CN110229385B - 一种耐水增强型协同抗氧化复合膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐水增强型协同抗氧化复合膜及其制备方法,步骤如下:取带膜蛋壳置于醋酸中浸泡至壳、膜分离,获得蛋壳膜粉及醋酸钙缓冲液;取蛋壳膜粉分散于去离子水中,置于高压反应釜中反应;反应后取上清液离心、过滤、透析,获得碳量子点粉末;取蛋壳膜粉分散于去离子水中,酶解,获取酶解液,离心,取上清液冷冻干燥,再用阳离子交换层析法获得抗氧化多肽;将壳聚糖溶于醋酸钙缓冲液中,加入甘油搅拌;分别加入碳量子点粉末与多肽,超声;然后或者采用3D打印机打印成透气性好的复合膜,或者倒至一次性培养皿上干燥得到复合膜。本发明的目的在于实现了蛋壳的高附加值利用,同时解决了壳聚糖薄膜机械性、耐水性差的技术问题。
Description
技术领域
本发明属于材料领域,更具体地,涉及一种耐水增强型协同抗氧化复合膜及其制备方法。
背景技术
氧化对人类是一个重要的代谢过程,但同时会导致自由基的形成,自由基是高度不稳定的,活性氧自由基能引起氧化应激,而氧化应激涉及多种人类疾病,应用抗氧化剂能使人体免受氧化应激的破坏。蛋白质水解后的多肽,就能很好地发挥抗氧化作用,而且还具有抗菌活性、免疫调节等作用,在化妆品、食品添加剂,药品领域都得到了广泛应用。
研究发现,很多不同来源的多肽都具有抗氧化能力,其中,蛋壳膜就是一种理想的制备抗氧化多肽的原料。蛋壳膜是位于蛋壳与蛋清之间的纤维质膜,富含C、N、S、P等元素,主要以碳元素和氮元素为主。蛋壳膜包含丰富的蛋白质、活性物质,被广泛用于可溶性蛋白、多肽、活性物的提取。利用蛋壳膜制备多肽,还可避免生物资源浪费及蛋壳造成的环境污染。但目前从蛋壳膜中得到的多肽的抗氧化活性还有待进一步提高。
为了让多肽产品更好地得到应用,可制备成喷雾、软膏、薄膜等形式,而制备成薄膜形式时需要加入基质,现在医学领域中常用的基质材料为壳聚糖,它具有生物相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能。壳聚糖在弱酸溶剂中易于溶解,溶解后溶液中的氨基通过结合负电子具有抑菌效果。但现有技术中大多数壳聚糖薄膜一般需要用其他交联剂或纳米材料,以增加壳聚糖的耐水性、机械性,致使制膜工艺繁琐,成本高,且具有一定的毒性作用。
此外,目前一些抗氧化性多肽制备得到的薄膜透气性、稳定性及机械性能不强,需进一步提高。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求,本发明提供了一种耐水增强型协同抗氧化复合膜及其制备方法,其目的在于解决多肽的抗氧化性提高成本高及薄膜安全环保性不高、耐水性、机械性、透气性不强的技术问题。
为实现上述目的,按照本发明的一个方面,提供了一种耐水增强型协同抗氧化复合膜的制备方法,步骤如下:
S1、蛋壳膜粉及醋酸钙缓冲液的制备
取带膜蛋壳置于醋酸中浸泡至蛋壳与蛋壳膜分离,获得蛋壳膜与蛋壳醋酸浸泡液,取所述蛋壳膜清洗干净后烘干,粉碎得蛋壳膜粉;
取所述蛋壳醋酸浸泡液搅拌至蛋壳全部溶解,过膜去除未反应的大分子物质,获得醋酸钙缓冲液;
S2、碳量子点粉末的制备
取所述步骤S1中的蛋壳膜粉分散于去离子水中,搅拌均匀,置于高压反应釜中反应;反应后取上清液离心、过滤、透析,冻干获得碳量子点粉末;
S3、抗氧化多肽制备
取所述步骤S1中的蛋壳膜粉分散于去离子水中,加入碱性蛋白酶与还原剂进行酶解,获取酶解液;将所述酶解液离心,取上清液冷冻干燥,再溶解后采用阳离子交换层析、超滤、凝胶过滤层析中的任意一种方法获得抗氧化多肽;
S4、凝胶基质液制备
将壳聚糖溶于所述步骤S1中的醋酸钙缓冲液中,加甘油搅拌至凝胶状,分别加入所述碳量子点粉末与所述抗氧化多肽,搅拌均匀,超声后获得凝胶基质液;
S5、耐水增强型协同抗氧化复合膜的制备
将所述凝胶基质液倾倒至一次性培养皿中,烘干即得耐水增强型协同抗氧化复合膜;
或在所述凝胶基质液中加入D-(+)-棉子糖后混匀,采用3D打印机打印成具有三维分层网格结构的复合膜,然后干燥即得耐水增强型协同抗氧化复合膜。
优选的,在所述分别加入碳量子点粉末与抗氧化多肽之前包括使用醋酸和/或所述醋酸钙缓冲液微调pH。
优选的,所述步骤S1中,所述醋酸的浓度为7~20%(v/v)。
优选的,所述步骤S2中,所述蛋壳膜粉与去离子水的料液比为1:(2~10)(g/ml);所述高压反应釜中的反应时间为6h~20h,反应温度为120℃~280℃。
优选的,所述步骤S3中,所述蛋壳膜粉与去离子水的料液比为1:(15~30)(g/ml),所述碱性蛋白酶的浓度为10U/mg~16U/mg;所述还原剂为亚硫酸钠或L-半胱氨酸,所述还原剂的浓度为35mM~45mM。
优选的,所述步骤S3中,所述阳离子交换层析方法采用的为Sephadex C-25阳离子交换层析柱。
优选的,所述步骤S4中,加入所述碳量子点粉末与所述抗氧化多肽后,碳量子点粉末与抗氧化多肽所占浓度分别为0.01mg/ml~2mg/ml、0.001mg/ml~2mg/ml。
优选的,所述步骤S4中,所述壳聚糖的浓度为1w/v~12%w/v,所述甘油的浓度为0.05mg/L~5mg/L,所述凝胶基质液的pH为3~7。
优选的,所述步骤S5中,所述D-(+)-棉子糖的浓度为100mM~500mM,采用3D打印机打印时,以KOH作为快速成型剂,3D打印机的参数为:打印压强为0.5bar~5bar,喷头挤出速度为2mm/s~8mm/s,喷头温度为10℃~80℃。
按照本发明的另一方面,提供了一种耐水增强型协同抗氧化复合膜,采用上述方法制得。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,能够取得下列有益效果:
(1)本发明提出了一种耐水增强型协同抗氧化复合膜的制备方法,该制备方法充分利用了蛋壳及蛋壳膜原料,用于提高复合膜抗氧化性的同时改善了壳聚糖薄膜的机械性能、耐水性、稳定性。本方法的原料蛋壳膜粉、壳聚糖等均为无毒、良好生物相容性的材料,整个制备过程中没有添加有毒或腐蚀性物质,该制备方法绿色环保,特别适用于医学领域;且该制备方法简单、实用性强,可量产。
(2)本发明采用蛋壳膜粉制备多肽,同时还采用蛋壳膜粉制备碳量子点,利用多肽与碳量子点的协同作用,提高了多肽产品的抗氧化性。并且步骤S3中还采用了阳离子交换层析、超滤、凝胶过滤层析中的任意一种方法,可以进一步提升多肽的抗氧化性。
(3)本发明创造性地利用碳量子点表面丰富的官能团在制备过程中可与壳聚糖实现一定程度上的交联效果,提高了以壳聚糖作为膜基质时的机械性能;而且碳量子点具有生物兼容性、无毒性、纳米尺寸效应,可以替代现有的纳米材料,解决了现有技术中大多数壳聚糖薄膜需要用其他具有毒性的交联剂或纳米材料的技术问题,避免了毒性危害,工艺环保安全。
(4)本发明的制备方法包括将蛋壳浸泡在醋酸中获得天然弱酸性的醋酸钙缓冲液,醋酸钙缓冲液可直接用于壳聚糖溶解,通过调节蛋壳与醋酸的比例获得合适pH的缓冲液,可以提高壳聚糖薄膜的耐水性。另外,在步骤S4中通过醋酸和/或醋酸钙缓冲液微调pH也可以提高壳聚糖薄膜的耐水性,同时钙离子的存在也可起到壳聚糖分子间的交联效果。
(5)本发明将制备得到的碳量子点粉末与多肽混合制备成凝胶后,再通过3D打印机打印成具有三维分层网格结构的薄膜,由此增强了产品的透气效果及其医学实用性。
(6)由于碳量子点具备荧光标记功能,使得该复合薄膜不仅抗氧化性好、透气性强,具备抑菌效果,同时还具备荧光标记功能,使得薄膜在医用标记领域具有较好应用前景。
(7)采用本发明方法制备的耐水增强型协同抗氧化复合膜,具有良好的稳定性、柔韧性、耐折叠能力;具有较高的DPPH清除率、还原力及ABTS清除率,有利于皮肤表面微损伤的愈合。
附图说明
图1是耐水增强型协同抗氧化复合膜制备方法的工艺流程图;
图2是实施例与对比例的DPPH自由基清除曲线图;
图3是实施例与对比例的还原力曲线图;
图4是实施例与对比例的ABTS自由基清除率曲线图;
图5是本发明耐水增强型协同抗氧化复合膜与对照组纱布的抑菌生长情况图;
图6是本发明耐水增强型协同抗氧化复合膜中碳量子点的荧光图谱;
图7为本发明耐水增强型协同抗氧化复合膜的耐水性与普通壳聚糖薄膜的对照图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提出了一种耐水增强型协同抗氧化复合膜的制备方法,图1为具体的工艺流程图,制备方法步骤如下:
首先:取新鲜禽蛋(如鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋或鹅蛋),表面洗净,去除内容物及蛋壳膜上黏附的蛋清后备用
接下来:
S1、蛋壳膜粉及醋酸钙缓冲液的制备
取带膜蛋壳置于醋酸中浸泡至蛋壳与蛋壳膜分离,获得蛋壳膜与蛋壳醋酸浸泡液,取所述蛋壳膜清洗干净后烘干,粉碎得蛋壳膜粉;
取所述蛋壳醋酸浸泡液搅拌至蛋壳全部溶解,过膜去除未反应的大分子物质,获得醋酸钙缓冲液;
S2、碳量子点粉末制备
取4g步所述骤S1中的蛋壳膜粉分散于8~40ml去离子水中,搅拌均匀,置于高压反应釜中在120℃~280℃温度中反应6h~20h;反应后取上清液离心、过滤、透析,获得碳量子点粉末;其中,离心速度为6000rpm~10000rpm,离心后取上清液过0.22μm滤膜除去难溶大分子物质,然后置于300Da~1000Da透析袋中透析48h,冻干后即可获得棕色碳量子点粉末备用。
将得到的碳量子点粉末采用硫酸奎宁作为参比物测量子产率最高值可为23.7%。相比现有技术的量子产率有所提高。
S3、抗氧化多肽制备
取所述骤S1中的蛋壳膜粉分散于去离子水中,加入碱性蛋白酶与还原剂进行酶解,获取酶解液;将所述酶解液离心,取上清液冷冻干燥,再溶解后采用阳离子交换层析、超滤、凝胶过滤层析中的任意一种方法获得抗氧化多肽;其中,蛋壳膜粉与去离子水的质量比为1:(15~30),碱性蛋白酶的浓度为10U/mg~16U/mg;还原剂为亚硫酸钠或L-半胱氨酸,还原剂的浓度为35mM~45mM。酶解时采用恒温震荡水浴酶解4h,然后在80℃下灭酶20min。优选地,阳离子交换层析方法采用的为Sephadex C-25阳离子交换层析柱。
S4、凝胶基质液制备
将壳聚糖溶于所述步骤S1中的醋酸钙缓冲液中,加甘油搅拌至凝胶状,可以用醋酸和/或醋酸钙微调pH;分别加入所述碳量子点粉末与所述抗氧化多肽,搅拌均匀,超声后获得凝胶基质液;其中,采用的壳聚糖的浓度为1w/v~12%w/v,甘油的浓度为0.05mg/L~5mg/L,所述凝胶基质液的pH为3~7,加入碳量子点粉末与抗氧化多肽后,碳量子点粉末与抗氧化多肽所占浓度分别为0.01mg/ml~2mg/ml、0.001mg/ml~2mg/ml。超声条件为40KHz条件下超声10min~100min,以除去凝胶中多余气泡备用。甘油起到保湿作用,使成型后的薄膜保湿性更好。
S5、耐水增强型协同抗氧化复合膜制备
将凝胶基质液倾倒至一次性培养皿中,烘干即得耐水增强型协同抗氧化复合膜;或者在所述凝胶基质液中加入D-(+)-棉子糖后混匀,采用3D打印机打印成具有三维分层网格结构的复合膜,然后干燥即得透气性能好的耐水增强型协同抗氧化复合膜;其中,D-(+)-棉子浓度为100~500mM,打印时以KOH作为快速成型剂,3D打印机的参数为:打印压强为0.5bar~5bar,喷头挤出速度为2mm/s~8mm/s,喷头温度10℃~80℃。
通过本发明提出的制备方法,实现了多种高分子聚合物(碳量子点、多肽、壳聚糖、D-(+)棉子糖等)组合,其中,碳量子点表面丰富挂能团且具有抗氧化性及荧光标记功能,多肽具有抗氧化性,壳聚糖具有成膜性、抑菌性,醋酸钙缓冲液作为天然弱酸缓冲液不仅可直接用于壳聚糖的溶解并且通过pH的变化可显著改善薄膜的耐水性能。通过该制备方法,得到了一种抗氧化性好,可荧光标记并且具备抑菌效果的耐水增强型复合薄膜,可以应用于皮肤抗氧化敷料及医用荧光标记。
该制备方法在使用醋酸将壳、膜分离的同时,利用蛋壳膜粉制备多肽和碳量子点的同时,还采用蛋壳制备醋酸、醋酸钙缓冲液,然后通过将多肽与碳量子点粉末两种材料结合,进一步提高了多肽产品的抗氧化性。醋酸钙缓冲液提高壳聚糖薄膜的机械性及耐水性。该制备方法采用的主要原料为带膜蛋壳,实现了蛋壳废弃物的综合利用及蛋壳膜的多次利用,提高了蛋壳废弃物的附加值。
此外,在制备碳量子点时,蛋壳膜粉是分散于去离子水中,无需添加其它无机或有机化学试剂,工艺环保,且测试得到的碳量子点的量子产率较高,最高可为23.7%。
为了提高蛋壳膜中提取的多肽的抗氧化性,步骤S2中还采用了阳离子交换层析、超滤、凝胶过滤层析中的任意一种方法。
考虑到透气性,本发明通过3D打印机将复合薄膜打印成具有三维分层网格结构,增强薄膜的透气效果及其医学实用性。在步骤S5中添加D-(+)-棉子糖就是作为增稠剂使用,更有利于膜成型。
本发明创造性地利用碳量子点表面丰富的官能团在制备过程中可与壳聚糖实现一定程度上的交联效果,解决了现有技术中大多数壳聚糖薄膜需要用其他交联剂将壳聚糖膜进行交联的技术问题,避免了毒性危害,工艺环保安全。同时通过碳量子点与壳聚糖的结合克服了以壳聚糖作为膜基质时耐水性差的缺陷,增强了复合薄膜在水中的稳定性、机械性能。由于壳聚糖的抑菌性,有利于皮肤表面微损伤的愈合。
本发明的法制备得到的耐水增强型协同抗氧化复合膜,具有良好的稳定性:在PBS溶液(PH=7.4)中浸泡12h后,仍然能具有较完整的表观形态(如图7)。同时具有良好的物理表观特性、柔韧性、耐折叠能力。还具有较高的DPPH清除率、还原力及ABTS清除率。
实施例1:
(1)取带膜蛋壳置于15%(v/v)醋酸中浸泡至蛋壳与蛋壳膜分离,获得蛋壳膜与蛋壳醋酸浸泡液,取所述蛋壳膜清洗干净后烘干,粉碎得蛋壳膜粉;取蛋壳醋酸浸泡液磁力搅拌至蛋壳全部溶解,过膜去除未反应的大分子物质,得醋酸钙缓冲液。
(2)取4g步骤(1)收集的蛋壳膜粉分散于20ml去离子水中,磁力搅拌均匀后,置于100ml具有聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中,在220℃温度下反应12h,反应后取上清液离心去除残渣,离心后取上清液过0.22μm滤膜,置于500Da透析袋中透析48h,冻干后即可获得棕色碳量子点粉末备用。
(3)取5g步骤(1)收集的蛋壳膜粉按1:20的料液比分散于去离子水中,加入12U/mg碱性蛋白酶联合40mM Na2SO3恒温震荡水浴酶解4h,获取酶解液。然后在80℃下灭酶20min,离心,取上清液冷冻干燥,再溶解后使用Sephadex C-25阳离子交换层析对蛋壳膜多肽进行分离,以获得高效抗氧化多肽。
(4)将2%w/v壳聚糖溶于步骤(1)中的醋酸钙缓冲液溶液中,加入2mg/L甘油搅拌至凝胶状,用醋酸、醋酸钙缓冲液调PH至5.7;分别加入碳量子点粉末与抗氧化多肽,加入后,碳量子点粉末与高效抗氧化多肽所占浓度分别为0.3mg/ml、0.3mg/ml,搅拌均匀,40KHz条件下超声脱气60min后获得凝胶基质液。
(5)将凝胶基质液倾倒至6孔平板(也就是一次性培养皿)中,置于烘箱4℃中干燥即得耐水增强型协同抗氧化膜。
实施例2:
(1)取带膜蛋壳置于17%(v/v)醋酸中浸泡至蛋壳与蛋壳膜分离,获得蛋壳膜与蛋壳醋酸浸泡液,取所述蛋壳膜清洗干净后烘干,粉碎得蛋壳膜粉;取蛋壳醋酸浸泡液磁力搅拌至蛋壳全部溶解,过膜去除未反应的大分子物质,得醋酸钙缓冲液。
(2)取2g步骤(1)收集的蛋壳膜粉分散于20ml去离子水中,磁力搅拌均匀后,置于100ml具有聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中,在220℃温度下反应20h,反应后取上清液离心去除残渣,离心后取上清液过0.22μm滤膜,置于500Da透析袋中透析48h,冻干后即可获得棕色碳量子点粉末备用。
(3)取5g步骤(1)收集的蛋壳膜粉按1:20的料液比分散于去离子水中,加入12U/mg碱性蛋白酶联合40mM Na2SO3恒温震荡水浴酶解4h,获取酶解液。然后在80℃下灭酶20min,离心,取上清液冷冻干燥,再溶解后使用Sephadex C-25阳离子交换层析对蛋壳膜多肽进行分离,以获得高效抗氧化多肽。
(4)将6%w/v壳聚糖溶于步骤(1)中的醋酸钙缓冲液溶液中,加入3mg/L甘油搅拌至凝胶状,用醋酸、醋酸钙缓冲液调PH至4.6;分别加入碳量子点粉末与抗氧化多肽,加入后,碳量子点粉末与高效抗氧化多肽所占浓度分别为0.3mg/ml、0.3mg/ml,搅拌均匀,40KHz条件下超声脱气60min后获得凝胶基质液。
(5)在凝胶基质液中加入350mM的D-(+)-棉子糖,采用3D打印机打印成具有三维分层网格结构的耐水增强型复合透气膜,然后干燥即可。以KOH作为快速成型剂,3D打印机的参数为:打印压强为4bar,喷头挤出速度为4mm/s,喷头温度20℃。
实施例3:
(1)取带膜蛋壳置于19%(v/v)醋酸中浸泡至蛋壳与蛋壳膜分离,获得蛋壳膜与蛋壳醋酸浸泡液,取所述蛋壳膜清洗干净后烘干,粉碎得蛋壳膜粉;取蛋壳醋酸浸泡液磁力搅拌至蛋壳全部溶解,过膜去除未反应的大分子物质,得醋酸钙缓冲液。
(2)取10g步骤(1)收集的干燥蛋壳膜粉分散于20ml去离子水中,磁力搅拌均匀后,置于100ml具有聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中,在220℃温度下反应8h,反应后取上清液离心去除残渣,离心后取上清液过0.22μm滤膜,置于500Da透析袋中透析48h,冻干后即可获得棕色碳量子点粉末备用。
(3)取5g步骤(1)收集的蛋壳膜粉按1:20的料液比分散于去离子水中,加入12U/mg碱性蛋白酶联合40mM Na2SO3恒温震荡水浴酶解4h,获取酶解液。然后在80℃下灭酶20min,离心,取上清液冷冻干燥,再溶解后使用Sephadex C-25阳离子交换层析对蛋壳膜多肽进行分离,以获得高效抗氧化多肽。
(4)将9%w/v壳聚糖溶于步骤(1)中的醋酸钙缓冲液溶液中,加入3mg/L甘油搅拌至凝胶状,用醋酸、醋酸钙缓冲液调PH至4;分别加入碳量子点粉末与高效抗氧化多肽,加入后,碳量子点粉末与高效抗氧化多肽所占浓度分别为0.3mg/ml、0.3mg/ml,搅拌均匀,40KHz条件下超声脱气60min后获得凝胶基质液。
(5)在凝胶基质液中加入250mM的D-(+)-棉子糖,采用3D打印机打印成具有三维分层网格结构的耐水增强型复合透气膜,然后干燥即可。以KOH作为快速成型剂,3D打印机的参数为:打印压强为4bar,喷头挤出速度为4mm/s,喷头温度20℃。
对比例1:
(1)取带膜蛋壳置于15%(v/v)醋酸中浸泡至蛋壳与蛋壳膜分离,获得蛋壳膜与蛋壳醋酸浸泡液,取所述蛋壳膜清洗干净后烘干,粉碎得蛋壳膜粉;取蛋壳醋酸浸泡液磁力搅拌至蛋壳全部溶解,过膜去除未反应的大分子物质,得醋酸钙缓冲液。
(2)取5g步骤(1)收集的蛋壳膜粉按1:20的料液比分散于去离子水中,加入12U/mg碱性蛋白酶联合40mM Na2SO3恒温震荡水浴酶解4h,获取酶解液。然后在80℃下灭酶20min,离心,取上清液冷冻干燥。
(3)将2%w/v壳聚糖溶于步骤(1)中的醋酸钙缓冲液溶液中,加入2mg/L甘油搅拌至凝胶状,用醋酸、醋酸钙缓冲液调PH至5.7;加入抗氧化多肽使其浓度分别为0.6mg/ml搅拌均匀,40KHz条件下超声脱气60min后获得凝胶基质液。
(4)将凝胶基质液倾倒至6孔平板(也就是一次性培养皿)中,置于烘箱4℃中干燥即得耐水增强型协同抗氧化膜。
对比例2:
(1)取带膜蛋壳置于15%(v/v)醋酸中浸泡至蛋壳与蛋壳膜分离,获得蛋壳膜与蛋壳醋酸浸泡液,取所述蛋壳膜清洗干净后烘干,粉碎得蛋壳膜粉;取蛋壳醋酸浸泡液磁力搅拌至蛋壳全部溶解,过膜去除未反应的大分子物质,得醋酸钙缓冲液。
(2)取4g步骤(1)收集的蛋壳膜粉分散于20ml去离子水中,磁力搅拌均匀后,置于100ml具有聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中,在220℃温度下反应12h,反应后取上清液离心去除残渣,离心后取上清液过0.22μm滤膜,置于500Da透析袋中透析48h,冻干后即可获得棕色碳量子点粉末备用。
(3)将2%w/v壳聚糖溶于步骤(1)中的醋酸钙缓冲液溶液中,加入2mg/L甘油搅拌至凝胶状,用醋酸、醋酸钙缓冲液调PH至5.7;加入碳量子点粉末使其浓度分别为0.6mg/ml,搅拌均匀,40KHz条件下超声脱气60min后获得凝胶基质液。
(4)凝胶基质液倾倒至6孔平板(也就是一次性培养皿)中,置于烘箱4℃中干燥即得耐水增强型协同抗氧化膜。
对比例3:
(1)取带膜蛋壳置于15%(v/v)醋酸中浸泡蛋壳与蛋壳膜分离,获得蛋壳膜与蛋壳醋酸浸泡液,取所述蛋壳膜清洗干净后烘干,粉碎得蛋壳膜粉;取蛋壳醋酸浸泡液磁力搅拌至蛋壳全部溶解,过膜去除未反应的大分子物质,得醋酸钙缓冲液。
(2)取5g步骤(1)收集的蛋壳膜粉按1:20的料液比分散于去离子水中,加入12U/mg碱性蛋白酶联合40mM Na2SO3恒温震荡水浴酶解4h,获取酶解液。然后在80℃下灭酶20min,离心,取上清液冷冻干燥,再溶解后使用Sephadex C-25阳离子交换层析对蛋壳膜多肽进行分离,以获得高效抗氧化活性多肽。
(3)将2%w/v壳聚糖溶于步骤(1)中的醋酸钙缓冲液溶液中,加入2mg/L甘油搅拌至凝胶状,用醋酸、醋酸钙缓冲液调PH至5.7;加入抗氧化活性多肽使其浓度分别为0.6mg/ml,搅拌均匀,40KHz条件下超声脱气60min后获得凝胶基质液。
(4)将凝胶基质液倾倒至6孔平板(也就是一次性培养皿)中,置于烘箱4℃中干燥即得耐水增强型协同抗氧化膜。
对比例4:
(1)取带膜蛋壳置于15%(v/v)醋酸中浸泡至蛋壳与蛋壳膜分离;取蛋壳膜清洗干净后烘干,粉碎得蛋壳膜粉。
(2)取4g步骤(1)收集的蛋壳膜粉分散于20ml去离子水中,磁力搅拌均匀后,置于100ml具有聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中,在220℃温度下反应12h,反应后取上清液离心去除残渣,离心后取上清液过0.22μm滤膜,置于500Da透析袋中透析48h,冻干后即可获得棕色碳量子点粉末备用。
(3)取5g步骤(1)收集的蛋壳膜粉按1:20的料液比分散于去离子水中,加入12U/mg碱性蛋白酶联合40mM Na2SO3恒温震荡水浴酶解4h,获取酶解液。然后在80℃下灭酶20min,离心,取上清液冷冻干燥,再溶解后使用Sephadex C-25阳离子交换层析对蛋壳膜多肽进行分离,以获得高效抗氧化活性多肽。
(4)将2%w/v壳聚糖溶于醋酸中使其PH为5.7,加入2mg/L甘油搅拌至凝胶状;分别加入碳量子点粉末与抗氧化多肽,加入后,碳量子点粉末与高效抗氧化多肽所占浓度分别为0.3mg/ml、0.3mg/ml,搅拌均匀,40KHz条件下超声脱气60min后获得凝胶基质液。
(5)将凝胶基质液倾倒至6孔平板(也就是一次性培养皿)中,置于烘箱4℃中干燥即得耐水增强型协同抗氧化膜。
获取三个实施例及四个对比例的产品后,进行测试实验以验证抗氧化性、抑菌性及耐水性。
本发明对得到的复合薄膜也进行了荧光标记的效果测定,具备荧光标记功能。
测试实验1—清除DPPH自由基能力的测定
取0.6g的实施例1、对比例1、2、3的最终样品,分别加入2mL 0.1mM的DPPH溶液(溶于95%乙醇),混匀后于暗处室温反应30min,然后读取在517nm处的吸光值。吸光值越低表示DPPH清除活性越高。
DPPH自由基清除能力%=(空白吸光值-样品吸光值)/空白吸光值×100%
测试实验2—还原力的测定
测试原理为样品将铁氰化钾还原成亚铁氰化钾,亚铁氰化钾再与三氯化铁反应生成普鲁士蓝(亚铁氰化铁)。取0.6g的实施例1、对比例1、2、3的最终样品分别加入2.5mL0.2mL pH 6.6的磷酸缓冲液和2.5mL 1%的铁氰化钾溶液,混匀后50℃水浴20min。取出后冷水冷却,加入2.5mL 10%的三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀后于3000g离心10min。取上清液2.5mL,加入2.5mL去离子水和0.5mL 1%的三氯化铁溶液充分混匀,在室温下反应10min后,于700nm波长测定吸光度,还原力即用700nm波长处吸光值表示。
测试实验3—ABTS自由基清除能力测定
配置ABTS自由基储备液,使ABTS和过硫酸钾的终浓度分别为7mmol/L和2.45mmol/L,在室温、避光条件下放置12-16h,形成ABTS自由基储备液。使用时用0.1M pH 7.4的磷酸缓冲液将储备液稀释为工作液,使其在734nm处的吸光值为0.70±0.02。取0.6g的实施例1、对比例1、2、3的最终样品分别与3.9mL的ABTS工作液混合,混匀后避光反应6min后于734nm处读取吸光值。
公式中:As——实验组吸光值;Ac——对照组吸光值;Ab——空白组吸光值。
测试实验4——抑菌性实验
将灭菌后的一定质量的实施例1中样品浸泡在1.5mL的稀释后的菌液中,采用等质量的(包扎)纱布作为对照组,观察菌液加入网格膜状异物对细菌生长的影响。菌液中含E.coli(大肠杆菌)和Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌),起始菌液OD值为0.05,并在37℃条件下,培养24h。经24h的培养后,在无菌条件下,吸取200μL的菌液,用酶标仪分别测定其菌液的浊度。OD值代表菌的浊度,OD值越低代表经24小时的培养后细菌的浓度越低,膜起到的抑菌作用越强。
测试实验5——耐水性实验
取实施例1与对比例4获得的复合膜置于PBS(PH=7.4)中浸泡,分别在0h、2h、6h、12h时对实施例1的复合膜进行拍照;作为对比实验,分别在0h、0.5h、1h、1.5h时对对比例4获得的膜进行拍照。
测试结果:
如图2、图3、图4所示,分别以DPPH自由基清除率、还原力、ABTS自由基清除率为指标对实施例1及对比例1、2、3得到的产品的抗氧化性进行表征,其中实施例1在四项指标中均具有最高的抗氧化活性,对比例3相较于对比例2的抗氧化活性在不同程度上均具有较大提升,尤其是图4的ABTS自由基清除率。
如图5所示,本发明耐水增强型协同抗氧化复合膜与对照组纱布的抑菌生长情况图,由图可知,该复合薄膜具有抑菌效果,并且本发明的复合薄膜相对纱布来说对抑菌效果更明显。
如图6所示,耐水增强型协同抗氧化复合薄膜中碳量子点的荧光图谱,发射波长呈现荧光依赖性移动,即随着激发波长的不断增加最大发射波长向长波方向移动。在340nm处具有最大荧光强度,由此表面该复合薄膜在医用细胞呈像方面具有一定的应用潜质。
如图7所示,实施例1中的耐水增强型协同抗氧化复合膜在水溶液体系中具有更好的稳定性,在浸泡1h、2h、6h、12h后薄膜变得更加延展,仍可以保持其原有膜状形貌;而对比例4在1h时已经完全溶胀失去膜形态。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种耐水增强型协同抗氧化复合膜的制备方法,其特征在于,步骤如下:
S1、蛋壳膜粉及醋酸钙缓冲液的制备
取带膜蛋壳置于醋酸中浸泡至蛋壳与蛋壳膜分离,获得蛋壳膜与蛋壳醋酸浸泡液,取所述蛋壳膜清洗干净后烘干,粉碎得蛋壳膜粉;
取所述蛋壳醋酸浸泡液搅拌至蛋壳全部溶解,过膜去除未反应的大分子物质,获得醋酸钙缓冲液;
S2、碳量子点粉末的制备
取所述步骤S1中的蛋壳膜粉分散于去离子水中,搅拌均匀,置于高压反应釜中反应;反应后取上清液离心、过滤、透析,冻干获得碳量子点粉末;
S3、抗氧化多肽制备
取所述步骤S1中的蛋壳膜粉分散于去离子水中,加入碱性蛋白酶与还原剂进行酶解,获取酶解液;将所述酶解液离心,取上清液冷冻干燥,再溶解后采用阳离子交换层析、超滤、凝胶过滤层析中的任意一种方法获得抗氧化多肽;
S4、凝胶基质液制备
将壳聚糖溶于所述步骤S1中的醋酸钙缓冲液中,加甘油搅拌至凝胶状,分别加入所述碳量子点粉末与所述抗氧化多肽,搅拌均匀,超声后获得凝胶基质液;
S5、耐水增强型协同抗氧化复合膜的制备
将所述凝胶基质液倾倒至一次性培养皿中,烘干即得耐水增强型协同抗氧化复合膜;
或在所述凝胶基质液中加入D-(+)-棉子糖后混匀,采用3D打印机打印成具有三维分层网格结构的复合膜,然后干燥即得耐水增强型协同抗氧化复合膜。
2.如权利要求1所述的耐水增强型协同抗氧化复合膜的制备方法,其特征在于,所述步骤S4还包括:在所述分别加入碳量子点粉末与抗氧化多肽之前包括使用醋酸和/或所述醋酸钙缓冲液微调pH。
3.如权利要求1所述的耐水增强型协同抗氧化复合膜的制备方法,其特征在于,所述步骤S1中,所述醋酸的浓度为7~20%(v/v)。
4.如权利要求1所述的耐水增强型协同抗氧化复合膜的制备方法,其特征在于,所述步骤S2中,所述蛋壳膜粉与去离子水的料液比为1:(2~10)(g/ml);所述高压反应釜中的反应时间为6h~20h,反应温度为120℃~280℃。
5.如权利要求1所述的耐水增强型协同抗氧化复合膜的制备方法,其特征在于,所述步骤S3中,所述蛋壳膜粉与去离子水的料液比为1:(15~30)(g/ml),所述碱性蛋白酶的浓度为10U/mg~16U/mg;所述还原剂为亚硫酸钠或L-半胱氨酸,所述还原剂的浓度为35mM~45mM。
6.如权利要求1所述的耐水增强型协同抗氧化复合膜的制备方法,其特征在于,所述步骤S3中,所述阳离子交换层析方法采用的为Sephadex C-25阳离子交换层析柱。
7.如权利要求1所述的耐水增强型协同抗氧化复合膜的制备方法,其特征在于,所述步骤S4中,加入所述碳量子点粉末与所述抗氧化多肽后,碳量子点粉末与抗氧化多肽所占浓度分别为0.01mg/ml~2mg/ml、0.001mg/ml~2mg/ml。
8.如权利要求1所述的耐水增强型协同抗氧化复合膜的制备方法,其特征在于,所述步骤S4中,所述壳聚糖的浓度为1w/v~12%w/v,所述甘油的浓度为0.05mg/L~5mg/L,所述凝胶基质液的pH为3~7。
9.如权利要求1所述的耐水增强型协同抗氧化复合膜的制备方法,其特征在于,所述步骤S5中,所述D-(+)-棉子糖的浓度为100mM~500mM;采用3D打印机打印时,以KOH作为快速成型剂,3D打印机的参数为:打印压强为0.5bar~5bar,喷头挤出速度为2mm/s~8mm/s,喷头温度为10℃~80℃。
10.一种耐水增强型协同抗氧化复合膜,其特征在于,由如权利要求1~9任一项所述方法制得。
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