CN108707638A - 蛋壳膜酶解制备抗氧化多肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛋壳膜酶解制备抗氧化多肽的方法，该方法首先将禽蛋壳膜粉加入水中混合均匀，得到膜粉水溶液；再向膜粉水溶液中加入还原剂，混合均匀，得到混合物；然后向混合物中加入蛋白酶，酶解得到酶解液；最后将酶解液置温度为80～95℃的热水中处理10～30min后迅速冷却，在转速为8000～10000r/min条件下离心5～20min，收集上清液，透析袋透析，且干燥处理得到抗氧化多肽。本发明立足于寻找天然高效的抗氧化剂，充分利用废弃的禽蛋壳膜，通过亚硫酸钠打开蛋壳膜中顽固的二硫键，微波辅助缩短酶解时间，使用的亚硫酸钠毒性低并且易于除掉，通过碱性蛋白酶的切割条件控制，使抗氧化活性得以高效实现。

Description

蛋壳膜酶解制备抗氧化多肽的方法

技术领域

本发明涉及禽蛋加工利用技术领域，具体地指一种蛋壳膜酶解制备抗氧化多肽的方法。

背景技术

氧化对需氧生物特别是脊椎动物和人类都是一个重要的代谢过程，但同时会导致自由基的形成。自由基是高度不稳定的、易于和其他分子发生化学反应的原子、分子及带有不成对电子的离子，活性氧自由基能引起氧化应激。氧化应激涉及多种人类疾病，如癌症、动脉粥样硬化、糖尿病、神经系统疾病等。食品中，氧自由基会攻击脂质或者蛋白质导致食品产生不愉快气味，颜色发暗或质地不良。应用抗氧化剂能使人体免受氧化应激的破坏，并防止食品成分氧化变质，虽然许多人工合成的抗氧化剂能成功的清除氧自由基，但是由于它们的毒副作用使得它们的使用往往受到限制。因此，有必要开发天然的无副作用的抗氧化剂。

蛋白质水解为肽后，充分暴露了其具有抗氧化作用的基团，能更好地发挥其抗氧化作用，因此，蛋白质酶解液的抗氧化活性通常比同源的蛋白及氨基酸的抗氧化活性更强。并且，多肽在人体内的消化吸收由于同源蛋白质或游离氨基酸。生物活性肽是来自蛋白质水解产物的具有2-20个氨基酸序列的短肽，其对人体健康有很多积极作用，如抗氧化活性，抗菌活性，血管紧张素-I转化酶抑制作用，免疫调节作用等，在化妆品，食品添加剂，营养品，药品等领域都得到广泛应用。研究发现，很多不同来源的多肽都具有抗氧化能力，如水解大豆蛋白、鹰嘴豆蛋白、花生蛋白、白果蛋白、大米蛋白、猪骨蛋白、猪血血红蛋白和鸡蛋蛋白等得到的多肽都具有一定的抗氧化性。

我国鸡蛋消费量巨大，2014年全国禽蛋产量2894.0万吨，禽蛋产量保持逐年增长趋势。在禽蛋生产和消费过程中，禽蛋壳膜大量产生，并且禽蛋壳膜主要作为废弃物处理，造成了资源浪费和环境污染。蛋壳膜含有约90％的蛋白质，包括角蛋白、胶原蛋白、唾液酸蛋白、卵清蛋白、溶菌酶、卵转铁蛋白等。蛋壳膜是一种理想的制备抗氧化多肽的原料。

蛋壳膜主要由角蛋白构成，角蛋白是硬蛋白，含有高含量的二硫键，这使得蛋壳膜分子结构紧密，不溶于水和多种溶剂，极大地限制了蛋壳膜的开发利用。当前水解蛋壳膜使用较多的方法是先采用3- 巯基丙酸打开蛋壳膜的二硫键，再进行酶解。3-巯基丙酸具有毒性，因此采用无毒或低毒的还原剂来替代3-巯基丙酸是目前蛋壳膜酶解需要解决的关键技术问题。利用现代生物技术对蛋壳膜资源进行深加工，合理的选择酶类等，通过工艺优化生物活性肽的抗氧化能力将提高蛋壳膜的利用价值。

目前国内外有部分公开发表的有关利用蛋壳膜资源提取胶原蛋白、角蛋白的研究文献，一般可采用酸碱处理法和酶解法。蛋壳膜胶原蛋白提取工艺通常采取以下工艺流程：蛋壳膜→碱法除杂蛋白→酸法或酶法提取胶原蛋白→离心→盐析→酸溶→透析→冻干。专利 CN103275205B涉及以蛋壳膜为原料，在特定频率的超声波辅助和碱性条件下进行快速的水解，并对水解液进行过滤、浓缩和纯化，得到水溶性的蛋壳膜活性肽，该项专利中反应温度高达120℃，高温不利于抗氧化多肽活性的保持。专利CN104292364B涉及一种从蛋壳膜中提取生物活性物质的方法，包括蛋壳膜的分离、粉碎，使用1-羟乙基 -3-甲基咪唑四氟硼酸盐进行预处理，采用碱性蛋白酶、胰蛋白酶进行两步酶解，加入十六烷基吡啶沉淀进行角蛋白、透明质酸、硫酸软骨素的分离，进行预处理的1-羟乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐价格昂贵，原理上可以进行回收，但是实际操作上回收困难，回收率极低，并且该方法中预处理加酶解共需18.5小时，十分耗时。蛋壳膜的酶解和生物活性物质的提取。专利CN102399281A用BaH₄在碱性条件下水解含蛋壳膜的蛋壳，然后通过超滤、干燥得到平均分子量8kDa 的多肽粉末。BaH₄遇水燃烧，与水反应生成易爆炸氢气，并且可溶性钡盐具有较强毒性。

综上所述，现有技术存在的主要缺陷为以下几点：

1)蛋壳膜常规酶解十分耗时，通常需要经过碱液高温预处理后，再经过至少12个小时的酶解，

2)现有技术水解方法使用原料为毒性物质；

3)现有方法制备的抗氧化多肽的总抗氧化能力低。

发明内容

本发明针对现有技术存在的缺陷，提供了一种蛋壳膜酶解制备抗氧化多肽的方法，该方法在微波和还原剂的辅助下进行快速的酶解，并对酶解液进行透析、冻干，得到高抗氧化活性的水溶性的蛋壳膜活性肽。该方法具有酶解时间短，无毒无污染的特点。

为实现上述目的，本发明提供的一种蛋壳膜酶解制备抗氧化多肽的方法，包括以下步骤：

1)将禽蛋壳膜粉加入水中混合均匀，得到膜粉水溶液；

2)向膜粉水溶液中加入还原剂，混合均匀，得到混合物；

3)向混合物中加入蛋白酶，酶解得到酶解液；

4)将酶解液置温度为80～95℃的热水中处理10～30min后迅速冷却，在转速为8000～10000r/min条件下离心5～20min，收集上清液，透析袋透析，且干燥处理得到抗氧化多肽。

进一步地，所述步骤1)中，禽蛋壳膜粉与水的质量比为1：15～30。

再进一步地，所述步骤2)中，还原剂为亚硫酸钠或L-半胱氨酸；混合物中，还原剂浓度为20～50mM。

再进一步地，所述步骤3)中，蛋白酶选自碱性蛋白酶或木瓜蛋白酶；加酶量是11～15U/mg(酶/壳膜粉质量)。

再进一步地，所述步骤3)中，酶解条件：

酶解温度为45～60℃，微波功率为200～600W，pH为7.5～10.0，酶解时间为3～5h。

再进一步地，所述步骤4)中，干燥处理为冷冻干燥、真空干燥和喷雾干燥中任意一种。

再进一步地，所述抗氧化多肽的分子量为3.3～14.4kDa。

本发明的有益效果在于：

本发明立足于寻找天然高效的抗氧化剂，充分利用废弃的禽蛋壳膜，通过亚硫酸钠打开蛋壳膜中顽固的二硫键，微波辅助缩短酶解时间，使用的亚硫酸钠毒性低并且易于除掉，通过碱性蛋白酶的切割条件控制，使抗氧化活性得以高效实现。

本发明使用亚硫酸钠微波辅助碱性蛋白酶酶解蛋壳膜，蛋壳膜无需预处理，简化了工艺。

本发明方法得到的蛋壳膜多肽分子量较低，具有较高的抗氧化能力，安全性高，可以应用于保健食品、化妆品等领域，实现废物利用并生产出高价值产品。

附图说明

图1为不同处理方式蛋壳膜的SEM图和宏观图；

图中，图a～c分别为未处理蛋壳膜、亚硫酸钠处理组、碱性蛋白酶处理组的扫描电镜(SEM)观察纤维结构；

图d～f分别为碱性蛋白酶处理组、亚硫酸钠处理组；碱性蛋白酶和亚硫酸钠共同处理组；

图2为亚硫酸钠碱性蛋白酶共同处理不同时间的SEM图；

图中，g-亚硫酸钠碱性蛋白酶共同处理0.5h的SEM图、h-亚硫酸钠碱性蛋白酶共同处理1h的SEM图、i-亚硫酸钠碱性蛋白酶共同处理1.5h的SEM图、j-亚硫酸钠碱性蛋白酶共同处理2h的SEM图；

图3为亚硫酸钠碱性蛋白酶共同处理不同时间的宏观图；

图中，k-碱性蛋白酶和亚硫酸钠共同处理0.5h的宏观图、l-共同处理1h的宏观图、m-共同处理1.5h的宏观图、n-共同处理2h的宏观图；

图4为不同种类的蛋白酶对蛋壳膜总抗氧化活性和水解度的影响图；

其中，图A为水解度，图B为总抗氧化活性

图5为加酶量对蛋壳膜总抗氧化活性和水解度的影响图；

其中，图A为木瓜蛋白酶，图B为碱性蛋白酶；

图6为Na₂SO₃浓度对蛋壳膜总抗氧化活性和水解度的影响图；

图7为图7是碱性蛋白酶酶解时间对酶解产物水解度和总抗氧化能力的影响图；

图8为抗氧化多肽的SDS-PAGE图；

图中，不同样品的SDS-PAGE图(蛋白标品(a)，Na₂SO₃处理组(b),碱性蛋白酶处理组(c)，碱性蛋白酶(d)，碱性蛋白酶和Na₂SO₃共同处理组(e))；

图9为抗氧化多肽的Tricine-SDS-PAGE图；

图中，不同样品的Tricine-SDS-PAGE图(蛋白标品(a)，Na₂SO₃处理组(b),碱性蛋白酶处理组(c)，碱性蛋白酶(d)，碱性蛋白酶和 Na₂SO₃共同处理组(e))。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

蛋壳膜酶解制备抗氧化多肽的方法，包括以下步骤：

1)将禽蛋壳膜粉加入水中混合均匀，得到膜粉水溶液；

2)向膜粉水溶液中加入还原剂，混合均匀，得到混合物；

3)向混合物中加入蛋白酶，酶解得到酶解液；

4)将酶解液置温度为80～95℃的热水中处理10～30min后迅速冷却，在转速为8000～10000r/min条件下离心5～20min，收集上清液，透析袋透析，且干燥处理得到抗氧化多肽。

上述方法条件参数选取的原理基础：

1、不同处理方式对蛋壳膜微观结构和宏观结构的影响

1.1方法步骤：

取1g蛋壳膜，用50ml 40mM的亚硫酸钠溶液处理4h；相同的原料，相同的料液比，将亚硫酸溶液换成碱性蛋白酶溶液，碱性蛋白酶添加量是12U/mg(酶活力/蛋壳膜质量)处理4h；相同原料，相同料液比，溶液为含有40mM的亚硫酸钠，按12U/mg(酶活力/蛋壳膜质量)加入碱性蛋白酶，处理4h。

反应结束后，对比观察溶解蛋壳膜效果。将蛋壳膜残渣洗净，烘箱40℃烘干，使用扫描电镜观察结构。

1.2结论

如图1所示：未处理蛋壳膜呈现纤维网状结构，经过亚硫酸钠处理后，纤维溶胀变粗，网络的孔变圆，孔径变大，经过碱性蛋白酶处理后，纤维丝变细，网络结构更聚集，孔径变小。

宏观实验表明，蛋壳膜分别经亚硫酸钠(图1d)、碱性蛋白酶(图 1e)处理4h，蛋壳膜溶解量很少，基本保持原有结构，而经过亚硫酸钠和碱性蛋白酶共同处理4h(图1f)后，蛋壳膜全部溶解(图1)。

2、亚硫酸钠碱性蛋白酶共同处理不同时间对蛋壳膜微观结构和宏观结构的影响

2.1方法

取1g蛋壳膜，加入50ml 40mM的亚硫酸钠，按12U/mg(酶活力 /蛋壳膜质量)加入碱性蛋白酶，分别处理0.5h、1h、1.5h、2h。反应结束后，对比观察溶解蛋壳膜效果。将蛋壳膜残渣洗净，烘箱40℃烘干，使用扫描电镜观察结构。

2.2结论

如图2所示：亚硫酸钠和碱性蛋白酶共同处理蛋壳膜，0.5h时蛋壳膜的纤维丝比碱性蛋白酶或亚硫酸钠单独处理4h要细，纤维丝的立体结构被破坏，纤维网络结构开始模糊，随着处理时间延长，纤维孔在1h时变大，1.5h之后变小，纤维结构越来越模糊。

如图3所示：碱性蛋白酶和亚硫酸钠共同处理蛋壳膜0.5h时，蛋壳膜变得轻薄呈现半透明状，基本保持完整结构，当共同处理1h 时，蛋壳膜已经溶解了50％以上，共同处理2h后，蛋壳膜只剩下少量残渣。

3、不同种类的蛋白酶对蛋壳膜总抗氧化活性和水解度的影响

3.1方法

准确称取5.000g的鸡蛋壳膜粉，按1:20的料液比加入30mM的亚硫酸钠溶液配置成鸡蛋壳膜悬浊液，调节ph至所用酶的最适pH，分别加入胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶(9U/mg)，再在各个酶的最适温度下持续震荡6h(胃蛋白酶采用 pH为2.0，酶解温度37℃，木瓜蛋白酶采用pH为6.5，酶解温度60℃，糜蛋白酶采用pH7.9，酶解温度37℃，碱性蛋白酶采用pH为8.0，酶解温度55℃，中性蛋白酶采用pH为7.5，酶解温度45℃)，取出，离心(3600g，10min)，取部分上清液测定水解度。其余上清液使用截留分子量为1KDa的透析袋在4℃下透析24h，冷冻干燥。以水解度和总抗氧化能力为指标确定鸡蛋壳膜酶解最佳用酶。

3.2结论

如图4所示，五种酶中，碱性蛋白酶酶解产物的水解度显著高于其它四种酶的酶解产物，最高达10.85％，其它四种酶的水解度在 2.68％～7.89％。木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解产物抗氧化活性最高，显著高于其它三种酶的酶解产物(p<0.05)，总抗氧化能力分别为198.00μg/ml和218.61μg/ml，所以本实验选择木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶。

4、加酶量对蛋壳膜总抗氧化活性和水解度的影响

4.1方法

在确定蛋白酶的基础上，料液比、亚硫酸钠浓度、酶解时间分别固定为1:20、30mM、6h，按3U/mg、6U/mg、9U/mg、12U/mg、15U/mg 的加酶量加入木瓜蛋白酶(图5A)碱性蛋白酶(图5B)，以水解度和总抗氧化能力为指标，确定最优的加酶量。

4.2结论

如图5B所示，底物浓度不变，碱性蛋白酶加酶量在0U/mg-6U/mg 范围内，酶解物水解度随加酶量增高呈急速上升趋势。当加酶量达到 6U/mg后，水解度趋于平稳，这可能是因为底物蛋白浓度一定，加酶量超过一定量之后达到饱和。碱性蛋白酶加酶量在0U/mg-12U/mg范围内，随碱性蛋白酶加酶量的升高，总抗氧化能力呈现上升趋势，在 12U/mg时，总抗氧化能力达到最大值230.73μg/ml，显著高于木瓜蛋白酶加酶量12U/mg时的酶解物的总抗氧化能力，因此本实验选择碱性蛋白酶加酶量为12U/mg。

5、亚硫酸钠浓度对蛋壳膜总抗氧化活性和水解度的影响

5.1方法

碱性蛋白酶加酶量为12U/mg，料液比、酶解时间分别固定为 1:20、6h，亚硫酸钠浓度分别为10mM、20mM、30mM、40mM、50mM，以水解度和总抗氧化能力为指标，确定亚硫酸钠最适浓度。

5.2结论

如图6所示，Na₂SO₃浓度在0～30mM范围内，水解度随Na₂SO₃浓度升高呈上升趋势，这表明低浓度Na₂SO₃有利于蛋壳膜酶解。因为蛋壳膜中含有大量的二硫键，使得蛋白质结构紧密而难以被酶解， Na₂SO₃可以断裂二硫键，使蛋白质更易与蛋白酶接触，有利于蛋白质与蛋白酶之间相互作用，从而加速酶解。超过30mM之后水解度呈下降趋势，这可能是因为高浓度的亚硫酸钠抑制了碱性蛋白酶的活性。Na₂SO₃浓度在0～40mM范围内，总抗氧化能力随Na₂SO₃浓度升高呈上升趋势，在40mM时达到最大值238.61μg/ml，超过40mM之后总抗氧化能力下降，因此本实验选择40mM的Na₂SO₃浓度，少量 Na₂SO₃可以通过透析、超滤等方法去除。

6、酶解时间对蛋壳膜总抗氧化活性和水解度的影响

6.1方法

碱性蛋白酶加酶量为12U/mg，料液比为1:20，亚硫酸钠浓度为 40mM，酶解时间分别为2h、4h、6h、8h、10h，以水解度和总抗氧化能力为指标，确定最佳酶解时间。

6.2结论

如图7所示：随着酶解时间延长，禽蛋壳膜的水解度上升趋势显著，水解6h水解度达到最大值11.29％，超过6h后，其水解度没有显著性差异(p＞0.05)。可能是因为最初底物浓度较高，酶与底物充分接触，随着水解时间延长，底物浓度降低，产物浓度升高，底物可水解位点的减少和产物的增多抑制了蛋白酶。总抗氧化能力随着酶解时间的延长呈现先上升后下降的趋势，在4h时达到最大值 245.88μg/ml，这可能时因为初始阶段禽蛋壳膜水解迅速，大量的肽键被水解，使得总抗氧化能力升高，水解度对酶解产物的总抗氧化能力影响显著，因为水解度显著影响肽链长度和产物的末端氨基酸残基，酶解时间延长，水解度先上升后趋于平稳，水解度升高，可能导致多肽被进一步水解成不具有抗氧化活性的短肽或者氨基酸，因此导致总抗氧化能力下降，本实验选择酶解时间4h。

7、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)

7.1方法

按照SDS-PAGE试剂盒说明书操作，简言之，将蛋壳膜水解产物以1：4比例与上样缓冲液混合。为了使蛋白质变性，将溶液煮沸 5分钟，然后用于SDS-PAGE。样品在80V的叠加电压和100V的分辨电压下进行SDS-PAGE。考马斯亮蓝G-250用作染色液。

为了进一步确定蛋壳膜水解物在15kDa以下的分子量分布，进行了小分量电泳，按照Tricine-SDS-PAGE试剂盒说明书操作，使用 16.5％的Tricine-SDS-PAGE凝胶对蛋壳膜多肽进行电泳，电泳结束后使用考马斯亮蓝G-250进行染色，分析。

7.2结论

如图8所示，Na₂SO₃处理组产物的分子量明显高于加酶组，在 130kDa附近有条带，推测是胶原蛋白的α链，在250kDa附近的条带推测是胶原蛋白的β链，在35-55kDa之间的条带推测是酶解后的角蛋白。碱性蛋白酶在25kDa附近和低于10kDa出现条带。碱性蛋白酶处理组分子量明显低于Na₂SO₃处理组，在25kDa附近和10kDa附近有条带。碱性蛋白酶和Na₂SO₃共同处理组在25kDa以下尤其是 10kDa附近的的组分含量明显高于单独碱性蛋白酶处理组和单独 Na₂SO₃处理组。

如图9所示，Na₂SO₃处理组产物主要分布于大于31kDa的部分，碱性蛋白酶处理组高于31kDa的部分少于Na₂SO₃处理组，低于 14.4kDa的部分少于碱性蛋白酶和Na₂SO₃共同处理组。碱性蛋白酶在 4kDa和31kDa处有两条条带，碱性蛋白酶和Na₂SO₃共同处理组产物的分子量主要集中在3.3-14.4kDa。

实施例1

蛋壳膜酶解制备抗氧化多肽1的方法，包括以下步骤：

1)称取50g且洁净粉碎至100目以下的蛋壳膜粉末，将禽蛋壳膜粉加入1.0kg的去离子水中混合均匀，得到膜粉水溶液；

2)向膜粉水溶液中加入5.040g的亚硫酸钠，混合均匀，得到混合物；混合物中，还原剂浓度为40M。

3)向混合物中加入14U/mg碱性蛋白酶(酶/壳膜粉质量)，在温度为55℃、微波功率为400W和pH为8.5调节下酶解4.5h得到酶解液；

4)将酶解液置温度为85℃的热水中灭酶处理15min后迅速冷却，在转速为8000r/min条件下离心10min，收集上清液，用截留分子量为1000Da的透析袋透析36h，且冷冻干燥处理得到分子量为 3.3～14.4kDa的抗氧化多肽1。

实施例2

蛋壳膜酶解制备抗氧化多肽2的方法，包括以下步骤：

1)称取50g且洁净粉碎至100目以下的蛋壳膜粉末，将禽蛋壳膜粉加入1.0kg的去离子水中混合均匀，得到膜粉水溶液；

2)向膜粉水溶液中加入5.040g亚硫酸钠，混合均匀，得到混合物；混合物中，还原剂浓度为40mM。

3)向混合物中加入12U/mg碱性蛋白酶(酶/壳膜粉质量)，在温度为55℃、微波功率为200W和pH为8.5调节下酶解4.0h得到酶解液；

4)将酶解液置温度为85℃的热水中灭酶处理15min后迅速冷却，在转速为8000r/min条件下离心10min，收集上清液，用截留分子量为1000Da的透析袋透析36h，且冷冻干燥处理得到分子量为 3.3～14.4kDa的抗氧化多肽2。

实施例3

蛋壳膜酶解制备抗氧化多肽3的方法，包括以下步骤：

1)称取50g且洁净粉碎至100目以下的蛋壳膜粉末，将禽蛋壳膜粉加入0.75kg的去离子水中混合均匀，得到膜粉水溶液；

2)向膜粉水溶液中加入5.040g的亚硫酸钠，混合均匀，得到混合物；混合物中，还原剂浓度为40mM。

3)向混合物中加入15U/mg木瓜蛋白酶(酶/壳膜粉质量)，在温度为60℃、微波功率为600W和pH为7.5调节下酶解3.0h得到酶解液；

4)将酶解液置温度为95℃的热水中灭酶处理10min后迅速冷却，在转速为10000r/min条件下离心5min，收集上清液，用截留分子量为1000Da的透析袋透析36h，且冷冻干燥处理得到分子量为 3.3～14.4kDa的抗氧化多肽3。

实施例4

蛋壳膜酶解制备抗氧化多肽4的方法，包括以下步骤：

1)称取50g且洁净粉碎至100目以下的蛋壳膜粉末，将禽蛋壳膜粉加入1.5kg的去离子水中混合均匀，得到膜粉水溶液；

2)向膜粉水溶液中加入5.040g的L-半胱氨酸，混合均匀，得到混合物；混合物中，还原剂浓度为40mM。

3)向混合物中加入11U/mg木瓜蛋白酶(酶/壳膜粉质量)，在温度为60℃、微波功率为200W和pH为7.5调节下酶解5.0h得到酶解液；

4)将酶解液置温度为80℃的热水中灭酶处理30min后迅速冷却，在转速为9000r/min条件下离心20min，收集上清液，用截留分子量为1000Da的透析袋透析36h，且冷冻干燥处理得到分子量为 3.3～14.4kDa的抗氧化多肽4。

上述实施例1～4制备抗氧化多肽与现有方法性能比较

	水解度(％)	总抗氧化能力(μg/ml)
			抗氧化多肽1	8.73	246.65
抗氧化多肽2	8.50	247.61
			抗氧化多肽3	8.37	245.61
抗氧化多肽4	8.30	243.61
			蛋壳膜酶解物	/	137.82

注：蛋壳膜酶解物由李鑫得到(李鑫,赵燕,李建科,涂勇刚.蛋壳膜中美容活性物质的提取与应用.食品工业科技,2012:427-430)。

由上表可知：本实施例制备的抗氧化多肽的总抗氧化能力远远大于蛋壳膜酶解物，其中，抗氧化多肽2总抗氧化能力最高。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (7)

1.一种蛋壳膜酶解制备抗氧化多肽的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将禽蛋壳膜粉加入水中混合均匀，得到膜粉水溶液；

2)向膜粉水溶液中加入还原剂，混合均匀，得到混合物；

3)向混合物中加入蛋白酶，酶解得到酶解液；

4)将酶解液置温度为80～95℃的热水中处理10～30min后迅速冷却，在转速为8000～10000r/min条件下离心5～20min，收集上清液，透析袋透析，再干燥处理得到抗氧化多肽。

2.根据权利要求1所述蛋壳膜酶解制备抗氧化多肽的方法，其特征在于：所述步骤1)中，禽蛋壳膜粉与水的质量比为1：15～30。

3.根据权利要求1所述蛋壳膜酶解制备抗氧化多肽的方法，其特征在于：所述步骤2)中，还原剂为亚硫酸钠或L-半胱氨酸；混合物中，还原剂浓度为20～50mM。

4.根据权利要求1所述蛋壳膜酶解制备抗氧化多肽的方法，其特征在于：所述步骤3)中，蛋白酶选自碱性蛋白酶或木瓜蛋白酶；加酶量是11～15U/mg。

5.根据权利要求4所述蛋壳膜酶解制备抗氧化多肽的方法，其特征在于：所述步骤3)中，酶解条件：

酶解温度为45～60℃，微波功率为200～600W，pH为7.5～10.0，酶解时间为3～5h。

6.根据权利要求1所述蛋壳膜酶解制备抗氧化多肽的方法，其特征在于：所述步骤4)中，干燥处理为冷冻干燥、真空干燥和喷雾干燥中任意一种。

7.根据权利要求1所述蛋壳膜酶解制备抗氧化多肽的方法，其特征在于：所述抗氧化多肽的分子量为3.3～14.4kDa。