CN1386478A

CN1386478A - 组织工程用复合结构细胞支架及其制法和用途

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Publication number: CN1386478A
Application number: CN 01118316
Authority: CN
Inventors: 王身国; 贝建中; 蔡晴; 石桂欣
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2001-05-23
Filing date: 2001-05-23
Publication date: 2002-12-25
Anticipated expiration: 2021-05-23
Also published as: CN1169494C

Abstract

本发明公开了一种组织工程用复合结构细胞支架,其结构如下:(1)由结构1和结构2两部分组成,结构1和结构2直接相接、结构1和结构2的孔互相相通;或(2)由结构1和结构2及两者间的一层由材料3所构成的致密层组成,使结构1和结构2的孔互不相通。本发明还公开了其制备方法,可作为皮肤、血管、骨/软骨、食道、气管等多种细胞组织工程的细胞支架,用于进行皮肤、血管、膑骨、食道、气管等组织和器官的修复和构建。

Description

组织工程用复合结构细胞支架及其制法和用途

组织工程的核心是构建由细胞与生物材料结合而成的复合体。组织工程中，组织细胞依附于由生物材料所制备、与所需修复的组织或器官具有相同形状的支架上，在先经过体外培养扩增后、再植入体内的病损部位，使之最终达到修复重建组织或器官、恢复功能目的。因此，细胞、生物材料所构成的细胞支架，以及组织和器官的形成和再生是组织工程的三大要素。组织工程的三维多孔细胞支架不但起着决定新生组织、器官形状大小的作用，更重要的是为细胞增殖起着提供营养、进行气体交换、排除废物，为细胞增殖、繁衍提供场所的重要作用，因此组织工程的细胞支架必须满足一定的要求：

由于细胞支架在组织工程中起着为细胞增殖营造环境的作用，因此它必须随着细胞在支架上的繁殖和生长而逐渐消失，从而将空间让给细胞，使最终生成的组织和器官具有同支架相同的形状和大小。由此细胞支架不但必须具有对细胞良好的亲和性和特定的三维形态结构，使细胞能在其上生长和繁殖；同时必须具有生物降解性，保证在生理和机体的环境下支架材料能自动降解、由大分子变成小分子，并最终被机体代谢或吸收。为了保证细胞的生长繁殖不受支架存在的影响，还要求细胞支架的降解速度能同细胞的增殖速度相匹配、并且其降解产物不会对细胞的生长和繁殖产生不利的影响。

从临床实用要求考虑，细胞支架还必须能够耐受消毒灭菌的操作，要保证在消毒灭菌、细胞培养和手术操作中能保持原有的形状和结构；并且具有一定的柔韧性、能同机体组织相缝合和能同机体组织相贴合，能经受手术操作而不破碎、并不对机体组织造成机械损伤的力学性能。因此作为组织工程的细胞支架必须同时满足生物相容性、细胞亲和性、生物降解性、可消毒性，以及力学性能和形态结构等性能要求。

由于不同组织和器官的细胞不但在形状和大小上不同，在细胞生长时的取向及结构密度上也不甚相同，细胞支架必须具有与所培养的组织细胞要求相一致的三维形态结构。此外，由于如皮肤组织工程、血管组织工程、关节组织工程、食道组织工程、气管组织工程等多种细胞的组织工程必须在细胞支架上同时培养两种细胞，细胞支架必须同时满足这两种大小和生长繁殖速度相同或不同细胞的要求。因此根据组织和器官的不同以及所培养的两种细胞种类的不同，细胞支架必须在力学性能、降解速度和三维形态结构上同时满足这两种细胞生长繁殖的要求，即根据具体的组织工程对象，用相同或不同的材料、制备呈相同或不同三维形态结构、且两种结构的孔间是互相相通或是互相不通的复合结构细胞支架来与此相适应。

然而，如今的细胞支架都只是由同一种材料所制备、呈单一三维形态结构的细胞支架，例如由天然高分子材料甲壳素、壳聚糖、海藻酸盐、胶原蛋白、葡聚糖、透明质酸、明胶和琼脂所制备的细胞支架、由天然无机材料羟基磷灰石、磷酸钙和珊瑚礁所制备的细胞支架，以及由合成高分子材料脂肪族聚酯、聚酸酐、聚膦腈、聚原酸酯和聚醚制备的细胞支架(王身国等，中国创伤骨科杂志，2000，16(6)：328-330.)；王身国等，中国发明专利99105984.0)；王身国等，中国发明专利ZL 92 1 13100.3；王身国等，中国发明专利98102212.X)。这样的细胞支架虽然各有不同的力学性能、降解速度和三维形态结构，可以适用于骨、软骨等不同组织工程的要求，但是由于它们的力学性能、降解速度和三维形态结构都很单一，因此只适用于作为单一细胞组织工程的细胞支架，而不能适用于作为多种细胞组织工程的细胞支架。

本发明的目的在于提供一种适用于作为多种细胞组织工程细胞支架的复合结构细胞支架。

本发明的另一目的在于提供一种适用于作为多种细胞组织工程细胞支架的复合结构细胞支架的制法。

本发明的目的还在于提供一种适用于作为多种细胞组织工程细胞支架的复合结构细胞支架的用途。

本发明提出了一种适用于作为多种细胞组织工程细胞支架的复合结构细胞支架，其结构如下：

(1)由结构1和结构2两部分组成，结构1和结构2直接相接、结构1和结构2的孔互相相通；或

(2)由结构1和结构2及两者间的一层由材料3所构成的致密层组成，使结构1和结构2的孔互不相通；

其中构成结构1的材料1和构成结构2的材料2可以是降解速度和力学性能相同的同一材料，也可以是降解速度和力学性能不同的两种材料；结构1和结构2可以是呈相同的三维形态结构(孔径、孔隙率和孔形态结构)，也可以呈不同的三维形态结构，其中一种结构的孔径可以在5纳米～600微米范围、孔隙率在30～95％范围，另一种结构的孔径也可以在5纳米～600微米范围、孔隙率在30～95％范围，两个结构的厚度都在0.2～10mm范围；两种结构可以是相同的开放孔结构，也可以是不同的开放孔结构。由材料3所构成的致密层厚度在0.05～1.0mm范围。本发明中结构1、结构2和材料3可以由相同材料构成，也可以由不同材料构成。三种材料的降解速度都在3天到3年的范围；

本发明结构1所使用的材料1和结构2所使用的材料2可以分别是由天然高分子材料甲壳素、壳聚糖、海藻酸盐、胶原蛋白、葡聚糖、透明质酸、明胶和琼脂，或天然无机材料羟基磷灰石、磷酸钙和珊瑚礁，或合成高分子材料脂肪族聚酯、聚酸酐、聚膦腈、聚原酸酯和聚醚中的一种或它们间的共混物，也可以都由合成高分子材料组成。其中合成高分子材料中以脂肪族聚酯为主，其中有聚L-乳酸(PLLA)、聚DL-乳酸(PDLLA)、共聚(L-乳酸/DL-乳酸)(PLLA-co-PDLLA)、聚乙醇酸(PGA)、共聚(乳酸/乙醇酸)二元共聚物(PLGA)、共聚(乳酸/己内酯)二元共聚物(PLC)、聚己内酯(PCL)、共聚(乙醇酸/乳酸/己内酯)三元共聚物(PLGC)、聚己内酯/聚醚嵌段共聚物(PCE)、聚己内酯/聚醚/聚乳酸三元共聚物(PCEL)、聚乳酸/聚醚二元共聚物(PLE)，以及其它聚羟基酸(PHA)中的一种或它们间的共混物。

所述材料3可以是天然高分子材料甲壳素、壳聚糖、海藻酸盐、胶原蛋白、葡聚糖、透明质酸、明胶和琼脂，或合成高分子材料脂肪族聚酯中的聚L-乳酸(PLLA)、聚DL-乳酸(PDLLA)、共聚(L-乳酸/DL-乳酸)(PLLA-co-PDLLA)、聚乙醇酸(PGA)、共聚(乳酸/乙醇酸)二元共聚物(PLGA)、共聚(乳酸/己内酯)二元共聚物(PLC)、聚己内酯(PCL)、共聚(乙醇酸/乳酸/己内酯)三元共聚物(PLGC)、聚己内酯/聚醚嵌段共聚物(PCE)、聚己内酯/聚醚/聚乳酸三元共聚物(PCEL)、聚乳酸/聚醚二元共聚物(PLE)，以及其它聚羟基酸(PHA)中的一种或它们间的共混物。

本发明所制备的复合结构细胞支架可以呈棒状、板状、膜状、管状或特定的形状。

本发明中结构1或结构2的三维形态结构可以是天然无机材料的结构，也可以由通常的冷冻干燥法、溶液浇铸法、热塑成型法、模压成型法、控制蒸发法、激光刻蚀法、喷射冷冻法、机械加工法、纤维编织法(D.W.Hatmacher等，Biomaterials，2000，21：2529-2543)中的一种或两种方法制得。

本发明中结构1、结构2和材料3之间可以采用通常的粘合法、熔合法或压合法接合。

采用溶液浇铸法制备本发明复合结构细胞支架的具体方法是：材料1和材料2各1～50份溶于各自的溶剂，所述溶剂为二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二氧六环或蒸馏水、稀酸、稀碱溶液，配成1～20％的溶液后，分别以0.5g/1.0g～1.0g/20.0g的比例同5～300目的盐粒混合均匀，再分别浇铸于模具中。挥发溶剂5～72小时后再真空干燥12～72小时，然后把所得到的含盐材料1和材料2块浸入去离子水中脱盐，每1～10小时换一次水，直至洗涤液中检测不到盐的残留离子为止，把脱了盐的材料1和材料2多孔支架在空气中干燥5～72小时，制得材料1和材料2多孔支架。当材料1和材料2的一种或两种是天然无机材料时，可不进行以上的处理而直接使用。

把材料1和材料2多孔支架用0.5～10％的材料3的溶液粘合，再真空干燥12～72小时，得到材料1和材料2平均孔径为5纳米～600微米范围、孔隙率在30～95％范围，材料1和材料2厚度在0.2～10mm范围，材料3的厚度在厚度在0.05～1.0mm范围、由材料1、材料2和材料3三层组成的复合结构细胞支架。

将上述制得的脱了盐的材料1和材料2多孔支架的一个面涂以极少量的共溶剂后立即直接接合，所述共溶剂为二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二氧六环或蒸馏水、稀酸、稀碱溶液，再真空干燥12～72小时；或材料1和材料2多孔支架的一个面与温度为55～200℃的热板接触后再立即压合；或将材料1和材料2多孔支架面面相对加压12～72小时，则得到只由材料1和材料2两层组成的复合结构细胞支架。

用本发明所制备的复合结构细胞支架适宜于作为皮肤、血管、骨/软骨、食道、气管等多种细胞组织工程的细胞支架，用于进行皮肤、血管、膑骨、食道、气管等组织和器官的修复和构建。

图1为本发明的组织工程用复合结构细胞支架结构示意图。

1为结构1，2为结构2，3为材料3。

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述。

实施例1

把共聚(乳酸/乙醇酸)(70/30)(PLGA730)(分子量5万)和聚DL-乳酸(PDLLA)(分子量4万)各5份溶于二氯甲烷中后，分别以1.0g/1.0g和1.0g/10.0g的比例同40-60目的盐粒混合均匀，再分别浇铸于模具中。挥发溶剂24小时并真空干燥24小时，然后把所得到的含盐PLGA/NaCl和PDLLA/NaCl块浸入去离子水中脱盐，每4小时换一次水，直至洗涤液中检测不到氯离子为止。把脱了盐的PLGA和PDLLA多孔支架在空气中干燥24小时后用5％的PLGA二氯甲烷粘合，再真空干燥48小时，得到PDLLA层平均孔径为200微米、孔隙率为90％，PLGA层平均孔径为30微米、孔隙率为80％，两层的孔互不相通的PLGA/PDLLA复合结构细胞支架。

实施例2

把共聚(乳酸/乙醇酸)(85/15)(PLGA8515)(分子量6万)各5份溶于二氯甲烷中后以1.0g/10.0g的比例分别同20-40目及120目的盐粒混合均匀，分别浇铸于模具中后挥发溶剂24小时并真空干燥24小时，然后把所得到的两种含盐PLGA/NaCl块浸入去离子水中脱盐，每4小时换一次水，直至洗涤液中检测不到氯离子为止。把脱了盐的PLGA多孔支架在空气中干燥24小时后用含1％PLGA8515的二氯甲烷溶液粘合，再真空干燥48小时，得到平均孔径分别为200微米和500微米、孔隙率都约为90％、两层间的孔相互构通的PLGA复合结构细胞支架。

实施例3

把共聚(乳酸/己内酯)(90/10)二元共聚物(PLC910)(分子量～5万)5份溶于二氯甲烷中后以1.0g/10.0g的比例同60-80目的盐粒混合均匀，同上方法浇铸于模具中后挥发溶剂并脱去盐分，得到平均孔径为200微米、孔隙率约为90％的PLC910支架。再取天然无机材料羟基磷灰石，切成2毫米厚的片后，涂复一层含5％的PLC910二氯甲烷溶液后迅速覆盖在上述的PLC910支架上，真空干燥48小时后，得到两层间的孔互不相通的羟基磷灰石/PLC复合结构细胞支架。

实施例4

同实施例3方法，但采用5份共聚(乙醇酸/乳酸/己内酯)三元共聚物(PLGC)为材料，在溶于二氯甲烷中后以1.0g/10.0g的比例同60-80目的盐粒混合均匀后再浇铸于模具中后挥发溶剂并脱去盐分，得到平均孔径为180微米、孔隙率约为90％的PLGC支架。再用含5％的PLA二氯甲烷溶液同由冷冻干燥法所制得的孔径为80微米的壳聚糖支架粘合，真空干燥48小时后，得到两层间的孔互不相通的壳聚糖/PLGC复合结构细胞支架。

实施例5

同实施例3方法，但采用5份聚己内酯/聚醚/聚乳酸三元共聚物(PCEL)为材料，在溶于二氯甲烷中后以1.0g/5.0g的比例同120目的盐粒混合均匀后再浇铸于模具中后挥发溶剂并脱去盐分，得到平均孔径为80微米、孔隙率约为85％的PCEL支架。再用含1％的PLA二氯甲烷溶液同由冷冻干燥法所制得的孔径为80微米的藻酸盐支架粘合，真空干燥48小时后，得到两层孔径阳同、两层间的孔又互相构通的壳聚糖/PLGC复合结构细胞支架。

实施例6

将由实施例1所得到的PLGA/PDLLA复合结构细胞支架用于皮肤组织工程，其中孔小的PLGA支架部分用于表皮细胞培养、孔大的PDLLA支架部分用于成纤维细胞的培养，结果表明两部分细胞互不接触、都生长繁殖良好，并有胶原基质分泌。

实施例7

将由实施例3所得到的羟基磷灰石/PLC复合结构细胞支架用于膑骨修复，其中羟基磷灰石支架部分用于骨细胞培养、PLC支架部分用于关节软骨培养，结果表明两部分的细胞都生长繁殖良好，并有胶原基质分泌。

对照例1：

将按实施例1所制备的脱了盐的PLGA和PDLLA多孔支架用1％的PLGA二氯甲烷粘合，再真空干燥48小时，得到PDLLA层平均孔径为200微米、孔隙率为90％，PLGA层平均孔径为30微米、孔隙率为80％，两层间的孔相互通达的PLGA/PDLLA复合结构细胞支架。然后用于皮肤组织工程，其中孔小的PLGA支架部分用于表皮细胞培养、孔大的PDLLA支架部分用于成纤维细胞的培养，结果表明：由于两层结构的孔互相通透，使表皮细胞的生长受到成纤维细胞生长的抑制，生长繁衍不正常。

对照例2：

把共聚(乳酸/乙醇酸)(70/30)(PLGA730)(分子量5万)和聚乳酸(PLLA)(分子量4万)各5份溶于二氯甲烷中后，都以1.0g/10.0g的比例同40-60目的盐粒混合均匀，再分别浇铸于模具中。挥发溶剂24小时并真空干燥24小时，然后把所得到的含盐PLGA/NaCl和PLLA/NaCl块浸入去离子水中脱盐，每4小时换一次水，直至洗涤液中检测不到氯离子为止。把脱了盐的PLGA和PLLA多孔支架在空气中干燥24小时后用5％的PLGA二氯甲烷粘合，再真空干燥48小时，得到PLLA层和PLGA层平均孔径都为200微米、孔隙率为90％的复合结构细胞支架。将此复合结构细胞支架用于皮肤组织工程，其中PLGA支架部分用于表皮细胞培养、PLLA支架部分用于成纤维细胞的培养，结果表明：PLLA支架部分的成纤维细胞生长良好，而PLGA层的表皮细胞则是细胞少、生长差。这是由于成纤维细胞和表皮细胞两种细胞对孔径孔结构的要求不同，200微米的细胞支架孔径成纤维细胞比较合适，而对表皮细胞而言是孔径太大了，因此使细胞无法贴壁和正常生长。

Claims

1.一种组织工程用复合结构细胞支架，其结构如下：

所述结构1所使用的材料1和结构2所使用的材料2为天然高分子材料甲壳素、壳聚糖、海藻酸盐、胶原蛋白、葡聚糖、透明质酸、明胶和琼脂，或天然无机材料羟基磷灰石、磷酸钙和珊瑚礁，或合成高分子材料脂肪族聚酯、聚酸酐、聚膦腈、聚原酸酯和聚醚中的一种或它们间的共混物；

所述材料3为天然高分子材料甲壳素、壳聚糖、海藻酸盐、胶原蛋白、葡聚糖、透明质酸、明胶和琼脂，或合成高分子材料脂肪族聚酯中的聚L-乳酸(PLLA)、聚DL-乳酸(PDLLA)、共聚(L-乳酸/DL-乳酸)(PLLA-co-PDLLA)、聚乙醇酸(PGA)、共聚(乳酸/乙醇酸)二元共聚物(PLGA)、共聚(乳酸/己内酯)二元共聚物(PLC)、聚己内酯(PCL)、共聚(乙醇酸/乳酸/己内酯)三元共聚物(PLGC)、聚己内酯/聚醚嵌段共聚物(PCE)、聚己内酯/聚醚/聚乳酸三元共聚物(PCEL)、聚乳酸/聚醚二元共聚物(PLE)，以及其它聚羟基酸(PHA)中的一种或它们间的共混物。

2.根据权利要求1的一种组织工程用复合结构细胞支架，其特征在于所述合成高分子材料为脂肪族聚酯，包括聚L-乳酸(PLLA)、聚DL-乳酸(PDLLA)、共聚(L-乳酸/DL-乳酸)(PLLA-co-PDLLA)、聚乙醇酸(PGA)、共聚(乳酸/乙醇酸)二元共聚物(PLGA)、共聚(乳酸/己内酯)二元共聚物(PLC)、聚己内酯(PCL)、共聚(乙醇酸/乳酸/己内酯)三元共聚物(PLGC)、聚己内酯/聚醚嵌段共聚物(PCE)、聚己内酯/聚醚/聚乳酸三元共聚物(PCEL)、聚乳酸/聚醚二元共聚物(PLE)，以及其它聚羟基酸(PHA)中的一种或它们间的共混物。

3.根据权利要求1的一种组织工程用复合结构细胞支架，其特征在于所述结构1和结构2的孔径为5纳米～600微米、孔隙率为30～95％，厚度为0.2～10mm；所述由材料3所构成的致密层厚度为0.05～1.0mm。

4.根据权利要求1的一种组织工程用复合结构细胞支架，其特征在于所述复合结构细胞支架呈棒状、板状、膜状、管状或特定的形状。

5.一种组织工程用复合结构细胞支架的制备方法，按以下步骤进行：材料1和材料2各1～50份溶于各自的溶剂，所述溶剂为二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二氧六环或蒸馏水、稀酸、稀碱溶液，配成1～20％的溶液后，分别以0.5g/1.0g～1.0g/20.0g的比例同5～300目的盐粒混合均匀，再分别浇铸于模具中。挥发溶剂5～72小时后再真空干燥12～72小时，然后把所得到的含盐材料1和材料2块浸入去离子水中脱盐，每1～10小时换一次水，直至洗涤液中检测不到盐的残留离子为止，把脱了盐的材料1和材料2多孔支架在空气中干燥5～72小时，制得材料1和材料2多孔支架；当材料1和材料2的一种或两种是天然无机材料时，可不进行以上的处理而直接使用。

将上述制得的脱了盐的材料1和材料2多孔支架的一个面涂以极少量的共溶剂后立即直接接合，所述共溶剂为二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二氧六环或蒸馏水、稀酸、稀碱溶液，再真空干燥12～72小时；或材料1和材料2多孔支架的一个面与温度为55～200℃的热板接触后再立即压合；或将材料1和材料2多孔支架面面相对加压12～72小时，则得到只由材料1和材料2两层组成的复合结构细胞支架；

所述材料1和材料2为天然高分子材料甲壳素、壳聚糖、海藻酸盐、胶原蛋白、葡聚糖、透明质酸、明胶和琼脂，或天然无机材料羟基磷灰石、磷酸钙和珊瑚礁，或合成高分子材料脂肪族聚酯、聚酸酐、聚膦腈、聚原酸酯和聚醚中的一种或它们间的共混物；

6.根据权利要求5的一种组织工程用复合结构细胞支架的制备方法，其特征在于所述合成高分子材料为脂肪族聚酯，包括聚L-乳酸(PLLA)、聚DL-乳酸(PDLLA)、共聚(L-乳酸/DL-乳酸) (PLLA-co-PDLLA)、聚乙醇酸(PGA)、共聚(乳酸/乙醇酸)二元共聚物(PLGA)、共聚(乳酸/己内酯)二元共聚物(PLC)、聚己内酯(PCL)、共聚(乙醇酸/乳酸/己内酯)三元共聚物(PLGC)、聚己内酯/聚醚嵌段共聚物(PCE)、聚己内酯/聚醚/聚乳酸三元共聚物(PCEL)、聚乳酸/聚醚二元共聚物(PLE)，以及其它聚羟基酸(PHA)中的一种或它们间的共混物。

7.一种组织工程用复合结构细胞支架的用途，其特征在于作为皮肤、血管、骨/软骨、食道、气管等多种细胞组织工程的细胞支架，用于进行皮肤、血管、膑骨、食道、气管等组织和器官的修复和构建。