CN115400271B - 干细胞复合物及其制备方法和pga在治疗骨骼或器官损伤的产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种干细胞复合物及其制备方法和PGA在治疗骨骼或器官损伤的产品中的应用，涉及医用材料的技术领域。将PGA应用于治疗骨骼或器官损伤的产品中，PGA作为起主要或辅助治疗作用的干细胞的载体，能够使产品中的干细胞有效地贴附于损伤部位，使干细胞充分的发挥治疗效果，缓解了现有技术中存在的干细胞无法长时间并且有效地贴附于作用部位，致使干细胞无法发挥其相关功能的技术问题。

Description

干细胞复合物及其制备方法和PGA在治疗骨骼或器官损伤的 产品中的应用

技术领域

本发明涉及医用材料技术领域，尤其是涉及一种干细胞复合物及其制备方法和PGA在治疗骨骼或器官损伤的产品中的应用。

背景技术

间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)，现在越来越多的应用于临床研究中，其不但具有良好的免疫调节功能，而且具备促进血管再生、加速分化重建的能力，可以分化为不同的细胞类型，如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、肝细胞等。干细胞移植需要生物支架材料作为支撑，生物支架材料可为干细胞提供三维生长空间，使干细胞移植后在治疗部位停留足够时间发挥作用，也可以调节干细胞的相关功能。支架材料需要具备生物相容性、可降解性、良好的力学性能、孔隙结构及渗透率等。

目前生物支架材料多采用透明质酸，透明质酸(hyaluronicacid，HA)是一种天然线性多糖，由于其具有生物相容性、生物可降解性、无毒、无免疫原性、高度亲水性，被广泛用于生物医学领域。HA不但可以预防术后的粘连和促进皮肤伤口的愈合，而且与干细胞复合后可以使干细胞达到定向和定时释放的目的。所以，以HA为基础合成支架材料，并与干细胞结合成复合材料用于移植治疗具有广泛应用前景。但是HA以液态及流体为主，在干细胞移植过程中，常出现作用部位的移位，因为流体的移动性，使干细胞无法长时间，有效地贴附于作用部位，致使干细胞无法发挥其相关功能，尤其是在心脏、肺脏等器官，器官活动度比较大，流体结构不能准确且持续性贴附于作用部位，从而极大地降低了干细胞作用时间。现阶段，仍缺少有效的干细胞生物材料支架，能够使干细胞持续有效地贴附于作用部位。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供PGA在制备用于治疗骨骼或器官损伤的产品中的应用，缓解了现有技术中存在的干细胞无法长时间，有效地贴附于作用部位，致使干细胞无法发挥其相关功能的技术问题。并且基于上述应用的发明构思，本发明的目的还在于提供干细胞复合物及其制备方法，以及它们的应用。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种PGA在制备用于治疗骨骼或器官损伤的产品中的应用；所述器官包括心脏；所述产品还包括干细胞，所述PGA为干细胞的载体。

优选地，所述干细胞选自间充质干细胞。

优选地，所述产品还包括透明质酸或其衍生物；

优选地，所述产品中还包括透明质酸水凝胶。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种干细胞复合物，所述干细胞复合物包括PGA和吸附于PGA的干细胞；

优选地，所述干细胞选自间充质干细胞。

优选地，所述干细胞复合物还包含透明质酸或其衍生物；

优选地，所述干细胞复合物中含有透明质酸水凝胶；

优选地，干细胞与透明质酸水凝胶混合后，吸附于PGA；

优选地，干细胞与透明质酸水凝胶的混合体系中，干细胞密度为1～10×10⁵/mL；

优选地，所述透明质酸水凝胶中，透明质酸含量为0.5～2％w/v，优选为1％w/v。

优选地，所述PGA为片状型；

优选地，片状型的厚度为0.3～0.4毫米。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了上述干细胞复合物的制备方法，包括将干细胞吸附于PGA。

优选地，包括将干细胞与透明质酸水凝胶的混合物吸附于PGA；

优选地，将干细胞与透明质酸水凝胶的混合物滴加于PGA后静置5～10min；

优选地，将干细胞制备成干细胞悬液，然后与透明质酸水凝胶混合，使干细胞与透明质酸水凝胶的混合体系中干细胞的密度为1～10×10⁵/mL。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了上述干细胞复合物，或上述干细胞复合物的制备方法在制备用于治疗骨骼或器官损伤的产品中的应用。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种用于治疗骨骼或器官损伤的产品，该产品包含上述干细胞复合物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的PGA在制备用于治疗骨骼或器官损伤的产品中的应用中，PGA用于作为起主要或辅助治疗作用的干细胞的载体，以PGA作为载体具有如下优势：

(1)良好的生物相容性：PGA已经应用于临床工作多年，其具有良好的生物相容性，已被证明其对生物机体没有任何损伤及影响，且与透明质酸具有极好的亲和性，其对干细胞的功能及释放亦没有任何影响。

(2)良好的伸展性和贴附性：PGA通过加热纤维集合体并压接后制成无纺布装，蜂窝状微孔结构，具有一定的延展性和伸缩性；PGA具有良好的亲水性，且通过吸水后其张力强度会迅速消失，从而使其能够完全贴附于作用部位。在37℃的生理盐水中，在第10天时的拉伸强度为初期的50％，第20天时为20％，第30天时则降低至零，所以PGA与干细胞复合后，能够紧紧贴附于作用部位。

(3)良好生物降解性：干细胞生物材料支架在完成其作用及功能后需要自身降解，避免其留置机体内影响机体功能。PGA吸水后分解，最终会被人体组织吸收，且不会残留任何有害物质。其在体内大约15周会被完全吸收，且对机体不会产生任何影响。

(4)良好的稳定性：PGA性能非常稳定，不会因为体内温度、湿度等作用出现其本身性能的变化。

基于以PGA作为载体的干细胞复合物，能够使其中的干细胞有效地贴附于损伤部位，使其中的干细胞充分的发挥治疗效果，经实验验证，将基于以PGA作为载体的干细胞复合物移植至心肌梗死模型小鼠患处，能够有效缓解心肌梗死症状；移植至骨骼损伤处，能够显著促进骨折断端的修复和再生。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A为实施例1中不同密度的间充质干细胞体外的荧光显示情况；

图1B为实施例1中不同密度的间充质干细胞在实验动物体内的荧光显示情况；

图1C为实施例1中各密度间充质干细胞的荧光强度的统计结果；

图1D为实施例1中小鼠移植表达荧光的间充质干细胞后IVIS活体成像系统的检测结果；

图2A为实施例2中水凝胶和MSCs/HA复合物的电镜照片；

图2B为实施例2中水凝胶和MSCs/HA复合物细胞活性的免疫荧光检测结果；

图2C为实施例2中流式细胞术检测细胞周期的检测结果；

图2D为实施例2中MSCs/HA复合物迪夫染色的病理检测结果；

图2E为实施例2中MSC/HA中的间充质干细胞和独立的间充质干细胞COL2A1、AGG、RUNX2和SOX9的基因表达水平；

图2F为实施例2中MSC/HA中的间充质干细胞和独立的间充质干细胞CD40、CD80和CD86分子的表达水平；

图3A和3B为实施例3中小鼠构建心肌梗死模型、干细胞移植的实验过程，以及间充质干细胞PGA复合物(MSC/HA-PGA)移植后的情况；

图3C为实施例3中小鼠构建心肌梗死模型后，试验组和对照组分别在5天和15天后的心肌损伤情况；

图3D为实施例3中小鼠构建心肌梗死模型后，试验组和对照组分别在5天和15天后的心肌梗死后心肌纤维化程度分析结果；

图4A和图4B为实施例4中小鼠肋骨骨折模型构建过程；

图4C为实施例4中光镜软骨病理检测结果；

图4D～4G为实施例4中光镜软骨检测结果评分统计；

图4H为实施例4中软骨的PCA(Principal Component Analysis)结果；

图5A为PGA补片；

图5B为PGA补片局部放大图；

图5C为人胎盘间充质干细胞凝胶制剂。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种PGA在制备用于治疗骨骼或器官损伤的产品中的应用，在所述产品中，PGA用于作为起主要或辅助治疗作用的干细胞的载体。

聚乙醇酸(Polyglycolic acid，PGA)具有良好的伸展性，是一种具有良好生物降解性和生物相容性的合成高分子材料，与传统的性能稳定的高分子材料，例如塑料、橡胶等不同，聚乙醇酸作为材料在使用到一定时间后逐渐降解，并最终变成对人体、动植物和自然环境无害的水和二氧化碳。聚乙醇酸的应用主要表现在生物医学和生态学两个方面。本发明将PGA应用于治疗骨骼或器官损伤的产品中，作为干细胞的载体，能够在修复骨骼或其他器官损伤时将作为起主要或辅助治疗作用的干细胞固定于患处，能够使干细胞持续有效地贴附于作用部位，避免干细胞随着器官的位移而流动，降低干细胞在治疗过程中的损失。

当所述产品用于修复器官损伤时，所述产品尤其适用于心脏，由于心脏跳动，既往没有将干细胞固定于心脏的载体，就没有办法将干细胞稳定地贴附与梗塞的心肌表面。现有技术中存在通过心肌注射、冠脉注射、外周静脉注射等方式实现将干细胞递送至患处，但是心肌注射本身就对已经缺血缺氧的心肌造成了再次损伤；冠脉注射和外周注射均通过全身血液循环流至全身各处，只有极少量干细胞能够实现心肌损伤处定植，其实验结果及实验效果均不佳。本发明通过实验验证，将载有干细胞的PGA补片移植至心肌梗死模型小鼠能够有效缓解小鼠心肌梗死症状，以及缓解心肌梗死小鼠心肌纤维化程度，说明将PGA应用于制备治疗心肌损伤的产品中，能够使干细胞更有效地发挥其治疗作用，提高产品的治疗效果。

本发明还通过实验验证，PGA可以成功的用于制备用于治疗骨骼损伤的产品，经实验发现，将载有间充质干细胞的PGA补片移植至肋骨骨折模型小鼠的患处，能够显著促进骨折断端的修复和再生。

并且本发明还通过实验验证，将干细胞吸附于PGA，不会改变干细胞的生物学特性，且移植至体内后具有安全性，同时能够保留干细胞的有效性。综上，PGA可以作为干细胞的载体，应用于制备用于治疗骨骼或器官损伤的产品中。

本发明所述的PGA，可选地来源于市售商品，尤其是用于医疗领域的PGA商品，或者参考申请号为201811235086.0的发明专利申请中记载的PGA的制备方法制备得到：先使乙醇酸脱水缩聚得到分子量相对不高的聚合物，然后将聚乙醇酸加热分解得到两分子乙醇酸脱水形成的六员环状乙交酯，利用乙交酯开环聚合可以获得分子量大于10万的聚乙醇酸。干细胞支架材料所用的聚乙醇酸对于聚合物的分子量和熔体强度具有很高要求，适合用于熔融挤出的聚乙醇酸，特性粘度通常大于1.0dl/g。通过加热纤维集合体并压接后制成无纺布装，蜂窝状微孔结构，具有一定的延展性和伸缩性。制备成厚度为0.4毫米，直径为1cm的圆形补片，经环氧乙烷灭菌，一次性使用。

本应用的发明构思是基于PGA对干细胞在患处的固定作用，因此对于其发挥主要或辅助治疗作用的干细胞的类型不做限制。本发明经实验验证，将干细胞吸附于PGA后，生物学属性并未受到显著的影响，因此本领域技术人员可根据患处的特征，依据本领域的一般众所周知，且如各种一般和更具体的教材、参考文献、工艺手册、商品说明和标准文件等中记载的方法来进行选择干细胞的具体种类。

在一些优选的实施方式中，所述用于治疗骨骼或器官损伤的产品中还含有透明质酸或其衍生物，透明质酸是由葡萄醛酸和氨基葡糖的双糖重复单位所组成的多糖，广泛分布于软骨组织、关节液和皮肤组织的真皮以及表皮中，并在其中起到保湿、营养、修复和预防损伤等生理作用。透明质酸衍生物指的是透明质酸通过与其他物质反应，或者修饰有其他基团的得到的保留有透明质酸基本性质，同时性能得到改进的衍生物，例如透明质酸的盐。PGA与透明质酸具有极好的亲和性，透明质酸可以浸透整个PGA网格结构，凝固后在切面(或创面)形成牢固的膜，紧贴与作用部位处，而且在体内15周左右可完全降解吸收。

根据上述应用的发明构思，本发明还提供了一种干细胞复合物，所述干细胞复合物包括PGA和吸附于PGA的干细胞，其中干细胞优选为间充质干细胞。

在一些优选的实施方式中，干细胞复合物还包含透明质酸或其衍生物，其中透明质酸或其衍生物优选由透明质酸水凝胶提供，透明质酸水凝胶中透明质酸的含量优选为0.5～2％w/v，更优选为1％w/v。

在一些优选的实施方式中，所述干细胞复合物中，干细胞与透明质酸水凝胶混合后，吸附于PGA上，在干细胞与透明质酸水凝胶的混合体系中干细胞密度优选为1～10×10⁵/mL。

本发明提供的干细胞复合物中，PGA可以根据作用的部位制备成任何合适的形状，本发明对此不做限制。在一些优选的实施方式中，PGA为片状型，其厚度优选为0.3～0.4毫米。

可以理解的是，本发明提供的干细胞复合物的发明构思是基于上述PGA在制备用于治疗骨骼或器官损伤的产品中的应用的构思，因此在关于干细胞复合物的技术方案，及其优选技术特征或优选技术特征的组合也具有上述应用的有益效果，或上述应用的优选技术方案的有益效果，在此不再赘述。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种上述干细胞复合物的制备方法，该制备方法包括将干细胞吸附于PGA。

在一些优选的实施方式中，所述制备方法包括将干细胞与透明质酸水凝胶的混合物吸附于PGA，更优选将干细胞与透明质酸水凝胶的混合物滴加于PGA后静置5～10min，以使PGA充分吸收干细胞与透明质酸水凝胶的混合物。

在一些优选的实施方式中，将干细胞制备成干细胞悬液，然后与透明质酸水凝胶混合，使干细胞与透明质酸水凝胶的混合体系中干细胞的密度为1～10×10⁵/mL。

在另一些的实施方式中，干细胞与透明质酸水凝胶的混合物可选自市售的商品，例如图5C所示的人胎盘间充质干细胞凝胶制剂。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述干细胞复合物，或上述干细胞复合物的制备方法在制备用于治疗骨骼或器官损伤的产品中的应用。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于治疗骨骼或器官损伤的产品，该产品包含上述干细胞复合物。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和技术效果。

下述实施例中的间充质干细胞PGA复合物(MSC/HA-PGA)均按照如下方法制备得到：

下述实施例中间充质干细胞选自人胎盘间充质干细胞，透明质酸与无菌PBS混合，制备成1％w/v的透明质酸水凝胶。间充质干细胞经过复苏，清洗，离心后提取，与1ml的1％w/v的透明质酸(HA)混合，得到人胎盘间充质干细胞凝胶(MSC/HA)，使用1ml移液器将透明质酸与间充质干细胞混合物缓慢滴加在PGA补片上，需缓慢滴加，使补片充分吸附混合物，静置5min，使其充分吸收，本文实施例采用上述方法。

人胎盘间充质干细胞与透明质酸水凝胶的混合物也可以选用商品化人胎盘间充质干细胞凝胶(MSC/HA)(汉氏联合集团)，如图5C所示，将MSC/HA缓慢滴加在PGA补片上，需缓慢滴加，使补片充分吸附混合物，静置5min，使其充分吸收，然后将其贴附于作用部位。

下述实施例中PGA选用为可吸收性组织加固材料(奈维(片状型)，郡是株式会社)，为片状型，如图5A和5B所示。

实施例1

间充质干细胞复合物(MSC/HA)的安全性及有效性的评估。

本实施例基于生物素(Fluc)和绿色荧光(GFP)双荧光报告系统，可以实现不同荧光状态下间充质干细胞在体外的标记和定量检测，以及体内移植后的分布和含量。荧光素酶报告基因检测是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(FireflyLuciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)，可通过荧光测定仪设备测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。通过慢病毒载体pLVLTR-Fluc-eGFP对间充质干细胞复合物(MSC/HA)进行荧光转染，使其可以通过IVIS活体成像系统及荧光测定仪设备测定其分布和含量。将慢病毒载体pLVLTR-Fluc-eGFP转染至间充质干细胞中，转染结果如图1A～1C所示，可以看出，慢病毒载体pLVLTR-Fluc-eGFP成功的转染至间充质干细胞中，荧光测定仪设备可以成功的检测到荧光信号，且荧光信号随着细胞密度的增加和增强，如图1A所示，各孔细胞密度依次为6.25×10³、1.25×10⁴、2.5×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、和2×10⁵，荧光强度随着细胞密度的增大而增强，其荧光强度统计结果如图1C所示。图1B为：通过IVIS活体成像系统及荧光测定仪设备，检测不同密度的间充质干细胞在实验动物体内的荧光显示，可见荧光强度随着细胞密度的增大而增强。

将成功转染了慢病毒载体pLVLTR-Fluc-eGFP的间充质干细胞按照上述方法制备得到间充质干细胞复合物MSC/HA(间充质干细胞和HA的混合物)，然后移植至小鼠体内，移植方法如下：将0.5ml的MSC/HA进行小鼠一侧腹部的皮下注射，对侧腹部注射等量的HA。

移植结果如图1D所示，可以看出移植后可以从小鼠体内观测到荧光，且MSC/HA移植至小鼠体内后未见排异反应，MSC/HA的动态代谢，及机体的安全性评价均良好。

实施例2

MSC/HA-PGA细胞生物学表型稳定性分析：

分析结果如图2A～2F所示，用PGA与1％的HA水凝胶成功构建了间充质干细胞复合物(MSC/HA-PGA)，并进行MSC/HA-PGA复合物细胞生物学表型稳定性分析，无论是电镜结构、细胞相关表型的表达情况等均显示MSC/HA-PGA中的间充质干细胞的生物学属性并未受到显著的影响。

由图2A可以看出MSC/HA-PGA的电镜结构显示间充质干细胞的形态正常；

图2B可以看出MSC/HA-PGA与MSC细胞活性的免疫荧光检测未见明显差异；

图2C为采用流式细胞术检测细胞凋亡，实验原理为在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV是一种分子量为35～36kD的Ca₂ ⁺依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。实验结果如图2C所示，在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC-/PI-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(FITC+/PI+)；而右下象限为凋亡细胞，显现(FITC+/PI-)。可以看出间充质干细胞吸附于PGA后，其细胞周期与未吸附间充质干细胞相似，并无较大差异，说明MSC/HA-PGA中的间充质干细胞的生物学属性并未受到显著的影响。

图2D为MSC/HA-PGA迪夫快速染色(Diff-Quik法)病理学检测。可见随着时间的推移MSC/HA-PGA在第10天左右出现明显的增值，20天左右达到高峰，30天左右出现活性的降低，说明MSC/HA-PGA中的间充质干细胞的生物学属性并未受到显著的影响。

图2E为分别提取间充质干细胞和MSC/HA-PGA中的间充质干细胞的总RNA，反转录后采用q-PCR检测间充质干细胞特征基因COL2A1、AGG、RUNX2和SOX9，结果显示与普通间充质干细胞，MSC/HA-PGA中的间充质干细胞的COL2A1、AGG和SOX9具有明显差异，只有RUNX2的表达未见明显差异，其差异考虑与HA自身相关，未见其对间充质干细胞的生物学属性的相关影响。

图2F为提取细胞蛋白，使用ELISA试剂盒检测MSC/HA-PGA中的间充质干细胞的标志分子的表达情况，结果显示MSC/HA-PGA中的间充质干细胞正常表达CD40、CD80和CD86分子，进一步说明间充质干细胞的生物学属性并未受到PGA显著的影响。

实施例3

MSC/HA-PGA对小鼠心肌梗死模型的有效性评价：

本实施例首先构建心肌梗死小鼠模型，然后通过比较移植PGA补片和对照组，以说明将PGA补片应用于心肌修复的技术效果。

心肌梗死小鼠模型的建立：

小鼠进行异氟烷气体麻醉：将小鼠置于气体麻醉机(chamber)中，待小鼠麻醉后，将小鼠固定在鼠板上，以胶布固定小鼠四肢，使其呈自然仰卧位。小鼠手术全程以麻醉面罩异氟烷气体吸入麻醉(不需要气管插管)。

将麻醉后的小鼠仰卧固定在鼠板上；酒精消毒小鼠切口部位皮毛；在小鼠心脏部位，即第3、4肋间隙位置，沿着腋窝与胸骨下端连线做1.5cm的切口；用3-0proline丝线打一荷包松结备用；钝性分离胸大肌肉与肋骨外肌肉；于第3、4肋间穿破肋间隙，左手迅速将心脏挤出，剥开心包。在光源下，于左心耳右下缘可见左冠状动脉；以左心耳下缘水平线为标志，在线下2mm处以6-0proline丝线结扎冠脉，进针深度1mm左右，避免刺破心脏；结扎完毕，可见左心室前壁颜色由鲜红变为暗紫至苍白色，此时进行干细胞移植操作，移植结束后快速将心脏推入胸腔；挤出胸内气体，打紧荷包关胸。摘除麻醉面罩。整个过程在1分钟之内完成。面罩摘除后，小鼠会在3-5分钟内苏醒。

实验设置对照组和试验组，试验组向心肌梗死小鼠模型移植间充质干细胞复合物(MSC/HA-PGA)，移植方法如下：将MSC/HA-PGA贴附于小鼠心脏的左心室前壁。

对照组的处理方式如下：将等量的HA缓慢滴加在PGA补片上，需缓慢滴加，使补片充分吸附混合物，静置5min，使其充分吸收，然后将其贴附于小鼠心脏的左心室前壁。

实验结果如图3A和3B所示：图3A为小鼠心肌梗死模型建模后，图3B为间充质干细胞PGA复合物(MSC/HA-PGA)移植后，可见MSC/HA-PGA可紧紧贴附于心脏表面，PGA可见蜂窝状微孔结构，具有较好的延展性。

以成功建立心肌梗死小鼠模型的时间为起始，试验组和对照组分别在第5天和第15天，随机选取各组小鼠安乐死，进行取心脏进行天狼星红染色，染色后倒置显微镜观察：Collagen I为亮红色或黄色，Collagen III位于Collagen I的周边呈绿色。

偏光显微镜观察：Collagen I：排列较为紧密，具有较强的折光性，呈现黄色或红色；Collagen II：具有较弱的折光性，呈现较多色彩的疏松网状分布状态；Collagen III：具有较弱的折光性，呈现绿色的细束状；Collagen IV：具有较弱的折光性，呈现淡黄色。

苦味酸天狼猩红染色结果如图3C(倒置显微镜)所示，A中亮色为心肌纤维化较重的区域。从A可以看出，心梗模型建模第5天，A为对照组，即未予以干细胞移植组，可见心梗区出现明显强化，心肌纤维化程度较高；B为实验组，即进行MSC/HA-PGA移植后，可见心梗区较对照组出现明显降低。

苦味酸天狼猩红染色结果心梗模型建模第15天(偏光显微镜)，C为对照组，即未予以干细胞移植组，可见心梗区出现更加明显强化，心肌纤维化程度更高；D为实验组，即进行MSC/HA-PGA移植后，可见心梗区较对照组出现明显降低。

对安乐死的小鼠的心肌纤维化程度分析，显微镜下观察心肌纤维化等病理改变。通过Image Plus 5.1软件进行分析，统计分析各组心肌组织内的胶原含量比例(CVF，CVF＝心肌纤维化面积/心肌总面积比值)。结果如图3C所示，从图3C可以看出，实验组小鼠的心肌纤维化程度较低，且随着心梗建模后时间的推移，试验组小鼠的心肌纤维化程度增长较对照组也更为缓慢。

由此说明MSC/HA-PGA移植后对心肌梗死后心肌纤维化过程中出现了直接的心肌保护作用，MSC/HA-PGA结构能够使干细胞混合物紧密贴附到损伤心肌表面，且较稳定，实验结果也显示MSC/HA-PGA具有较好的生物相容性，对干细胞的贴附非常有效，且不影响干细胞的功能。

实施例4

MSC/HA-PGA对小鼠肋骨骨折模型的有效性评价：

小鼠肋骨骨折模型构建：

大鼠肋骨骨折模型的建立方法参考Cohn等的研究。(Cohn Yakubovich D,SheynD,Bez M,et al.Systemic administration of mesenchymal stem cells combined withparathyroid hormone therapy synergistically regenerates multiple ribfractures[J].Stem Cell Res Ther,2017,8(1):51.)

实验分组分为MSC/HA-PGA(PGA)组；MSC/HA(无PGA组)；MSC(干细胞)组；移植1％透明质酸的凝胶(HA组)；空白对照组移植等体积PBS(PBS组)；以及假手术组(Sham组)。

模型构建及后续实验处理方法如下：

(1)大鼠进行异氟烷气体麻醉：将大鼠置于气体麻醉机(chamber)中，待大鼠麻醉后，将大鼠固定在鼠板上，以胶布固定大鼠四肢，使其呈自然侧卧位。大鼠手术全程以麻醉面罩异氟烷气体吸入麻醉(不需要气管插管)。

(2)胸腔部位剃毛消毒，纵向2厘米切口暴露肋骨，分别切除第5、6肋骨上长5毫米的骨段(假手术组不切除骨段)，避免伤及软骨部分。

(3)按照上述试验分组在骨折处注射填充相应制剂后，逐层缝合关胸。模型构建及实验处理如图4A、4B所示。

各试验组处理30天后，处死小鼠，采用光镜软骨检测评价标准(Mankin评分)对各组小鼠骨折处进行评分。结果如图4C所示，从图4C中可以看出：PGA组的干细胞移植后骨缺损处出现了明显的骨再生，愈合较其余各组均显示出较好的趋势，其病理学检测结果显示：PGA组其软骨再生及骨再生均显示出良好的修复能力。

对各试验组的光镜软骨检测评评分进行统计，结果如图4D～4G所示，从图中可以看出：与其余各组相比，PGA组的光镜软骨检测评评分更低，结果具有统计学意义。

图4H为光镜软骨检测的PCA(Principal Component Analysis)结果显示：与其余各组相比，PGA组较其余各组显示出良好的骨修复和再生能力，结果具有统计学意义。

综上，从图4A～4H可以看出，本实施例成功的建立了小鼠的肋骨骨折模型，骨折模型骨折断端缺损0.5cm，既往是将HA和干细胞复合物进行注射填充，但是由于液态的流动性较大，无法实现干细胞定植，其实验结果不佳。后通过间充质干细胞复合物填充于骨折断端，能够使干细胞准确、定向的释放，避免了流体结构的不稳定性。实验结果显示：干细胞移植效果较好，能够显著促进骨折断端的修复和再生。

实验方法：

(一)实施例1中的慢病毒载体pLVLTR-Fluc-eGFP的构建方法如下：

(1)慢病毒过表达质粒载体的构建：设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0％)从模板中(cDNA质粒或者文库)调取目的基因CDS区(coding sequence)连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。

(2)慢病毒干扰质粒载体的构建

合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体。

(3)慢病毒载体的包装与浓缩纯化

制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。

具体实验材料：慢病毒载体、包装细胞和菌株。

该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2，pMD2G，pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中质粒上的ZsGreen1表达框能表达绿色荧光蛋白(GFP)。细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10％FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

(4)慢病毒转染细胞：

(4.1)在2×10⁵/ml悬浮细胞中加入polybrene至6μg/ml和适量病毒，充分混匀。37℃孵育。或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。

(4.2)(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。

(4.3)继续培养3～4天。中间视细胞生长情况可传代或换液。

荧光检测采用IVIS活体成像系统。

(二)实施例2中涉及实验的实验步骤如下：

1.流式细胞仪检测细胞凋亡实验方法：

(1)收集对数生长期细胞，计数，以(1～5)×10⁵个/孔接种于6孔板，置37℃，5％CO₂条件下培养过夜，使细胞贴壁；次日更换培养液，各孔分别加入含有不同浓度茶氨酸的细胞培养液2mL/孔，继续常规培养；每24h同法换液一次。

(2)在药物处理48h后，以不含EDTA的胰酶消化并收集细胞于流式管1000r/min离心5min，弃上清。冷PBS洗涤细胞3次，离心弃上清。

(3)按照Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒的说明，向细胞中加入Bindingbuffer 150μL/管和Annexin-V 5μL/管，振荡混匀。室温、避光反应15min。

(4)再次加入Binding buffer 100μL/管和PI染料5μL/管，振荡混匀。

2.迪夫快速染色(Diff-Quik染色)方法如下：

Diff-Quik染色是在Wright染色基础上改良而来的一种快速染色方法，是细胞学检查中常用的染色方法之一。该染色液采用世界卫生组织(WHO)推荐的快速染色方法而配制，与Wright Stain类似都是利用Romanowsky Stain技术原理改良而来的，染色结果与瑞氏染色液也极其相似，但迪夫快速染色所需的时间极短，一般90s以内即可完成染色。迪夫快速染色液含固定液，主要用于血细胞涂片、骨髓涂片、阴道分泌物涂片、脱落细胞涂片。Diff-Quik染色非常适合用于批量浸染，且背景清晰无沉渣。

常规方法制备血液涂片或骨髓涂片，自然干燥或酒精灯火焰处理或Diff-QuikFixative固定20s。Diff-QuikⅠ染色5～10s(上下提动玻片2-3次，使染液均匀分布)，立即取出。Diff-QuikII染色10～20s(上下提动玻片2-3次，使染液均匀分布)，立即取出。水洗后立即趁湿在显微镜下观察。将观察后认为有价值的片子带回实验室，用二甲苯透明，封固、保存。

3.酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA或ELASA)方法如下：

ELISA指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。

间接ELISA中与包被好的抗原结合的是非酶标抗体，另外再引入第二种抗体(即二抗)。二抗是经过酶标的，它可以与第一种抗体特异性结合，最后加入底物显色并判读结果。由于二抗一般为多抗，因此，一个一抗分子上可以结合多个二抗分子，同时，一个二抗分子上可以标记上多个酶分子，所以当待测抗体为多抗时，信号经过两步放大，最终提高了检测的灵敏度。

ELISA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。

(三)实施例3中的染色实验的实验步骤如下：

苦味酸天狼猩红染色方法如下：

试剂配制：天狼星红饱和苦昧酸液＝10ml 0.5％天狼星红液+90ml苦味酸饱和液；天青石蓝液＝1.25g天青石蓝B+1.25g铁明矾+250ml蒸馏水，充分溶解后混匀、过滤，然后添加30ml甘油及0.5ml浓盐酸。

将制好的石蜡切片置于68℃，烤片1h；将烤制完成的切片放入二甲苯溶液中，充分浸泡15min，3次；置于100％酒精溶液中，充分浸泡10min，2次；置于95％酒精溶液中，充分浸泡5min，2次；置于90％酒精溶液中，充分浸泡3min；置于80％酒精溶液中，充分浸泡2min；置于70％酒精溶液中，充分浸泡1min；使用磷酸缓冲液进行冲洗，5min，3次；使用4％的多聚甲醛进行固定，15min；使用磷酸缓冲液进行冲洗，5min，3次；使用天青石蓝溶液进行染色，5-10min；使用磷酸缓冲液进行冲洗，5min，3次；使用苦味酸天狼星红溶液进行染色，15-30min；使用磷酸缓冲液进行冲洗，5min，3次；使用苏木精溶液进行复染，5-10min；置于70％酒精溶液中，充分浸泡1min；置于80％酒精溶液中，充分浸泡1min；置于90％酒精溶液中，充分浸泡1min；置于100％酒精溶液中，充分浸泡1min，2次；置于二甲苯溶液中，充分浸泡5min，2次；使用中性树脂进行封片，封片后进行显微镜观察。

(四)实施例4中染色实验的实验步骤如下：

1.铁矾苏木精伊红染色(Heidenhain染色)方法(Mankin评分)如下：

切片常规脱蜡至水；入Bouin液固定2min；蒸馏水清洗5s；媒染于5％的铁矾液1h30min，自来水清洗5s；苏木素液浸染1h 30min；自来水流水冲洗5min；2.5％铁矾液分色10min，自来水清洗5s,镜下观察结构清晰即可；自来水流水冲洗10min；1％水溶性伊红乙醇液5s；常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。Heidenhain染色法观察结果：缺血心肌、红细胞呈灰黑色；正常心肌呈红色，胞核呈灰色。

2.SafraninO-Fast Green Staining(番红O-固绿染色)的方法如下：

(1)工作液配方：

0.1％番红染液：0.1g+100ml ddw；

0.15％固绿染液：0.15g+100ml ddw；

1％冰醋酸：2ml冰醋酸+198ml ddw。

(2)步骤：烤片过夜，SafraninOstain内浸染4min，自来水中提拉3次；在固绿染色液内浸染4min，自来水洗1min；用冰醋酸溶液洗涤切片1-2min，自来水洗1min；分别用95％乙醇、无水乙醇脱水10-15s；树胶封片。

3.阿尔新蓝染色的方法如下：

阿尔新蓝(Alcian blue)：是一种能够特异性地染色软骨细胞胞外基质的染料，发育生物学研究中一般使用该染色方法检测骨骼的形成和软骨的发育情况，本研究中染色方法改良自Piotrowski等人1996年的报道。

(a)收集骨组织，转移到2ml离心管中，4％多聚甲醛4℃固定24小时以上。并用漂白溶液去除骨组织色素。dd H2O室温轻摇清洗30分钟到1小时，至骨组织沉底。

(b)置换成2ml阿尔新蓝染色液中，室温轻摇24～48小时；置换成95％乙醇，室温轻摇30分钟，并重复一次；依次置换成90％乙醇、40％乙醇和15％乙醇水化处理，室温轻摇各2小时；置换成ddH₂O清洗骨组织，室温轻摇2小时至骨组织沉底。

(c)置换成2ml染色消化液，37℃静置脱色处理，每隔一段时间观察并更换新的消化液，直至骨组织肌肉和表皮组织无蓝色存在且蓝色染色的骨骼清晰可见。

(d)染色后的骨组织可保存于纯甘油中，拍照记录。

阿尔新蓝染色液配法：10mg，阿尔新蓝染料，sigma；溶于80ml无水乙醇和20ml冰醋酸的混合溶液中。

消化液配法：1g胰酶，sigma；溶于30ml饱和硼酸钠溶液和70ml ddH₂O中。

4.光镜软骨检测评价标准(Mankin评分)的评分标准如下表所示：

表1

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (6)

1.干细胞复合物在制备用于治疗器官损伤的产品中的应用；所述干细胞复合物由PGA、吸附于PGA的干细胞和透明质酸水凝胶组成，干细胞与透明质酸水凝胶混合后，吸附于PGA；所述PGA为片状型，所处产品用于贴附于作用部位；

干细胞与透明质酸水凝胶的混合体系中，干细胞密度为1～10×10⁵/mL；所述透明质酸水凝胶中，透明质酸含量为0.5～2％w/v。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述干细胞选自间充质干细胞。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述透明质酸水凝胶中，透明质酸含量为1％w/v。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述片状型的厚度为0.3～0.4毫米。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将干细胞与透明质酸水凝胶的混合物滴加于PGA后静置5～10min。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将干细胞制备成干细胞悬液，然后与透明质酸水凝胶混合，使干细胞与透明质酸水凝胶的混合体系中干细胞的密度为1～10×10⁵/mL。