CN103285429A - 一种组织工程关节双相支架及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种组织工程关节双相支架及其制备方法和应用，所述的组织工程关节双相支架是由骨相支架和软骨相支架组成，所述的软骨相支架是PGA/PLA支架，所述的骨相支架是PCL/HA支架。本发明还提供一种细胞-组织工程关节双相支架构建物及其制备方法和应用。本发明优点在于：本发明组织工程关节双相支架是利用CAD/CAM技术制备，外部形态和内部结构精确可控，骨相和软骨相匹配，利用组织工程技术复合种子细胞形成细胞-组织工程关节双相支架构建物，在体内可以再生组织工程关节，其具有正常关节所具有的生物学及机械生物力学特性，再生骨与软骨界面整合好，为组织工程关节替代现行人工关节进行生物重建提供一种可能。

Description

一种组织工程关节双相支架及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域，具体地说，是一种组织工程关节双相支架及其制备方法和应用。这种双相支架是由骨相支架和软骨相支架组成，分别用于构建骨和关节软骨并且两者完全匹配。
背景技术
各种关节创伤、炎症、肿瘤等疾病影响着世界上数亿人的生活，并且随着人口的老龄化以及城市建设和交通的发展，这一数字还会逐年增加。上述这些疾病中晚期的治疗主要是进行人工关节置换手术，这是一种非生物意义上的治疗。目前人工关节所使用的材料主要是金属、生物陶瓷和超高分子聚乙烯，在关节使用过程中会不可避免地产生机械性磨损颗粒，而这些磨损颗粒可以导致骨溶解，最终引起人工关节松动导致手术失败；并且无论怎样提高材料性能和改善加工工艺，机械性磨损颗粒都是会不可避免产生的，因此关节松动是迟早的事情。更糟糕的是，初次人工关节置换失败后再次翻修的手术失败率更高。因此，有必要进行生物型关节的探索和研究。虽然克隆技术具有划时代的意义 ，但是也有其自身不可避免的缺陷，并且组织或者器官克隆技术远非现在的科技所能企及，遥遥无期。组织工程技术的发展为组织工程关节的再生提供了一种可能，从理论上讲在适当的关节支架上接种种子细胞，辅以细胞因子可以在体内再生组织工程关节，这是一种真正意义上的生物型关节，为组织工程关节替代现行人工关节进行生物重建病损的关节提供了一种可能。
组织工程关节大小和形态应该与正常关节精确匹配，再生的关节包括软骨和软骨下骨之间的界面与正常组织结构相似或者一致，再生组织具有正常组织所具有的生物学以及机械生物生物力学特性等。但是迄今为止，组织工程化关节的再生尚没有突破性进展。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种组织工程关节双相支架。
本发明的第二个目的是，提供一种组织工程关节双相支架的制备方法。
本发明的第三个目的是，提供一种组织工程关节双相支架的应用。
本发明的第四个目的是，提供一种细胞-组织工程关节双相支架构建物。
本发明的第五个目的是，提供一种细胞-组织工程关节双相支架构建物的制备方法。
本发明的第六个目的是，提供一种细胞-组织工程关节双相支架构建物的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种组织工程关节双相支架，所述的双相支架是由骨相支架和软骨相支架组成，所述的骨相支架是聚乳酸/聚乙醇酸（PGA/PLA）支架，所述的软骨相支架是聚ε-己内酯/羟基磷灰石(PCL/HA)支架。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的组织工程关节双相支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先激光扫描或者CT和MRI扫描，然后计算机辅助设计和三维重建关节支架，并通过计算机辅助制造快速成型技术加工制备骨相支架，以及软骨相支架模具，利用软骨相支架模具加工制备软骨相支架。骨相支架和软骨相支架组成组织工程关节双相支架，其中骨相支架是PCL/HA支架，软骨相支架是PGA/PLA支架。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：所述的组织工程关节双相支架在制备组织工程关节中的应用。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：一种细胞-组织工程关节双相支架构建物，所述的细胞-关节双相支架构建物由成骨部分和成软骨部分组成，所述的成骨部分是骨髓基质干细胞-PCL/HA骨相支架，所述的成软骨部分是软骨细胞或骨髓基质干细胞-PGA/PLA软骨相支架。
所述的成骨部分的制备方法：采用权利要求2所述的方法制备PCL/HA骨相支架，支架内接种骨髓基质干细胞，然后进行体外成骨诱导培养2-6周。
所述的成软骨部分的制备方法：采用权利要求2所述的方法制备PGA/PLA软骨相支架，支架内接种软骨细胞或骨髓基质干细胞；然后体外培养2-6周。
为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：所述的细胞-组织工程关节双相支架构建物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）采用权利要求4所述的方法制备成骨部分，PCL/HA骨相支架内接种骨髓基质干细胞，然后进行体外成骨诱导培养2-6周。（2）采用权利要求4所述的方法制备成软骨部分，PGA/PLA软骨相支架内接种软骨细胞或骨髓基质干细胞；然后体外培养2-6周。
为实现上述第六个目的，本发明采取的技术方案是：所述的细胞-组织工程关节双相支架构建物在制备组织工程关节中的应用。
本发明优点在于：
本发明组织工程关节双相支架是在基于计算机辅助设计/计算机辅助制造（CAD/CAM）技术基础上加工制备，其外部形态和内部结构都精确可控，并且骨相和软骨相支架相匹配，然后利用组织工程技术，复合种子细胞形成细胞-组织工程关节双相支架构建物，可以在体内再生组织工程关节，再生的关节软骨和软骨下骨具有正常组织所具有的生物学及机械生物力学等特性，并且两者之间界面整合良好，为将来组织工程关节替代现行人工关节进行生物重建病损的关节提供了一种可能。
附图说明
图1：组织工程股骨头再生实验流程图
山羊关节软骨细胞的分离、培养、接种到PGA/PLA支架上和体外培养（A-B1-C1-D1）；骨髓基质干细胞的分离、培养、接种到PCL/HA支架上和体外诱导培养（A-B2-C2-D2）；上述两种细胞-支架复合物组成股骨头移植物（E）；将上述移植物植入裸小鼠背部皮下10周（F）。山羊股骨头激光扫描，通过CAD/CAM技术，加工制备PCL/HA骨相支架（G-H-I-J）；此外，PGA/PLA软骨相支架是通过CAD/CAM技术制备出的模具压制而成。
图2：分A、B、C三部分
A部分：PGA/PLA和PCL/HA的表面形态以及材料的生物相容性
PGA/PLA支架大体观（A1）；扫描电镜（×200），箭头示PLA在PGA纤维上的涂层及其形成的连接，这有助于支架形状的维持（A2）；电镜下软骨细胞在支架上的粘附和伸展以及细胞外基质的形成情况（A3）。PCL/HA支架大体观（A4）；扫描电镜（×35）（A5）；电镜下（×500）骨髓基质干细胞在支架上的粘附和伸展（A6）。
B部分：不同含量的PLA和HA对PGA/PLA和PCL/HA支架特性的影响
随着PLA含量的增加，PGA/PLA支架的机械生物力学强度在增加， (图2 B1)，但是软骨细胞的接种效率却逐渐下降(图2 B2)。
同样地，随着HA含量的增加，PCL/HA支架应力应变曲线(图2 B3)显示PCL/HA支架具有更陡峭的线弹性区域以及压缩力更高的平台区域，压缩模量(图2 B4)和压缩力(图2 B5)也相应增高；吸水率也相应增加(图2 B6)。
C部分：PGA/PLA和PCL/HA支架与正常软骨和松质骨的弹性模量区间范围对比
骨髓间质干细胞(BMSCs)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞,其分化方向与所处的周围环境包括支架的弹性模量或者硬度有关。PCL/HA支架弹性模量在正常松质骨弹性模量区间范围内，这有助于进一步提高向成骨方向分化能力；PGA/PLA支架的弹性模量范围在正常关节软骨的弹性模量区间范围内，这有助于进一步提高向成软骨方向分化能力。
图3：基于CAD/CAM技术构建组织特异性双相支架
激光扫描山羊股骨头（A），扫描数据基于CAD（B，C）和CAM技术采用三维打印技术制备骨相PCL/HA支架，其下面包括手术时插入骨髓腔固定的柄，内部有相互连接的微小管道。骨相支架内部的孔径在平行于和垂直于底部的平面分别是（400±20）μm和(200±20) μm。（D，E，H）。PGA/PLA支架则是通过计算机布尔减运算获得软骨相数据，然后通过上述CAD/CAM技术三维打印加工制备软骨相支架模具，通过模具加工制备软骨相PGA/PLA支架（F，I）。构建的股骨头双相支架（G）。
图4：细胞-支架材料复合物光学显微镜下、肉眼观以及体内植入和标本取材。
关节软骨细胞-PGA/PLA支架光学显微镜下观，箭头示细胞接种2周后在支架上的粘附和生长情况（A）；BMSCs-PCL/HA支架光学显微镜下观，箭头示接种2周后BMSCs在PLC/HA支架的微小管道中的粘附和生长情况（B）；这两种细胞-支架复合物组合在一起形成了股骨头移植物（C）；裸小鼠背部皮下移植物（箭头示）（D）；10周后在股骨头移植物的关节表面再生出具有肉眼可见的软骨样组织，在PLC/HA支架的微小管道中有白色质硬骨样组织长入，（E）；股骨头整个关节面部位再生的软骨组织光滑、连续、无血管化并且很好地跟软骨下骨组织整合在一起，没有肉眼可见的裂隙和分层现象（F）。
图5：再生的软骨组织以及软骨和软骨下骨界面
软骨（A）：组织工程化股骨头整个关节表面软骨光滑、连续，再生的软骨组织中没有发现血管长入，软骨细胞在细胞外基质陷窝中。组织番红O呈阳性，提示实验组中股骨头关节面有软骨组织发生（图5A 番红O/快绿），说明再生的软骨组织具有跟正常软骨组织同样的分泌聚集蛋白聚糖功能。II型胶原免疫定位于软骨细胞的细胞外基质（图5A II型胶原）。另外，绝大部分PGA/PLA 支架材料已经降解，仅有极少量的材料纤维残留（箭头示）。
界面（B）：再生的股骨头关节表面软骨组织延伸到再生的软骨下骨部分，两者之间界面没有裂隙和分层，它们整合良好。另外，在靠近软骨下骨组织的软骨细胞呈肥大钙化。番红O阳性组织延伸到番红O阴性组织中并且两者整合良好（图5B 番红O/快绿）。
图6：再生的骨组织
常规石蜡包埋切片染色（A）：在标准石蜡包埋切片染色处理过程中PCL/HA支架材料已经被清除。再生的骨组织具有明显的骨小梁的结构，并有大量的骨细胞（苏木素-伊红，番红O/快绿，甲苯胺蓝，Goldner三色，×10），骨小梁结构表面有排列生长的柱状成骨细胞（图6A番红O/快绿×20）。骨小梁结构是松质骨首要的解剖和功能单位。极好的骨组织长入也间接表明PCL/HA支架材料的降解（箭头示）（图6A番红O/快绿×40）。另外，在再生的松质骨组织中有明显的小血管形成（图6A  苏木素-伊红×40）。再生的松质骨内具有明显的骨髓组织（图6A  Goldner三色×40）。可见典型的骨细胞（箭头示）是一种常见的细胞，它具有1-2个核仁（图6A甲苯胺蓝×40）。再生的骨组织内有由血管内皮组成的管腔内的红细胞（箭头示）（图6A苏木素-伊红×40）。高倍光学显微镜下的骨髓样组织（图6A  Goldner三色×40）。
聚异丁烯酸甲酯包埋硬组织磨片染色（B）：von Kossa染色显示在PLC/HA支架相互连接的三维微小管道中有阳性钙化沉积（图6B von Kossa×10）；甲苯胺蓝染色显示有极好的骨组织生长，并且具有骨小梁结构，箭头示PCL/HA 支架材料降解形成的孔隙（图6B 甲苯胺蓝×10）。
标尺×10: 200 μm, ×20: 100 μm, ×40: 50 μm 
图7：再生骨组织部分免疫组织化学成骨的鉴定
在成骨部分示骨桥蛋白阳性。骨桥蛋白是一种细胞外基质细胞粘附蛋白，不仅可以由前成骨细胞，成骨细胞，骨细胞生物合成，而且血管内皮细胞也可以生物合成。箭头示再生的血管组织（A）。I型胶原（B）、骨钙蛋白（C）和骨连接蛋白（D）也分别阳性表达，它们与骨组织的分布和von Kossa阳性分布区域相一致。标尺：200 μm
图8：组织学定量分析
再生的软骨部分：我们根据国际软骨修复委员会组织学分会的视觉组织学评分标准进行软骨部分评分（图8A），测量软骨细胞数/总的软骨面积（图8B）。上述定量分析实验组和正常对照组之间没有显著性差异。但实验组和对照组存在显著性差异。
再生的骨部分：我们测量了骨容量/总的组织容量（BV/TV）（图8C）、骨表面积/骨容量（BS/BV）（图8D）、总成骨细胞表面/总组织面积（Ob.S/T.Ar）（图8E）以及总血管数量/总组织面积（图8F）。上述所有测量结果在实验组和正常对照组之间没有显著性差异，但是在实验组和对照组之间存在显著性差异。
图9：机械生物力学测定
再生软骨组织的机械生物力学测定：实验组和对照组在再生软骨组织的压缩模量（图 9A）和压缩力（图 9B）方面没有显著性差异（n=10, p＞0.05）。由于对照组中没有明显软骨组织再生，所以实验组和对照组之间存在显著性差异（n=10, p＜0.05）。
再生骨组织的机械生物力学测定：实验组和正常组在压缩模量（图 9C）和压缩力（图 9D）方面没有显著性差异存在(n=10, p＞0.05)。但实验组和对照组有显著性差异存在 (n=10, p＜0.05)。实际上，由于对照组中几乎没有再生的骨组织形成，所以压缩模量和压缩力测得的实际上是尚未完全降解的PCL/HA支架及其内部长入的纤维结缔组织的压缩模量和压缩力，而不是再生的骨组织的压缩模量和压缩力。
图10：对照组组织再生情况
关节双相支架没有软骨和骨组织再生，PCL/HA支架材料表面和微小管道中只有少量纤维结缔组织生长，上面支架关节面部位的PGA/PLA支架已经消失，只有少许纤维结缔组织生长（箭头示）。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本文中所述的PGA/PLA支架是指PGA和PLA复合材料支架， PCL/HA支架是指PCL和HA复合材料支架，也即“/”是指前后二者为“和”的关系而不是“或”的关系。
实施例
1.材料和方法
1.1 总体实验设计
将20只8周龄裸小鼠（中国科学院上海实验动物中心）随机分成两组：实验组（n=10），对照组（n=10）；另外把10个10月龄的山羊股骨头作为正常对照组(n=10)。实验组在裸小鼠背部皮下植入细胞支架复合物，对照组在裸小鼠背部皮下植入没有复合细胞的支架。所有动物实验严格遵守上海交通大学医学院关于实验动物使用的管理规定和并征得同意。总体实验设计图见图1。
1.2 材料表征
随着PLA含量从0%增加到30%，聚羟基乙酸/聚乳酸（PGA/PLA）支架的压缩模量逐渐增加，然而软骨细胞接种效率却在逐渐下降。10%PLA比例的PGA/PLA软骨相支架充分平衡了机械力学特性和细胞接种效率。
聚ε-己内酯/羟基磷灰石(PCL/HA)具有良好的生物相容性、生物可降解性、非病原性、骨诱导活性，并且HA也是骨无机物中最重要的组成部分。PCL/HA支架具有良好的细胞粘附性。另外，随着HA含量从10%增加到40%，PCL/HA支架具有更陡峭的线弹性区域以及压缩力更高的平台区域，压缩模量和压缩力也相应增高。而且随着HA含量的增加，吸水率也相应增加。但HA含量如果大于40%，那么快速成型制备支架时PCL/HA熔丝就不能喷出，所以我们选择40%HA比例的PCL/HA支架。
1.3 分离和培养软骨细胞以及骨髓基质干细胞
一只10月龄的山羊作为种子细胞：软骨和骨髓基质干细胞的来源。从山羊膝关节股骨髁间窝处取少许关节软骨组织，切碎，PBS (HyClone, Logan, UT, USA)洗涤，然后0.1% 胶原酶(Worthington Inc., Lakewood, NJ, USA)在37℃摇床8-12小时，最后100 μm滤网过滤后接种到培养皿，5% CO2，37℃条件下培养。
同时，从山羊膝关节胫骨近端髁部抽取骨髓，分离并接种到培养皿，细胞接种密度是5×105单核细胞/cm2，5% CO2，37℃条件下培养。从P2代开始使用成骨诱导液继续培养。其中含有10mM β-甘油磷酸二钠(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0.1μM 地塞米松(Sigma-Aldrich) and 50μM 2-磷酸抗坏血酸(Gibco)。
1.4 激光扫描
激光扫描仪(Konica Minolta, Sakai, Osaka, Japan)分别采集有/无关节软骨的股骨头的表面形态，分辨率是8μm。同样的，我们也可以计算机断层扫描（CT）或核磁共振成像 (MRI)扫描。
1.5 计算机辅助设计（CAD）
计算机辅助设计（CAD）并三维重建，骨相支架包括股骨头和一个插入髓腔的柄用来手术插入固定在髓腔，大小是18×17×15mm3 (长×宽×高)，与正常山羊股骨头大小和形态一致。由于这个尺寸远超过再生组织物质交换的距离200μm,所以设计了内部相互连接的三维微小管道(直径200-400μm)。
1.6 软骨相PGA/PLA支架的制备
首先，计算机辅助设计和制造(CAD/CAM)技术制备模具。将上述激光扫描获得的有/无关节软骨的股骨头表面形态数据，经布尔减运算获得关节软骨数据，然后计算机辅助设计关节软骨支架模具，全部数据输入到CAM系统(Spectrum 510, Z Corporation)，三维打印制备出树脂模具，包括内外两部分。为便于给模具内的材料加压，外面部分被硅橡胶所代替。将50mg无纺PGA纤维（组织工程国家中心，上海）置于模具内施压12小时制备成关节面外形，1.0 mm 厚(图 3 F)。0.3% PLA (Sigma, St. Louis, MO, USA)二甲苯溶液反复均匀地滴在PGA支架上，65℃烘箱干燥，直到PLA含量为10%，再次用模具压型，最后根据模具边缘修剪多余材料。 
1.7 骨相PCL/HA支架的制备
40%HA粉末(Sigma, St Louis, MO, USA)加入60%的PCL颗粒(Solvay, Brussels, Belgium; average Mw~40,000, polydispersity index of 1.2)，混匀，上述无关节软骨的股骨头表面形态激光扫描数据经计算机辅助设计骨相支架，数据输入到CAM系统，120℃加热熔融，采用快速成型技术—熔融沉积成型法(FDM) 制备(Fortus, Stratasys, Eden Prairie, MN, USA)。骨相支架内部的孔径在平行于和垂直于底部的平面分别是（400±20）μm和(200±20) μm，孔隙率是(54.6±1.2)%。支架的设计充分考虑到了生物学和机械力学因素。
1.8 基于CAD/CAM技术最终构建的组织工程关节双相支架以及支架的接种前处理
上述PGA/PLA软骨相支架和PCL/HA 骨相支架组成组织工程关节双相支架，大小是20×19×16mm3  (长×宽×高) (图 3 G)。
在接种和体外培养前，双相支架先用75%酒精浸泡2个小时，然后紫外线照射至少30分钟，预培养2-3天。 
1.9软骨相和骨相支架上分别接种软骨细胞和成骨诱导之后的骨髓基质干细胞
在PGA/PLA支架上接种P2代软骨细胞，接种密度50×106 /ml。细胞接种在支架上，孵育4-5小时，然后软骨细胞-PGA/PLA支架复合物体外培养2-6周（图 4A）。培养液中包括10 ng/mL转化生长因子β1 (TGF-β1, InterGen, Burlington, MA), 40 ng/mL地塞米松(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 100 ng/mL胰岛素样生长因子1(IGF-1; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 1%胰岛素-转铁蛋白-硒钠(ITS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)等。
同时，在PCL/HA支架内部的微小管道中接种P2代成骨诱导之后的骨髓基质干细胞，接种密度25×106 /ml。细胞接种到支架内部的微小管道中，孵育2-3小时后将剩余细胞再次接种到支架上，再次孵育，2-3小时后加入成骨诱导培养液体外培养2-6周(图 4B)。
1.10 在裸小鼠背部皮下植入细胞支架复合物或单纯支架
常规1%-5%异氟烷麻醉，10%聚维酮碘和70%酒精消毒。在裸小鼠背部做20mm长正中纵行手术切口，分离皮下组织使之形成一个口袋形腔隙。细胞-支架移植物分上下两部分：上面是软骨细胞-PGA/PLA支架复合物，下面是成骨诱导之后的骨髓基质干细胞-PCL/HA支架复合物，这两部分组成股骨头移植物（图 4C）。单纯无细胞双相支架移植到裸小鼠背部皮下作为对照组。手术后没有不良反应和并发症。10周后，麻醉后处死（图 4E）。标本用10%中性福尔马林固定。
1.11 组织学和组织形态学分析 
一部分标本用0.5M EDTA脱钙后采用标准石蜡包埋组织学切片染色，其余标本直接聚异丁烯酸甲酯包埋，30 μm磨片。按照随机原则，前者分别苏木素-伊红(HE)染色、番红O-快绿染色、甲苯胺蓝染色和Goldner三色染色，后者分别von Kossa染色显示钙盐沉积以及甲苯胺蓝染色。我们根据国际软骨修复委员会组织学分会的视觉组织学评分标准进行软骨部分评分，测量软骨细胞数/总的软骨面积。切片的骨部分我们测量骨容量/总的组织容量（BV/TV）（图8C）、骨表面积/骨容量（BS/BV）（图8D）、总成骨细胞表面/总组织面积（Ob.S/T.Ar）（图8E）以及总血管数量/总组织面积（图8F）。
1.12 免疫组织化学分析
连续切片经脱蜡、PBS洗涤后进行抗原修复：胃蛋白酶37℃ 30分钟，PBS洗涤，3% H2O2室温下孵育，然后再次洗涤。我们分别采用抗I型胶原单克隆抗体(1:200; 5D8, Enzo, Dural NSW, Australia) 和抗II型胶原单克隆抗体(1:100, ab34712, Abcam, Cambridge, MA, USA) 进行I型和II胶原免疫定位；分别采用骨桥蛋白(1:200, N/A, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)、骨钙蛋白(1:400, OC4-30, Abcam, Cambridge, MA, USA)和骨连接蛋白(1:100, ON1-1, Abnova, Taipei City, Taiwan)单克隆抗体进行骨桥蛋白、骨钙蛋白和骨连接蛋白免疫定位。分别加入一抗37℃下孵育60分钟，PBS洗涤。然后室温下用酶共轭的二抗孵育15分钟，PBS洗涤。二氨基联苯胺(DAB)过氧化物酶底物处理5-10分钟，流水洗涤，苏木素复染3分钟，梯度酒精脱水，二甲苯透明。阴性对照除了省略一抗步骤外，其余过程同上所述。另外，正常标本阳性对照。
1.13 再生的软骨和软骨下骨机械生物力学性能测定
我们采用测试系统(Instron, Grove City, PA, USA)进行压缩测试实验。分别在压缩条件下测试各组软骨和软骨下骨圆柱体(5.00 [SD 0.10]×5.00[0.20] mm2)，应力与应变之比即为（E）。
1.14 数据分析
采用SPSS（13.0版）进行数据分析，P <0.05 为显著差异。对于正态分布计数资料，我们采用一维方差分析和最小显著性差异检验。对于分布类型未知的资料，采用非参数Wilcoxon秩和检验。
2. 结果
2.1 大体观
在裸小鼠背部皮下植入10周后，实验组关节表面有肉眼可见的软骨样组织再生，并且PCL/HA 支架的微小管道中有白色坚硬的骨样组织长入，再生的关节软骨样组织表面光滑、连续、无血管化，并且与再生的骨样组织很好地整合在一起，彼此紧密结合，两者之间的界面没有肉眼可见的裂隙。再生的股骨头大小和形态与山羊股骨头一致，大小是20×19×16mm3 （长×宽×高）（图4E）。然而对照组移植物的关节表面没有肉眼可见的软骨样组织再生，PCL/HA支架的微小管道中也没有白色坚硬的骨样组织长入，代替的是疏松结缔组织。
2.2 组织工程股骨头关节软骨组织的再生
在组织工程化股骨头关节面部位光滑、连续，组织番红O呈阳性，提示实验组中股骨头关节面有软骨组织发生（图5A 番红O/快绿），而软骨下面的PCL/HA支架的微小管道中番红O染色呈阴性（图5B 番红O/快绿），说明再生的软骨组织具有跟正常软骨组织同样的分泌聚集蛋白聚糖功能。番红O阳性组织延伸到番红O阴性组织中并且两者整合良好（图5B番红O/快绿）。再生的软骨组织中没有发现血管长入，软骨细胞在细胞外基质陷窝中。II型胶原免疫定位于软骨细胞的细胞外基质（图5A II型胶原）。对照组II型胶原阴性。另外，绝大部分PGA/PLA 支架材料已经降解，仅有极少量的材料纤维残留（图5A箭头所示）。在对照组中PCL/HA支架材料表面和微小管道中只有少量纤维结缔组织生长，上面PGA/PLA支架已经消失。定量分析：我们根据国际软骨修复委员会组织学分会的视觉组织学评分标准进行软骨部分评分（图8A），测量总软骨细胞数/总的软骨面积（图8B）。上述定量分析实验组和正常对照组之间没有显著性差异。但实验组和对照组存在显著性差异。
再生软骨组织的机械生物力学测定：实验组和对照组在再生软骨组织的压缩模量（图 9A）和压缩力（图 9B）方面没有显著性差异（n=10, p＞0.05）。由于对照组中没有明显软骨组织再生，所以实验组和对照组之间存在显著性差异（n=10, p＜0.05）。
2.3 再生软骨和软骨下骨之间的界面以及骨再生情况
再生的关节表面软骨组织延伸到再生的软骨下骨部分，两者之间界面肉眼和光学显微镜下没有看到裂隙，它们整合良好。另外，在靠近软骨下骨组织的软骨细胞呈肥大钙化（图5B）。
2.4 组织工程化股骨头松质骨再生和血管形成
组织学切片染色显示在PLC/HA支架的微小管道中有明显骨组织长入，支架材料只有极少的降解，绝大部分尚未完全降解，Von Kossa染色显示在PLC/HA支架相互连接的三维微小管道中有阳性钙化沉积（图6B von Kossa×10）。骨小梁结构是松质骨首要的解剖和功能单位。再生的骨组织具有明显的骨小梁的结构，并有大量的骨细胞，骨小梁结构表面有柱状的成骨细胞（图6A 番红O/快绿×20）。另外，在再生的松质骨组织中有明显的小血管形成（图6A苏木素-伊红×40）。I型胶原、骨桥蛋白、骨钙蛋白和骨连接蛋白分别免疫定位于PLC/HA支架的微小管道中再生的组织，它们与骨组织的分布和von Kossa阳性分布区域相一致。骨组织发生和血管形成在再生组织的外部、中间和内部没有明显差异。新生血管一般靠近骨髓组织的区域。再生的松质骨内具有明显的骨髓样组织（图6A  Goldner三色×40）。在对照组中没有新生骨组织形成，只发现PLC/HA支架材料的降解和纤维结缔组织生长（图10）。定量分析：我们测量了骨容量/总的组织容量（BV/TV）（图8C）、骨表面积/骨容量（BS/BV）（图8D）、总成骨细胞表面/总组织面积（Ob.S/T.Ar）（图8E）以及总血管数量/总组织面积（图8F），上述所有测量结果在实验组和正常对照组之间没有显著性差异，但是在实验组和对照组之间存在显著性差异。
再生骨组织的机械生物力学测定：实验组和正常组在压缩模量（图 9C）和压缩力（图 9D）方面没有显著性差异存在(n=10, p＞0.05)。但实验组和对照组有显著性差异存在 (n=10, p＜0.05)。实际上，由于对照组中几乎没有再生的骨组织形成，所以压缩模量和压缩力测得的实际上是尚未完全降解的PCL/HA支架和其中长入的纤维结缔组织的压缩模量和压缩力，而不是再生的骨组织的压缩模量和压缩力。
3. 结论
基于CAD/CAM技术构建的组织工程关节双相支架大小和形态与正常山羊股骨头完全吻合，并且具有内部可控的孔径和孔隙率；利用组织工程技术，复合种子细胞形成细胞-组织工程关节双相支架构建物，在裸小鼠背部皮下可以再生出组织工程山羊股骨头。再生的组织工程股骨头大小和形态与正常股骨头相匹配，再生的关节软骨和软骨下骨具有正常组织所具有的生物学及机械生物力学等特性，并且两者之间界面整合良好，为将来进行组织工程关节置换替代病损的关节提供了一种生物重建的可能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种组织工程关节双相支架，其特征在于，所述的双相支架是由骨相支架和软骨相支架两部分组成，所述的骨相支架为PCL/HA支架，软骨相支架为PGA/PLA支架。
2.根据权利要求1所述的组织工程关节双相支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先激光扫描或者CT和MRI扫描；然后计算机辅助设计和三维重建组织工程关节支架；最后通过计算机辅助制造快速成型技术加工制备骨相支架，以及软骨相支架模具；利用软骨相支架模具加工制备软骨相支架；骨相支架和软骨相支架组成组织工程关节双相支架，其中骨相支架是PCL/HA支架，软骨相支架是PGA/PLA支架。
3.根据权利要求1所述的组织工程关节双相支架在制备组织工程关节中的应用。
4.一种细胞-组织工程关节双相支架构建物，其特征在于，所述的细胞-关节双相支架构建物由成骨部分和成软骨部分组成，所述的成骨部分是骨髓基质干细胞-PCL/HA骨相支架，所述的成软骨部分是软骨细胞或骨髓基质干细胞-PGA/PLA软骨相支架。
5.根据权利要求4所述的细胞-组织工程关节双相支架构建物，其特征在于，所述的成骨部分的制备方法：采用权利要求2所述的方法制备PCL/HA骨相支架，支架内接种骨髓基质干细胞，然后体外成骨诱导培养2-6周。
6.根据权利要求4所述的细胞-组织工程关节双相支架构建物，其特征在于，所述的成软骨部分的制备方法：采用权利要求2所述的方法制备PGA/PLA软骨相支架，支架内接种软骨细胞或骨髓基质干细胞；然后体外培养2-6周。
7.根据权利要求4所述的细胞-组织工程关节双相支架构建物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）采用权利要求4所述的方法制备成软骨部分，PGA/PLA软骨相支架上接种软骨细胞或骨髓基质干细胞；然后体外培养2-6周；（2）采用权利要求4所述的方法制备成骨部分，PCL/HA骨相支架上接种骨髓基质干细胞，然后进行体外成骨诱导培养2-6周。
8.根据权利要求4-6任一所述的细胞-组织工程关节双相支架构建物在制备组织工程关节中的应用。
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