishii,M.(2004).Fish scale collagen.Preparationand partial characterization.International Journal of Food Science andTechnology,39,239-244.
将本发明得到的酸溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白和酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白进行傅里叶红外光谱(FTIR)测定,光谱图中1240cm-1和1454cm-1两处的吸收比例大约等于1.0,由此判定酸溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白和酶溶性高纯Ⅰ型胶原蛋白的三螺旋结构完整。其中,实施例1的结果参照图3。光谱测定和三螺旋结构判定方法可参见以下文章:
1)Plepis,A.M.D.G.,Goissis,G.,&Das,G.D.K.(1996).Dielectric andpyroelectric characterization of anionic and native collagen.PolymerEngineering Science,36(24),2932-2938.
2)Ahmad,M.,&Benjakul,S.(2010).Extraction and characterisation ofpepsin-solubilised collagen from the skin of unicorn leather jacket(Aluterusmonocerous).Food Chemistry,120,817-824.
3)Benjakul,S.,Thiansilakul,Y.,Visessanguan,W.,Roytrakul,S.,Kishimura,H.,Prodpran,T.,et al.(2010).Extraction and characterisation of pepsin-solubilised collagens from the skin of bigeye snapper(Priacanthus tayenus andPriacanthus macracanthus).Journal of theScience of Food and Agriculture,90,132-138.
4)Duan,R.,Zhang,J.,Du,X.,Yao,X.,&Konno,K.(2009).Properties ofcollagen from skin,scale and bone of carp(Cyprinus carpio).Food Chemistry,112(3),702-706.
5)Kittiphattanabawon,P.,Benjakul,S.,Visessanguan,W.,Kishimura,H.,&Shahidi,F.(2010).Isolation and characterisation of collagen from the skin ofbrownbanded bamboo shark(Chiloscyllium punctatum).Food Chemistry,119,1519-1526.
6)Matmaroh,K.,Benjakul,S.,Prodpran,T.,Encarnacion,A.B.,&Kishimura,H.(2011).Characteristics of acid soluble collagen and pepsin soluble collagenfrom scale of spotted golden goatfish(Parupeneus heptacanthus).FoodChemistry,129,1179-1186.
7)Veeruraj,A.,Arumugam,M.,&Balasubramanian,T.(2013).Isolation andcharacterization of thermostable collagen from the marine eel-fish(Evenchelysmacrura).Process Biochemistry,48(10),1592-1602.
8)Wang,L.,An,X.X.,Yang,F.M.,Xin,Z.H.,Zhao,L.Y.,&Hu,Q.H.(2008).Isolation and characterisation of collagens from the skin,scale and bone ofdeep-sea redfish(Sebastes mentella).Food Chemistry,108,616-623.
基于相同重量的鱼鳞原料和相同的提取时间,将本发明得到的酸溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白样品和酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白样品与传统工艺制备的酸溶性Ⅰ型胶原蛋白样品和酶溶性Ⅰ型胶原蛋白样品对比,可以很明显地看到,无论是酸溶法还是酶溶法,使用本发明工艺可以有效提高高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的产率。结果参见图4。
Claims (7)
1.高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法,其特征在于,其步骤如下:
(1)原料预处理
将鱼鳞投入反应釜中,加入鱼鳞重量2~10倍的碱溶液,搅拌0.5~12小时,除掉鱼鳞的脂肪和杂蛋白,用水洗净,加入鱼鳞重量2~10倍的酸溶液,搅拌0.5~12小时,再用水洗净,其中碱溶液的质量体积浓度为1~4%,酸溶液的质量体积浓度为3~8%,预处理温度控制在10~25℃之间;
(2)Ⅰ型胶原蛋白提取与过滤
向预处理后的原料中添加0.05~10mol/L的弱酸作为提取剂,原料与提取剂的重量比为1:1~1:5,同时进行2.5~6小时的匀浆提取,匀浆速度为1000~28000转/分,伴随搅拌散热以维持提取温度为4~10℃;如果提取液中残渣的粒径≥0.5mm,先进行原汁快速榨取,再进行冷冻离心过滤或加压快速过滤;如果提取液中残渣的粒径<0.5mm,先进行冷冻离心过滤,再进行加压快速过滤;过滤得到的残渣回收后重复进行提取过滤步骤0~5次,所得的上清液混合汇总,即为酸溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液;或者
向预处理后的原料中添加0.05~10mol/L的弱酸作为提取剂,原料与提取剂的重量比为1:1~1:5,同时加入原料重量0.05%~5%的胃蛋白酶并进行2.5~6小时的匀浆提取,匀浆速度为1000~28000转/分,伴随搅拌散热以维持提取温度为4~10℃,如果提取液中残渣的粒径≥0.5mm,先进行原汁快速榨取,再进行冷冻离心过滤或加压快速过滤;如果提取液中残渣的粒径<0.5mm,先进行冷冻离心过滤,再进行加压快速过滤;过滤得到的残渣回收后重复进行提取过滤步骤0~5次,所得的上清液混合汇总,即为酶溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液;
所述的弱酸为醋酸、柠檬酸、草酸或苹果酸;
步骤(2)中所使用的原汁快速榨取机转速为38~48转/分;加压快速过滤的压力为0.5~0.6Mpa;所述冷冻离心过滤步骤所使用的离心机为6000~15000rpm的高速冷冻离心机,离心时间为30min;
(3)Ⅰ型胶原蛋白分离纯化
膜分离工艺技术纯化酸溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液或酶溶性I 型胶原蛋白粗提液,粗提液先用孔径为0.2~0.4μm的微滤膜处理,透过液再用孔径为0.05~0.1μm或相对分子量为100KD~150KD的超滤膜处理,浓缩得到高纯酸溶性I 型胶原蛋白溶液或高纯酶溶性I 型胶原蛋白溶液;
所述的高纯酸溶性超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白和高纯酶溶性超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白,均为通过SDS-PAGE检测,电泳纯度均≥95%,都具备三螺旋结构的Ⅰ型胶原蛋白;
(4)Ⅰ型胶原蛋白冷冻干燥
冷冻干燥酸溶性Ⅰ型胶原蛋白溶液,得到高纯超螺旋结构酸溶性Ⅰ型胶原蛋白成品;冷冻干燥酶溶性Ⅰ型胶原蛋白溶液,得到高纯超螺旋结构酶溶性Ⅰ型胶原蛋白成品。
2.根据权利要求1所述高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)原料预处理所使用的鱼鳞为海洋鱼类鱼鳞或淡水鱼类鱼鳞。
3.根据权利要求1所述高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)原料预处理所使用的碱为碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾;酸为盐酸或硝酸。
4.根据权利要求1所述高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)分离纯化所使用的微滤膜流速为100~2000立方米/(小时×平方米),膜压力为0.1~0.6Mpa,温度为0~10℃;分离纯化所使用的超滤膜流速为100~1200立方米/(小时×平方米),膜压力为0.2~0.3Mpa,温度为0~10℃。
5.根据权利要求1所述高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中离心过滤和步骤(3)分离纯化的温度为0~10℃。
6.根据权利要求1所述高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法,其特征在于:所述步骤(4)中所使用的冷冻干燥的隔板温度为-20~-10℃、真空度为13.33Pa、冻干时间为12~36小时。
7.根据权利要求1-6任一项所述高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法,其特征在于:所述预处理步骤前,先对鱼鳞进行清洗以除去颗粒杂质。
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