CN109796529A - 一种胶原蛋白及其提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胶原蛋白及其提取方法。该方法包括如下步骤：1)将含有胶原蛋白的动物组织在液氮中进行冷冻、研磨；2)将研磨后的动物组织以酸/酶法提取胶原蛋白，得到胶原蛋白溶液；3)将胶原蛋白溶液透析、冻干后，得到粉末状的所述胶原蛋白。本发明采用冷冻研磨预处理方法，在液氮中预先冷冻含有胶原蛋白的动物组织一段时间，利用研磨仪在一定频率下研磨成粉末，该方法处理后，三螺旋结构及热变性温度并未受影响，能在保持天然胶原纤维化性能的基础上，比原有不冷冻研磨的酸提法的提取率提高18％‑82％，这对于胶原应用及胶原基生物材料的应用具有重要意义。

Description

一种胶原蛋白及其提取方法

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，更具体地，涉及一种胶原蛋白及其提取方法。

背景技术

胶原(collagen)，是动物体内含量最为丰富的结构类蛋白质，广泛分布于骨骼、软骨、筋腱、皮肤、内膜、血管等组织和器官中。在已知的28种胶原类型中，I型胶原含量最为丰富、分布最为广泛。典型的I型胶原分子由两条α1和一条α2链组成，形成绳索状的三股螺旋结构，分子量约为300kDa。胶原蛋白具有优异的生物相容性、适宜的降解性、良好的生物力学性能等，作为天然的生物框架组分，在临床医学、组织工程、医学生物工程等领域具有巨大的应用空间。随着分子生物学的快速发展，胶原蛋白已成为最具前途的绿色可再生材料。

胶原蛋白提取方法一般为酸提法，酶提法，碱提法，盐提法：(1)酸提法：常用的酸有盐酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸和苹果酸等。酸法主要提取的是天然组织中未纤维化、游离状态的胶原分子。由于大部分胶原提取原料(哺乳动物皮肤、跟腱等)中，胶原主要以共价键交联的纤维化形式存在，因此酸法提取得率较低；(2)酸/酶提法：主要使用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等，目前，最常使用的是胃蛋白酶，由于胃蛋白酶可以在纤维化状态下胶原进行限制性的部分水解，切断胶原纤维之间的共价键交联位点，释放出游离的胶原分子，并进一步溶解在酸溶液中。因此，该方法的提取得率远远高于单纯的酸提取法，也是目前胶原提取制备的主流方法。其缺点是提取周期较长；(3)碱法：碱对胶原纤维有强大的水解能力，通过水解作用会产生大量的水解胶原蛋白，利用强碱使肽键水解，因此得到的是胶原的水解产物，分子量比较低，丧失了作为医用生物材料的基本性能，还会产生D型氨基酸消旋混合物，即旋光性化合物。而有些D型氨基酸是有毒的，有的甚至致癌、致畸和致突变作用；(4)盐法：胶原也可以用盐溶液提取，但其溶解能力有限，提取的对象主要是细胞中刚刚合成、尚未形成胶原纤维的产物，因此提取得率很低。

作为医用生物材料的胶原，必须具备完整的三螺旋结构和良好的分子活性，才能发挥胶原固有的生物力学、生物稳定和细胞响应等性能。总结现有的几种胶原提取方法，碱提取法虽然能最大限度的提取组织胶原，但提取产物结构严重破坏；酸法、酸/酶法和盐提取法均能较好的保持胶原的分子结构，但单纯的酸和盐溶液提取得率低，不具备实用价值。目前普遍运用的酸/酶提取法虽具有较好的提取得率，但对于哺乳动物皮肤组织中的提取得率也仅为20％左右，远远未实现原料资源的高效利用(皮肤组织中胶原的实际含量一般大于40％)。

皮肤组织中胶原未能充分提取的根本原因与哺乳动物皮肤组织的致密性有关。胶原提取的常见原料，如猪皮、牛皮，组织致密，酸、酶的溶解和水解能力难以充分发挥。粉碎提取，是提高天然产物得率的有效手段。但是，由于哺乳动物皮肤组织具有较大的强度、韧性，常规的粉碎方法需要高强度和长时间处理方能取得较好的粉碎效果。而在这一过程中，往往产生物料温度的提升现象，导致胶原热变性而丧失其应有的生物活性。

胶原在生物医学材料领域具有广泛的应用前景，其需求量与日俱增。作为天然蛋白质，天然胶原三螺旋结构的完整性对于胶原应用至关重要，目前的提取技术，仍存在诸多不足之处，如原料使用量大而胶原提取率低，或者提取率高而胶原分子结构破坏严重，因此，寻求一种简单，方便又可保留胶原三螺旋结构的提取方法具有极大的实际意义。

发明内容

本发明的目的在于解决上述问题，提供一种温和、简便、有效地提高胶原蛋白提取率的胶原蛋白的制备方法。

为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种胶原蛋白提取方法，该方法包括如下步骤：

1)将含有胶原蛋白的动物组织在液氮中进行冷冻、研磨；

2)将研磨后的动物组织以酸/酶法提取胶原蛋白，得到胶原蛋白溶液；

3)将胶原蛋白溶液盐析、透析、冻干后，得到粉末状的所述胶原蛋白。

根据本发明，步骤1)中，发明人在前期工作中发现，将含有胶原蛋白的动物组织在液氮中进行冷冻、研磨，既可得到高提取率的胶原，又不破坏胶原三螺旋结构。具体地，针对胶原样品的冷冻研磨粉碎实验过程中，发明人发现冷冻研磨产物依然具有三螺旋构造及分子活性，表现为三螺旋和α螺旋的圆二色谱特征依然保留、差示扫描量热法(DSC)分析具有热解离吸收峰、浊度实验观察到自组装分子行为等。

根据本发明，步骤1)中，液氮可以使含有胶原蛋白的动物组织实现快速冷冻，避免了在慢速冷冻过程中出现的胶原蛋白活性被破坏的现象。

步骤1)中，所述研磨是利用球磨机进行物料粉碎的一种方式，即利用振动研磨体(如钢球)的冲击作用以及研磨体与球磨内壁的研磨作用而将物料粉碎。该方式能在几秒钟内就可以达到混合、均化粉末和悬浮物的目的。当球磨转动时，由于研磨体与球磨内壁之间的摩擦作用，将研磨体依旋转的方向带上后再落下，导致物料连续不断地被冲击、粉碎。

根据本发明，研磨时可根据需要选择是否对含有胶原蛋白的动物组织进行切块，切块大小也可根据需要进行调整，如切成直径为2mm左右的块状。

作为优选方案，进行步骤1)之前，还包括预处理步骤：将含有胶原蛋白的动物组织脱脂、去除杂蛋白后，干燥。

根据本发明，所述动物组织可选用本领域技术人员提取胶原蛋白时常规采用的动物组织。作为优选方案，所述含有胶原蛋白的动物组织为哺乳动物皮和/或鱼类皮；所述胶原蛋白为哺乳动物皮胶原蛋白和/或鱼皮胶原蛋白。

作为优选方案，步骤1)中，冷冻的时间为16～32h。

发明人进一步发现，冷冻研磨对胶原蛋白提取率的影响情况与冷冻研磨条件密切相关，其中，研磨时间的影响最为显著。作为优选方案，步骤1)中，所述研磨的时间为3-25min。为了获得更高的胶原蛋白提取率，研磨的时间进一步优选为10-20min。

根据本发明，步骤1)中，所述研磨的频率为10～25HZ。

本发明步骤2)中，所述酸/酶法可以为本领域技术人员常规采用的酸/酶法，如文献1-2中记载的酸/酶法。

(文献1.Yuan H,Zhang W,Shi Q,et al.Determination of d,l-Amino Acids inCollagen from Pig and Cod Skins by UPLC Using Pre-column FluorescentDerivatization[J].Food Analytical Methods,2018:1-8.

文献2.Rawdkuen S,Thitipramote N,Benjakul S.Preparation and functionalcharacterisation of fish skin gelatin and comparison with commercial gelatin[J].International Journal of Food Science&Technology,2013,48(5):1093–1102.)

作为优选方案，步骤2)中，酸/酶法提取胶原蛋白的步骤包括：

将研磨后的样品使用0.4～0.6mol/L乙酸浸泡并搅拌3～5d，再加入胃蛋白酶使混合溶液中胃蛋白酶的浓度为1.5～2.5％，搅拌16～32h后得到胶原蛋白溶液。

根据本发明，步骤3)中的盐析、透析、冻干均为本领域技术人员在制备胶原蛋白时的常规操作，操作步骤可根据需要进行调整。

作为优选方案，步骤3)的步骤包括：

盐析：向胶原蛋白溶液中添加2～3mol/L的NaCl溶液，搅拌充分后静置；

复溶：分离上清液与沉淀，过滤沉淀，取沉淀溶于0.4～0.6mol/L乙酸中；

透析：将复溶后的胶原蛋白溶液于0.08～0.12mol/L乙酸中透析至无Cl^-离子后继续用水透析至中性；

将透析好的样品放入冻干机冻干后得到粉末状的胶原蛋白。

根据本发明，步骤3)中，为保证透析效果，透析的时间优选≥3d。透析通常采用本领域技术人员常规采用的实验用水，如蒸馏水、超纯水等。

本发明的第二方面提供由上述的胶原蛋白提取方法得到的胶原蛋白。

本发明的优点和积极效果：

本发明提供了一种能简单、温和、高效提取胶原蛋白的方法，以满足胶原在生物医学材料领域应用的需求量。

本发明采用冷冻研磨预处理方法，在液氮中预先冷冻含有胶原蛋白的动物组织一段时间，利用研磨仪在一定频率下研磨成粉末，该方法处理后，三螺旋结构及热变性温度并未受影响，能在保持天然胶原纤维化性能的基础上，比原有不冷冻研磨的酸提法的提取率提高18％-82％，这对于胶原应用及胶原基生物材料的应用具有重要意义。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1示出了实施例1-4中不同研磨时间的猪皮胶原样品的提取率与对比例的对比图。

图2示出了实施例1-4中不同研磨时间的猪皮胶原样品的圆二色谱分析图。

图3示出了实施例1-4中不同研磨时间的猪皮胶原样品的浊度实验图。

图4A-4D分别示出了实施例1-4中不同研磨时间的猪皮胶原样品的扫描电镜(SEM)实验研究图。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。

实施例1

将新鲜猪皮去毛及杂质，脱脂脱杂蛋白后，低温风干备用。

将风干后的脱脂猪皮在液氮中冷冻24h后取出，称取一定质量的猪皮样品切碎，转入清洗干净的25mL研磨罐中(装有两粒的小球)，研磨罐锁紧密封后，将研磨罐夹持在研磨仪上，在固定频率25Hz下研磨3min，制得均匀的粉末状样品，再用传统的酸/酶法提取猪皮胶原蛋白，步骤包括：酸提：将研磨后的样品使用0.5mol/L乙酸(料液比1:20，即1g研磨后的样品溶于20mL浓度为0.5mol/L的乙酸中)浸泡机械搅拌4d(低温操作台中进行)，加入胃蛋白酶使胃蛋白酶的浓度为2％，机械搅拌24h；盐析：向加入胃蛋白酶的乙酸溶液中添加2.6mol/L NaCl，搅拌充分后静置过夜；复溶：分离上清液与沉淀，过滤沉淀，取沉淀再次溶于0.5mol/L乙酸中；透析：将复溶后的猪皮胶原装如透析袋并置于0.1mol/L乙酸(4℃)中透析至无Cl^-离子后继续用超纯水透析至中性，将透析好的样品放入冻干机冻干，得到粉末状的所述胶原蛋白。

对比例

与实施例1的不同之处在于，未经冷冻研磨处理，直接采用传统的酸溶法提取猪皮胶原蛋白，用天狼猩红法测得对比例的提取率为22％。

实施例2

与实施例1的不同之处在于，脱脂猪皮研磨的时间为5min。

实施例3

与实施例1的不同之处在于，脱脂猪皮研磨的时间为10min。

实施例4

与实施例1的不同之处在于，脱脂猪皮研磨的时间为20min。

实施例5

对鱼皮中的胶原蛋白进行提取，具体操作过程为：手工剥下青鱼鱼皮，用冰水清洗干净。手工去除鱼皮上的余肉，用自来水清洗干净。将鱼皮剪切成2.0×2.0cm²大小的块状，除去杂质杂蛋白，低温风干备用。上述操作步骤均在不高于15℃环境下进行。

提取鱼皮胶原蛋白的步骤同实施例1。

测试例1

图1示出了实施例1-4中不同研磨时间的猪皮胶原样品的提取率与对比例的对比图，结果表明，实施例1-4胶原蛋白的提取率分别为26％、35％、37％、40％，提取率比对比例分别提高了18％、59％、68％及82％。

猪皮胶原样品的提取率的检测方法为：将不同时间研磨的猪皮提取胶原用0.5mol/L乙酸配制成0.25mg/mL胶原溶液，采用天狼星红法测定胶原纯度。

实施例1研磨3min后胶原蛋白的提取率为26％，提取率比对比例提高18％，该产物经过浊度实验和圆二色谱(CD)分析，证实为具有完整三螺旋分子结构的天然Ⅰ型胶原，与对比例样品并无差别。

测试例2

图2示出了实施例1-4中不同研磨时间的猪皮胶原样品的圆二色谱分析图。运用CD实验，开展了相同预冻时间不同研磨时间下研磨样品与天然胶原样品的三螺旋和α螺旋的圆二色谱特征峰情况，结果表明，研磨后样品的三螺旋和α螺旋的圆二色谱特征依然保留，不同研磨时间对胶原的三螺旋结构几乎没有影响。

测试例3

图3示出了实施例1-4中不同研磨时间的猪皮胶原样品的浊度实验图。运用浊度实验方法，在体系温度为35℃条件下，开展了研磨样品与未研磨天然胶原纤维重组动力学的差异化研究，结果表明，与未研磨天然胶原相比，研磨3min、5min、10min和20min后仍具有纤维重组能力，该工作清晰地揭示了冷冻研磨对胶原结构及重组能力并未产生影响。

测试例4

图4A-4D分别示出了实施例1-4中不同研磨时间的猪皮胶原样品的扫描电镜(SEM)实验研究图。通过SEM揭示了冷冻研磨对胶原体外纤维重组过程中纤维形貌和分布的影响，SEM研究表明，冷冻研磨可以使得胶原纤维的粒径变细，纤维之间的排布更加紧密。

图1-4直观的反映了不同研磨时间条件下胶原的三螺旋结构保留情况和纤维自组装能力，可以发现，随着研磨时间的延长(20min)，纤维自组装速率略有下降，研磨3-10min，胶原的三螺旋及纤维组装速率几乎无变化。为了获得最高的提取率，可选择20min的研磨时间，其纤维三螺旋结构并未受到影响。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims (10)

1.一种胶原蛋白提取方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)将含有胶原蛋白的动物组织在液氮中进行冷冻、研磨；

2)将研磨后的动物组织以酸/酶法提取胶原蛋白，得到胶原蛋白溶液；

3)将胶原蛋白溶液盐析、透析、冻干后，得到粉末状的所述胶原蛋白。

2.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，进行步骤1)之前，还包括预处理步骤：

将含有胶原蛋白的动物组织脱脂、除杂蛋白后，干燥。

3.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，

所述含有胶原蛋白的动物组织为哺乳动物皮和/或鱼类皮；

所述胶原蛋白为哺乳动物皮胶原蛋白和/或鱼皮胶原蛋白。

4.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤1)中，冷冻的时间为16～32h。

5.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤1)中，所述研磨的时间为3-25min。

6.根据权利要求5所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤1)中，所述研磨的时间为10-20min。

7.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤1)中，所述研磨的频率为10～25HZ。

8.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤2)中，酸/酶法提取胶原蛋白的步骤包括：

将研磨后的样品使用0.4～0.6mol/L乙酸浸泡并搅拌3～5d，再加入胃蛋白酶使混合溶液中胃蛋白酶的浓度为1.5～2.5％，搅拌16～32h后得到胶原蛋白溶液。

9.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤3)中，所述透析的时间≥3d。

10.由权利要求1-9中任意一项所述的胶原蛋白提取方法得到的胶原蛋白。