CN111393521A - 一种水母胶原蛋白的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种水母胶原蛋白的提取方法及应用。海洋生物源性胶原蛋白是一种比哺乳动物胶原蛋白更具优势的生物材料，其抗原性比陆生哺乳动物源性胶原蛋白的抗原性更弱而且容易提取。海洋生物源性胶原蛋白具有更好的生物安全性，不会引起哺乳动物源性疾病和病原体传播风险，不涉及宗教信仰问题且来源充足。本发明所涉及的水母胶原蛋白的提取方法主要包括脱盐、打浆、脱脂、碱化、酶法提取、离心、盐析、离心、沉淀复溶、碱性溶液透析、纯水透析、冷冻干燥等步骤。所提取的胶原蛋白呈现出白色丝状粉末状并聚集成白色海绵状态固体,水溶性良好，与人体胶原蛋白在组分上有极高的相似度。本发明制备的水母胶原蛋白可应用于创面修复材料、人工皮肤、美容面膜、化妆品、可植入医疗材料、保健食品等产品领域。

Description

一种水母胶原蛋白的提取方法

技术领域

本发明涉及一种胶原蛋白的提取方法及应用，具体来说，涉及一种水母来源的胶原蛋白的提取方法。所得的水母胶原蛋白与人体胶原蛋白在组分上有极高的相似度，在医疗、美容、保健等领域具有巨大的应用潜力。

1、背景技术

目前市面上绝大多数的胶原蛋白产品是从陆生哺乳动物(如牛和猪)的毛皮、肌腱等部位提取的胶原蛋白。然而，近年来陆生哺乳动物传染病如牛海绵状脑病(BSE)、可传播性海绵状脑病(TSE)和口蹄疫(FMD)等的爆发，已增加了人们对使用陆生哺乳动物生物材料产品而致病的担忧。而且由于宗教信仰原因，印度教禁止使用牛源性蛋白，伊斯兰和犹太文化禁止猪胶源性蛋白。另外，陆生哺乳动物蛋白纯化困难且昂贵，因此寻找新型生物胶原蛋白材料，逐步替代陆生哺乳动物源性胶原蛋白材料势在必行。

海洋生物源性胶原蛋白是一种比哺乳动物胶原蛋白更具优势的生物材料，有文献报道海洋生物来源的胶原蛋白在伤口愈合应用中表现出更令人满意的生物相容性。其抗原性比陆生哺乳动物源性胶原蛋白的抗原性更弱，且更易提取；并具备较高的水溶解度；更值得一提的是它的生物安全性：海洋生物来源生物材料不会引起动物源性疾病和病原体传播风险；不涉及宗教信仰问题且来源充足。因此，海洋生物来源的胶原蛋白修复材料是一种具有广阔开发前景的生物材料，有待成为更优越的新型修复医疗产品，已引起广大生物研究人员和医疗工作者的关注。

此外，当前国内外糖尿病患者数量显著增多，因组织修复异常而引发糖尿病难愈皮肤溃疡创面等严重并发症，导致高截肢率，给患者与家庭带来巨大的经济损失，同时造成国家医疗开支的严重负担；且临床尚缺乏切实有效的治疗方法，极大影响患者生存质量。近年来，动物来源的多种新型生物材料，在创伤修复的治疗中得到广泛应用，展现良好的临床应用前景。例如胶原蛋白，具有良好的生物组织相容性、生物降解安全性、凝血性等多种生物学活性，且低毒、抗原性弱，并可促进细胞生长、诱导创伤修复(Werkmeister JA,et al,Development of monoclonal antibodies to collagens for assesing host-implantinteractions,J.Biomed.Mater.Res.,1989,23,273-283)。胶原蛋白具有的三螺旋结构，可作为组织工程的支架材料，能被宿主同化、吸收，表现出良好的生物相容性；胶原蛋白亦可被胶原酶降解，肽链断裂，螺旋结构破坏，水解片段在体温条件下能进一步降解为寡肽或氨基酸，可以再次被利用或被排出体外，对机体无害(史宏灿等，人工气管组分材料胶原蛋白/羟基磷灰石及聚乙丙交酯在大鼠体内的降解，中国组织工程研究与临床康复，2007，35，7090-7093)。血管内膜损伤后暴露出内膜下胶原，可激活局部凝血过程，因此天然的胶原蛋白是良好的止血剂；胶原蛋白分子大，结构序列重复，机体一般不对其产生慢性排斥反应，由胶原制备的异体组织可以长期植入人体；胶原蛋白用作细胞生长的支架，能诱导上皮细胞、血管内皮细胞等增殖、分化和迁移，在创面愈合的再生与塑形阶段，胶原蛋白和修复细胞的相互作用是重要的生物过程(Gelse K.et al，Collagens-structure，function，andbiosynthesis，Adv.Drug Deliv.Rev.，2003，55，1531-1546)。

理想的创面敷料应具有以下特点：1、良好的生物相容性；2、良好的亲和性，能均匀、紧密地黏附在创面上；3、有良好的透水、透气功能，使伤口保持适度湿润、微酸、低氧环境； 4、阻止细菌侵入和抑菌；5、控制和吸收创面渗液；6、促进肉芽和上皮组织正常生长，促进创面愈合，不留瘢痕；7、具有一定的机械强度、柔软、不易产生变形。随着科学技术的不断进步，对生物材料认识的不断深入，生物技术、化学工艺、临床应用等多学科共同交流探索的不断加强，人们发现以各种先进胶原蛋白制成的创面辅料基本符合上面的所有要求。

2、发明内容

本发明提供了一种水母胶原蛋白的简易提取方法，主要工艺流程包括脱盐、打浆、脱脂、碱化、酶法提取、离心、盐析、离心、沉淀复溶、碱性溶液透析、纯水透析、冷冻干燥等步骤。所提取的胶原蛋白呈现出白色丝状粉末状并聚集成白色海绵状态固体,水溶性良好，与人体胶原蛋白在组分上有极高的相似度。本发明所制得的水母胶原蛋白除了可应用于上述的创面修复领域，还可广泛应用于人工皮肤、美容面膜、化妆品、可植入医疗材料、保健食品等产品领域。

3、具体实施方式(水母胶原蛋白的提取方法和检测鉴定)

3.1水母的基本组成成分

水母富含大量的水和盐，其中含水分最多，占76.21％；盐分占21.73％，固形物仅占2.16％。而蛋白质是占固形物最多的组分，占固形物84.33％；脂肪占固形物0.55％。脂肪虽然含量少，但对胶原的提取有很大影响。脂肪对胶原溶解度影响大，易与胶原蛋白黏连，致使胶原溶解度下降，所以为避免上述情况出现，需要脱脂。碱处理：用于除去大量非胶原蛋白。

3.2水母胶原蛋白的提取工艺流程

水母胶原蛋白的变性温度比较低，一般在25℃，因此提取及提取前处理一般均在低于15℃的条件下进行。优化提取流程，提高提取效率，防止胶原降解。

新鲜水母→预处理：脱盐、打浆、脱脂、碱化→酶法提取(胃蛋白酶)→离心→盐析→离心→沉淀复溶→碱性溶液透析→纯水透析→冷冻干燥

3.2.1预处理

(1)取新鲜水母，用自来水清洗3次，将污垢、沙粒和水母排泄物清洗干净。于5倍以上体积双蒸水浸泡2天，每2-3小时换水一次。48小时后用，用AgNO3溶液检测浸泡液，检测水中氯离子含量，以无肉眼可见白色混浊为标准。

(2)将已经脱盐的水母剪碎，后用搞拌机搅碎成0.1×0.1CM左右小颗粒，并用四层纱布过滤、沥干水分。

(3)向沥干水分的水母匀浆中加入5倍体积丙酮(或丁酮)，搅拌均匀。浸泡1天后，从丙酮(或丁酮)中取出样品，双蒸水冲洗至无味，并用四层纱布过滤、沥干水分。

(4)向沥干水分的水母匀浆加入5倍体积磷酸氢二钠，搅拌均匀。浸泡2天后，从磷酸氢二钠中取出样品，双蒸水冲洗至中性，并用四层纱布过滤、沥干水分。

3.2.2酶法提取

(1)向沥干水分的水母匀浆加入含1.5％胃蛋白酶的0.05mmol/l柠檬酸溶液，料液比1:2-1:3。于15℃，摇床摇匀，酶消化提取12小时。后于4℃，13000g，离心30min，并取上清。

(2)向上清液加入氯化钠，至浓度为2.0mol/l,充分搞拌后摇床摇8-12小时。后于4℃， 13000g，离心30min，取沉淀物，沉淀物用双蒸水溶解。

(3)复溶液装入50KD透析袋，先用0.02mol/l磷酸氢二钠透析2天，透析液量为袋内液量的5-10倍，透析过程每8小时更换透析液一次。后用双蒸水透析2天，透析液量为袋内液量的5-10倍，透析过程每8小时更换透析液一次。

(4)将透析后的复溶液分装于干燥容器中，冷冻干燥12小时，制备出成品为白色海绵状固体。

(5)水母胶原蛋白提取率的计算：将冷冻干燥后的胶原蛋白称重，并按以下公式计算胶原蛋白提取率：

水母胶原蛋白提取率(％)＝提取物干重(g)×羟脯氨酸含量(％)×11.1÷水母干重(g)× 100％

3.2.3水母胶原蛋白的SDS-PAGE分析鉴定

【1】蛋白质的浓度测定与样品配制

(1)使用BCA蛋白定量试剂盒、酶标仪测定蛋白质浓度。

①根据实验组与对照组的数量，用BCA试剂A:试剂B按照50:1的体积比，配制BCA蛋白测定工作液(现用现配)，充分混匀；

②取20μl蛋白标准品(25mg/ml)稀释至1ml，使终浓度为0.5mg/ml，按0μl、1μl、2μl、4μl、 8μl、12μl、16μl、20μl的顺序加入96孔板，不足20μl则用PBS将体积补充到20μl；

④各取20μl待测蛋白，加入96孔板，不足20μl，则加PBS将体积补充到20μl；

④各孔分别加入BCA工作液200μl，37℃温箱，孵育30min；

⑤用酶标仪检测标准品和待测样品在562nm波长处的吸光值；

⑤Excel表格制作标准曲线方程，根据标准曲线和稀释倍数，计算各样品浓度；

(2)样本的预处理：提取的蛋白经浓度测定后，与蛋白上样缓冲液(4x)混合，煮沸10min，保存于-20℃。

【2】凝胶的配制

按照下表配制8％的分离胶，5％的浓缩胶：

【3】电泳分析

①上样：用10μl移液管分别吸取处理好的样品30μl及蛋白质分子量标准10μl升，加入加样槽内。

②电泳：电泳液灌满前后槽，接通电源，恒压80V开始电泳，待样品在浓缩胶内浓缩成一条线并跑进分离胶后，将电压加大到120V继续电泳，溴酚蓝距分离胶底部大约1cm时停止电泳。

【4】分离胶的染色

将电泳液倒入回收罐中，卸下电泳槽。取下胶板，割除浓缩胶，将分离胶放置在染色缸中。先加双蒸水煮沸并保持5-10秒，后加入考马斯亮蓝染色液继续加热至沸腾，并保持10 分钟。此时，蛋白条带已清晰可见。

【5】脱色拍照

倒掉染色液，加入双蒸水加热至沸腾，并保持20秒。停止加热后，可多次换水并置于脱色摇床上轻摇，直至目的条带清晰，背景色浅或者无色。将凝胶取出拍照。

【6】水母胶原蛋白SDS-PAGE图像分析

将水母胶原蛋白海绵成品用双蒸水溶解，同时用乙酸溶解sigma鼠尾胶原蛋白海绵，并将Ph调至中性。两者同时用SDS-PAGE图谱进行分析。水母胶原蛋白电泳图谱的蛋白条带大致和sigma鼠尾胶原相似。但从蛋白定量的角度分析，水母胶原蛋白条带在75kd左右的蛋白条带颜色较深，而130kd左右的蛋白条带不如鼠尾胶原颜色深，这与相关的水产胶原蛋白基本符合，同典型Ⅰ型胶原也基本一致。

3.3水母胶原蛋白制膜的制备

利用前面所述提取方法所制备的水母胶原蛋白，可以使用常见的胶原蛋白制膜法制备水母胶原蛋白薄膜。制膜流程如下：先用所得水母胶原蛋白配制4.5％的水溶液，依次加入0.4％的淀粉作为增稠剂并搅拌，加入0.25％戊二醛作为交联剂并搅拌，加入0.25％甘油作为增塑剂并搅拌，将所得混合物先进行真空脱气，然后再用涂布机涂覆于光滑的玻璃板上，再经过常温风干再进行解膜即可得到水母胶原蛋白膜。该胶原蛋白膜可用于创面辅料，也可用于人工皮肤的基质膜材。

4、实例1：盐腌湛江地区霞水母胶原蛋白提取

(1)清洗、剪碎、挤干水分，称取盐腌水母重量295g，双蒸水浸泡，每2h换水一次。48小时后用AgNO3检测浸泡水2次，无肉眼可见白色混浊。

(2)搅碎，用四层纱布过滤、沥干，测得重量414.2g，体积425ml。

(3)水母加入5倍体积丙酮浸泡，分3罐：A组2罐150ml浸新丙酮1天，B组1罐125ml浸旧丙酮1天。

(4)从丙酮中捞取样品，双蒸水冲洗至无味，过滤、沥干，A组100.48g，100ml。B组46.75g， 50ml。A组浸泡800mlna2hpo4，B组浸泡400mlna2hpo4。

(5)从na2hpo4中捞取样品，双蒸水冲洗至A组ph7.50，B组ph7.74，过滤、沥干，A组177.48g，约200ml。B组72.97g，约75ml。

(6)A、B两组各分两份，每个组份分别加入含1.5％胃蛋白酶的0.05mmol/l柠檬酸溶液。测量8h与12h两个提取时间的提取效率。A1：85g，100ml提取12h；A2：85.74g，100ml提取8h。B1：36g，37.5ml提取12h；B2:36g,37.5ml提取8h。

(7)料液混合酶解后取液：取A1：243ml，240g，B1：81ml，80g。A2：250ml，246g，B2：112.5ml，109.4g。A2剩余35ml，B2剩余27.5ml。于4℃，13000g离心30min后：A1上清液228ml,228g；B1上清液68ml,66.68g；A2上清液220ml,217.31g；B2上清液67ml,65.71g。

(8)向粗提液加入Nacl，至浓度为2.0mol/l，于4℃，13000g离心30min后得沉淀物，溶解于0.01mol/l柠檬酸溶液，后溶液转入50KD透析袋。但B1部分样品，B2全部样品转入100-500KD透析袋(均损坏)。透析3天，透析液于4℃，13000转，离心30min，冻干。称得冻干后样品A1：0.65g，A2：0.56g，B1：0.24g，B2：0.01g。

(9)经检测，该次实验成品符合胶原蛋白特性。

5、实例2：新鲜湛江地区霞水母胶原蛋白提取

(1)将新鲜湛江地区霞水母用自来水清洗3次，双蒸水浸泡，每2h换水一次。48小时后用 AgNO3检测浸泡水1次，无肉眼可见白色混浊。称取湿重为644.11g。

(2)剪碎、搅碎，用四层纱布、毛巾过滤、沥干，测得重量77.25g，体积75ml。

(3)水母浆加入5倍体积丙酮浸泡，搅拌均匀。从丙酮中捞取样品，双蒸水冲洗至无味，过滤、沥干，称取质量为60g，体积70ml。

(4)水母浆加入5倍体积na2hpo4浸泡，搅拌均匀。从na2hpo4中捞取样品，双蒸水冲洗至 ph7.31，过滤、沥干，称取质量为29g，体积约35ml。

(5)加入含1.5％胃蛋白酶的0.05mmol/l柠檬酸溶液。经12h提取后，称得酶解混合液约 105ml，99.3g。

(6)料液混合酶解后取液：95.9g，于4℃，13000g离心30min后：上清液50ml,65.4g。

(7)向粗提液加入nacl，至浓度为2.0mol/l,得液体为72.36g，于4℃，13000g离心30min 后得沉淀物，溶解于0.01mol/l柠檬酸溶液后测重41.67g，后溶液转入50KD透析袋，透析3 天，冻干。称得冻干后样品0.53g。

(8)经检测，该次实验成品符合胶原蛋白特性。

6、实例3：新鲜湛江地区霞水母胶原蛋白提取

(1)将新鲜湛江地区霞水母用自来水清洗3次，双蒸水浸泡，每2h换水一次。48小时后用 AgNO3检测浸泡水1次，无肉眼可见白色混浊。称取湿重为765g。

(2)剪碎、搅碎，用四层纱布、毛巾过滤、沥干，测得重量104g，体积100ml。

(3)水母浆加入5倍体积丙酮浸泡，搅拌均匀。从丙酮中捞取样品，双蒸水冲洗至无味，过滤、沥干，称取质量为130g，体积125ml。

(4)水母浆加入5倍体积na2hpo4浸泡，搅拌均匀。从na2hpo4中捞取样品，双蒸水冲洗至 ph7.42，过滤、沥干，称取质量为69.31g，体积约70ml。

(5)将沥干水母分两组，一组加入含1.5％胃蛋白酶的0.05mmol/l柠檬酸溶液，一组加入含 1.5％胃蛋白酶的0.5mmol/l乙酸溶液。柠檬酸组经12h提取后，称得酶解混合液约150ml， 133g。乙酸组经20h提取后，称得酶解混合液约170m。提取时料液比为1:3。

(6)柠檬酸组料液混合酶解后取液：133g，150ml，于4℃，13000g离心30min后：上清液 110ml,113g。乙酸组料液混合酶解后取液：170ml，于4℃，13000g离心30min后：上清液114.6g,110ml。

(7)柠檬酸组向粗提液加入nacl，至浓度为2.0mol/l,得液体为124.93g,122.5ml，于4℃， 13000g离心30min后得沉淀物30.66g，溶解于0.1mol/l柠檬酸溶液。乙酸组向粗提液加入 nacl，至浓度为2.0mol/l,得液体为125.08g,120ml，于4℃，13000g离心30min后得沉淀物36.87g，溶解于0.25mol/l柠檬酸溶液。后两组溶液转入50KD透析袋，透析3天，冻干。称得冻干后样品：柠檬酸组0.76g，乙酸组0.76g。

(8)经检测，该次实验成品符合明胶蛋白特性。

7、实例4：新鲜水母胶原蛋白提取(使用回收的丙酮进行脱脂)

(1)将新鲜湛江地区霞水母用自来水清洗3次，双蒸水浸泡，每4h换水一次，每次换水量为水母5倍以上体积。48小时后用AgNO3检测浸泡水1次，无肉眼可见白色混浊。

(2)剪碎、搅碎，用四层纱布、毛巾过滤、沥干，测得重量102g，体积125ml。

(3)水母浆加入5倍体积前次实验后回收的丙酮中浸泡，搅拌均匀。从丙酮中捞取样品，双蒸水冲洗至无味，过滤、沥干，称取质量为109.43g，体积125ml。

(4)水母浆加入5倍体积na2hpo4浸泡，搅拌均匀。从na2hpo4中捞取样品，双蒸水冲洗至 ph7.32，过滤、沥干，称取质量为96.65g，体积约100ml。

(5)将沥干水母分两组，一组加入含1.5％胃蛋白酶的0.05mmol/l柠檬酸溶液，一组加入含1.5％胃蛋白酶的0.5mmol/l乙酸溶液。柠檬酸组经8h提取后，称得酶解混合液约196ml， 194.86g。乙酸组经8h提取后，称得酶解混合液约202ml，197.7g。提取时料液比为1:3。

(6)柠檬酸组料液混合酶解后取液：194.86g，196ml，于4℃，13000g离心30min后：上清液约200ml,190.45g。乙酸组料液混合酶解后取液：202ml,197.7g，于4℃，13000g离心30min后：上清液191.59g,约200ml。

(7)柠檬酸组向粗提液加入nacl，至浓度为2.0mol/l,得液体为211g,200ml，于4℃，13000g 离心30min后得沉淀物28.93g，溶解于0.1mol/l柠檬酸溶液。乙酸组向粗提液加入nacl，至浓度为2.0mol/l,得液体为212g,200ml，于4℃，13000g离心30min后得沉淀物16.16g，，溶解于0.25mol/l柠檬酸溶液。后两组溶液转入50KD透析袋，透析3天，冻干。称得冻干后样品：柠檬酸组0.53g，乙酸组0.39g。

(8)经检测，该次实验成品为胶原蛋白特性。

8、实例5：利用水母胶原蛋白制备用于创面修复的人工皮肤

利用前面所述提取方法所制备的水母胶原蛋白粉，可以制备创面辅料膜，进一步可以制备人工皮肤。制膜流程如下：先用所得水母胶原蛋白粉配制4.5％的水溶液，依次加入0.4％的淀粉作为增稠剂并搅拌，加入0.25％戊二醛作为交联剂并搅拌，加入0.25％甘油作为增塑剂并搅拌，将所得混合物先进行真空脱气，然后再用涂布机涂覆于光滑的玻璃板上，再经过常温风干再进行揭膜即可得到干燥的水母胶原蛋白膜。

然后将抗生素阿奇霉素和细胞活性修复因子烟酰胺单核苷酸溶于蒸馏水配制创面修复药液，阿奇霉素的浓度为2％，烟酰胺单核苷酸的浓度为4％，具体方法参见发明人之前的专利申请CN202010000413.5。最后将水母胶原蛋白膜浸泡于修复药液并取出，可得到用于创面修复的润湿的人工皮肤。图6是所制备的用于创面修复的人工皮肤的实物图。

9、实例6：所制备人工皮肤用于糖尿病人的创面修复

利用上述所制备的人工皮肤对广东医科大学附属医院(湛江)皮肤科的15例有皮肤创口的糖尿病进行了治疗应用。将人工皮肤剪成合适大小，敷于创面之上，并覆盖一层医用PU 膜防水保湿，每天换一次。应用结果发现对所有病例均有显著疗效，对比以往不做治疗的糖尿病人皮肤创口愈合时间可以提早8-12天。

附图说明：

图1为本发明实例中所使用的湛江地区霞水母的照片。

图2为本发明实施例2所得的水母胶原蛋白最终产品实物照片。

图3为本发明实施例2所得的水母胶原蛋白的扫描电子显微镜照片。

图4为本发明实施例2所得水母胶原蛋白和人类胶原蛋白的SDS-PAGE分析图谱对比，由图可见水母胶原蛋白和人类胶原蛋白相似度非常高。

图5为本发明实施例2所得水母胶原蛋白和人类胶原蛋白的氨基酸组分对比图谱和各种氨基酸百分比对照表，由图可见水母胶原蛋白和人类胶原蛋白相似度非常高。

图6为本发明实施例5所制备的用于创面修复的湿润人工皮肤实物图。

Claims (8)

1.一种水母胶原蛋白的提取方法及应用，其特征在于低于15℃的条件下进行提取工艺流程，包括以下步骤。

步骤1)：取新鲜水母，用自来水清洗3次，将污垢、沙粒和水母排泄物清洗干净。于5倍以上体积双蒸水浸泡2天，每2-3小时换水一次。48小时后用，用AgNO3溶液检测浸泡液，检测水中氯离子含量，以无肉眼可见白色混浊为标准。

步骤2)：将已经脱盐的水母剪碎，后用搞拌机搅碎成0.1×0.1CM左右小颗粒，并用四层纱布过滤、沥干水分。

步骤3)：向步骤2)所得的沥干水分的水母匀浆中加入5倍体积丙酮(或丁酮)，搅拌均匀。浸泡1天后，从丙酮(或丁酮)中取出样品，双蒸水冲洗至无味，并用四层纱布过滤、沥干水分。

步骤4)：向步骤3)所得的沥干水分的水母匀浆加入5倍体积磷酸氢二钠，搅拌均匀。浸泡2天后，从磷酸氢二钠中取出样品，双蒸水冲洗至中性，并用四层纱布过滤、沥干水分。

步骤5)：向步骤4)所得的沥干水分的水母匀浆加入含1.5％胃蛋白酶的0.05mmol/l柠檬酸溶液，料液比1:2-1:3。于15℃，摇床摇匀，酶消化提取12小时。后于4℃，13000g，离心30min，并取上清液体。

步骤6)：向步骤5)所得的上清液加入氯化钠，至浓度为2.0mol/l,充分搞拌后摇床摇8-12小时。后于4℃，13000g，离心30min，取沉淀物，沉淀物用双蒸水溶解。

步骤7)：把步骤6)所得的复溶液装入50KD透析袋，先用0.02mol/l磷酸氢二钠透析2天，透析液量为袋内液量的5-10倍，透析过程每8小时更换透析液一次。后用双蒸水透析2天，透析液量为袋内液量的5-10倍，透析过程每8小时更换透析液一次。

步骤8)：将步骤7)所得透析后的复溶液分装于干燥容器中，冷冻干燥12小时，制备出成品水母胶原蛋白，最终成品为白色海绵状固体。

2.根据权利要求1所述的水母胶原蛋白提取方法，其特征在于向沥干水分的水母匀浆中加入5倍体积丙酮(或丁酮)，搅拌均匀。浸泡1天后，从丙酮(或丁酮)中取出样品，双蒸水冲洗至无味，并用四层纱布过滤、沥干水分。

3.根据权利要求1所述的水母胶原蛋白提取方法，其特征在于向权利2所得的沥干水分的水母匀浆加入5倍体积磷酸氢二钠，搅拌均匀。浸泡2天后，从磷酸氢二钠中取出样品，双蒸水冲洗至中性，并用四层纱布过滤、沥干水分。

4.根据权利要求1所述的水母胶原蛋白提取方法，其特征在于向权利3所得的沥干水分的水母匀浆加入含1.5％胃蛋白酶的0.05mmol/l柠檬酸溶液，料液比1:2-1:3。于15℃，摇床摇匀，酶消化提取12小时。后于4℃，13000g，离心30min，并取上清液。

5.根据权利要求1所述的水母胶原蛋白提取方法，其特征在于向权力4所得的上清液加入氯化钠，至浓度为2.0mol/l,充分搞拌后摇床摇8-12小时。后于4℃，13000g，离心30min，取沉淀物，沉淀物用双蒸水溶解。

6.根据权利要求1所述的水母胶原蛋白提取方法，其特征在于把权力5所得的复溶液装入50KD透析袋，先用0.02mol/l磷酸氢二钠透析2天，透析液量为袋内液量的5-10倍，透析过程每8小时更换透析液一次。后用双蒸水透析2天，透析液量为袋内液量的5-10倍，透析过程每8小时更换透析液一次。

7.基于权利1所述水母胶原蛋白的人工皮肤，其特征在于把所得到的水母胶原蛋白粉制备成创面辅料膜，并吸取2％的阿奇霉素和4％的烟酰胺单核苷酸混合药液，得到用于创面修复的润湿人工皮肤。

8.根据权利要求1所述的水母胶原蛋白提取方法，将所制备的水母胶原蛋白应用于医用材料、化妆品、保健食品、食品包装等产品领域。

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