KR20130037324A

KR20130037324A - 조직재생용 스캐폴드 제조를 위한 3차원 프린팅 적층용 조성물과 그 제조방법

Info

Publication number: KR20130037324A
Application number: KR1020110101676A
Authority: KR
Inventors: 이준; 김범수; 성학모; 김진성
Original assignee: 주식회사 본셀바이오텍
Priority date: 2011-10-06
Filing date: 2011-10-06
Publication date: 2013-04-16

Abstract

본 발명은 골 재생용 스캐폴드의 3차원 프린팅 적층용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 코팅제로 코팅된 골분말을 유효성분으로 포함하는 골 재생용 스캐폴드의 3차원 프린팅 적층용 조성물 및 이를 이용하여 3차원 형상의 골 재생용 스캐폴드의 제조방법 및 이에 의해 제조된 3차원 형상의 골 재생용 스캐폴드에 관한 것이다. 본 발명에서 제시하는 3차원 형상 제조를 위한 조성물은 생체친화적이고 조직재생 효과가 높은 조직재생용 생체재료들을 이용함으로써, 생체 독성이 없으며, 3차원형상제작에 범용적으로 사용할 수 있다. 또한 이 기술로 제조된 스캐폴드는 세포 부착 및 생장에 적합한 공극 및 공극률을 가지는바, 조직공학 및 재생의학 분야에 효과적인 골 재생용 스캐폴드를 제공할 수 있다.

Description

조직재생용 스캐폴드 제조를 위한 3차원 프린팅 적층용 조성물과 그 제조방법 {Composition and method for 3D printing stacking of Scaffold adequate to Multi-material for Bone Regenerating}

본 발명은 골 재생용 스캐폴드의 3차원 프린팅 적층용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 코팅제로 코팅된 골분말을 유효성분으로 포함하는 골 재생용 스캐폴드의 3차원 프린팅 적층용 조성물 및 이를 이용하여 3차원 형상의 골 재생용 스캐폴드의 제조방법 및 이에 의해 제조된 3차원 형상의 골 재생용 스캐폴드에 관한 것이다.

생활환경의 개선과 의술의 발전에도 불구하고 세균감염, 외상, 종양 등으로 인해 골 결손부가 발생하고 있다. 이러한 결손부의 재건을 위해 많은 종류의 골 이식재가 사용되고 있으나, 현재까지 가장 골 수복의 효과가 좋은 자가 골이식은 골의 채취를 위한 이차적 수술이 필요하며, 그에 따른 후유증과 특히 큰 골 결손부를 위한 재료의 공급이 수월하지 못하다는 단점을 가지고 있다.

최근 조직공학적 접근을 통한 골 재생에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 이를 위한 골 재생용 스캐폴드의 개발에 대한 연구가 급속도로 증가하고 있다.

조직공학적 측면에서, 뼈 수복 과정에서 가장 고려되어야 할 요소는 골형성 전구세포 (osteogenic progenitor cell), 골유도 성장인자 (osteoinductive growth factor)와 골전도 기질 (osteoconductive matrices) 이다. 이 중 뼈 성장과 조직 발달을 위한 구조 및 특이적 환경을 제공하는 임시적인 매트릭스로써 이상적인 스캐폴드는 세포의 부착, 성장, 그리고 분화를 도울 수 있어야 하기 때문에, 스캐폴드는 공극의 크기, 공극 상호 간극의 크기 그리고 공극률의 기하학적 변수가 고려되어 디자인 되어야 한다.

이상적인 스캐폴드 제작을 위한 방법으로써 특정모양의 틀(mold)에 골분말과 중합체를 형성하는 물질을 혼합하여 3차원 스케폴드를 제작하고 이를 체내에 이식하거나 체외배양하여 형성된 조직을 이식하려는 시도들이 진행되어 왔다. 하지만 최근 들어 이러한 스캐폴드를 제작하기 위해서 분말형 재료를 기반으로 하는 3차원 프린팅 (powder based three-dimensional printing)같은 쾌속조형기술(RP, Rapid Prototype) 기술이 주목 받고 있다. 쾌속조형기술이란 3차원 영상자료의 2차원 단면화를 통해서 재료를 체계적으로 한 층씩 적층함으로써 실제 3차원 모델을 빠른 시간 안에 제작할 수 있는 기술을 일컫는다.

현재 의료분야에서의 쾌속조형기술은 환자의 CT 영상자료를 이용하여 해부학적 모델 (anatomical model)을 제작하여 질환부위의 모의시술을 위한 용도로서 주로 사용되고 있다. 최근에는 더 나아가 골 조직공학 재생분야에서 환자의 CT 영상자료를 기반으로 환부 맞춤형 스캐폴드를 제작하고, 이를 이용하여 골 결손부의 수복을 위한 목적으로 연구되고 있다. 의료용 스캐폴드 제작을 위한 3D 프린팅 재료로서 여러 재료가 대상이 될 수 있는데, 특별히 골 수복용 RP 기술에 일반적으로 사용되는 재료로는 콜라겐, 다당류와 같은 천연고분자물질, PLGA, PCL과 같은 합성고분자가 쓰이며, 수산화인염 (hydroxyapatite)와 삼중인산염 (tri-calcium phosphate TCP)과 같은 calcium based polymer, 또는 수산화인염과 삼중인산염의 복합체같은 분말시료가 사용되고 있다. 이런 분말시료의 중합을 유도하여 스캐폴드를 완성시키기 위해서는 이 분말시료에 반응을 일으키는 적합한 결합제 (binder)가 사용되어야 한다.

특히, PLGA, PLA 와 같은 합성고분자를 사용하려면 결합제로써 클로로포름(chloroform)과 같은 유기용매를 사용해야만 하는데, 이런 잔류 유기용매의 경우 항상 독성의 위험을 가지고 있다. 또한 PCL의 경우 60도 이상의 고온에서 용액상태가 되므로 단백질이나 세포로 구성되는 조성물은 온도에 민감하여 적용하기 아주 어렵다.

따라서 RP 프린팅 기술을 이용한 조직재생용 스캐폴드의 제조를 위해서는 생체친화적이고 조직재생 효과가 높은 골재생용 분말시료의 선택과 함께 결합제 (binder)의 선택이 매우 중요하다.

상기 문제점을 해결하기 위하여 본 출원의 발명자들은 인체적합성이 우수한 재료를 이용하여 골 재생용 스캐폴드의 3차원 프린팅 적층에 적용하는 조성물 및 이를 이용하여 3차원 형상의 골 재생용 스캐폴드의 제조 방법을 개발하기에 이르렀다.

이에 따라, 본 발명의 목적은 골 재생용 스캐폴드의 3차원 프린팅 적층용 조성물을 제공함에 있다.

또한 본 발명의 목적은 상기 조성물을 이용한 3차원 형상의 골 재생용 스캐폴드의 제조 방법을 제공함에 있다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 3차원 형상의 골 재생용 스캐폴드를 제공함에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 코팅제로 코팅된 골 분말을 유효성분으로 포함하는, 골 재생용 스캐폴드의 3차원 프린팅 적층용 조성물을 제공한다.

상기 코팅제는 피브리노겐, 피브린, 트롬빈, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 홍합접착단백질 및 히알루론산으로 이루어진 그룹에서 선택된 것일 수 있다.

상기 골분말은 상기 골분말은 사람의 사체에서 유래된 골 분말, 사람을 제외한 동물에서 유래된 골 분말, 합성된 골분말로 이루어진 그룹에서 선택된 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 사람을 제외한 동물에서 유래된 골 분말은 갑오징어 뼈에서 유래한 골분말일 수 있다.

상기 상기 골 재생용 스캐폴드의 3차원 프린팅 적층은 도포된 골분말에 결합제를 적용하여 적층하는 것일 수 있으며, 상기 결합제는 결합제는 피브리노겐, 피브린, 트롬빈, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 홍합접착단백질 및 히알루론산으로 이루어진 그룹에서 선택된 코팅제와 가교 될 수 있는 물질인 것일 수 있다.

상기 결합제는 골수유래 줄기세포, 조골세포, 골형성촉진제, 항암제, 면역질환치료제 및 항생제로 이루어진 그룹에서 선택된 것이 추가로 첨가된 것일 수 있다.

상기 코팅제는 골수유래 줄기세포, 조골세포, 골형성촉진제, 항암제, 면역질환치료제 및 항생제로 이루어진 그룹에서 선택된 것이 추가로 첨가된 것일 수 있다.

또한 본 발명은

(1) 골분말을 코팅제로 코팅하여 3차원 프린팅 적층용 조성물을 제조하는 단계;

(2) 상기 (1)단계의 3차원 프린팅 적층용 조성물을 균일하게 펼치는 단계; 및

(3) 상기 (2)단계의 균일하게 펼친 골분말에 대하여 골 재생이 필요한 결손부에 적합한 형상으로 결합제를 적용하는 단계;

를 포함하는 3차원 형상의 골 재생용 스캐폴드의 제조 방법을 제공한다.

상기 (1)단계의 골분말은 사람의 사체에서 유래된 골 분말, 사람을 제외한 동물에서 유래된 골 분말 및 합성된 골분말로 이루어진 그룹에서 선택된 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 사람을 제외한 동물에서 유래된 골 분말은 갑오징어 뼈에서 유래한 골분말일 수 있다.

상기 (1)단계의 코팅제는 피브리노겐, 피브린, 트롬빈, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 홍합접착단백질 및 히알루론산으로 이루어진 그룹에서 선택된 것일 수 있다.

상기 (3)단계의 결합제는 피브리노겐, 피브린, 트롬빈, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 홍합접착단백질 및 히알루론산으로 이루어진 그룹에서 선택된 코팅제와 가교될 수 있는 것일 수 있다.

상기 (3)단계의 코팅제는 골수유래 줄기세포, 조골세포, 골형성촉진제, 항암제, 면역질환치료제 및 항생제로 이루어진 그룹에서 선택된 것이 추가로 첨가된 것일 수 있으며, 상기 결합제는 골수유래 줄기세포, 조골세포, 골형성촉진제, 항암제, 면역질환치료제 및 항생제로 이루어진 그룹에서 선택된 것이 추가로 첨가된 것일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 3차원 형상의 골 재생용 스캐폴드를 제공한다.

본 발명에서 제시하는 3차원 형상 제조를 위한 조성물은 생체친화적이고 조직재생 효과가 높은 조직재생용 생체재료들을 이용함으로써, 생체 독성이 없으며, 3차원형상제작에 범용적으로 사용할 수 있다. 또한 이 기술로 제조된 스캐폴드는 세포 부착 및 생장에 적합한 공극 및 공극률을 가지는바, 조직공학 및 재생의학 분야에 효과적인 골 재생용 스캐폴드를 제공할 수 있다.

도 1은 피브리노겐으로 코팅된 분말시료의 모식도이다.
도 2는 분말 시료를 이용하는 적층 (Layer-by-layer) 형식의 3차원 프린터 방식에 대한 모식도이다.
도 3은 피브리노겐 전 처리된 분말과 결합제 용액으로 트롬빈 용액을 사용하여 제조한 적층방식의 스캐폴드이다.
도 4는 피브리노겐이 코팅된 골분말과 트롬빈 결합제 용액을 사용하여 제조한 스캐폴드의 표면 SEM 이미지이다. (A)는 x30, (B) x200, (C) x800, (D) x2000의 확대율인 경우의 사진이다.
도 5는 스캐폴드의 측면 표면에 관한 사진이다. 각 화살표는 스캐폴드의 제조시 트롬빈으로 층을 형성한 골분말층을 표현하고 있다.
도 6은 스캐폴드에 접종된 중간엽 줄기세포의 시간에 따른 성장곡선이다.
배양접시에서의 세포배양(Plastic culture) (○)은 대조군에 해당하는 인공배양 줄기세포의 성장곡선이며, CB/FG (●)는 갑오징어뼈를 이용하여 제조한 스캐폴드의 줄기세포 성장곡선이다.
도 7은 배양 3일 후의 세포 생존율/세포독성 실험(viability/cytotoxicity assay) 결과이다. 확대율은 x 50이다.
도 8은 스캐폴드에서의 MSCs 배양 후 SEM 을 통한 세포의 부착의 관찰결과이다. (A)는 x200, (B) x2000의 확대율인 경우의 사진이다

상기 코팅제는 피브리노겐, 피브린, 트롬빈, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 홍합접착단백질 및 히알루론산으로 이루어진 그룹에서 선택된 것일 수 있수 있으며, 바람직하게는 피브리노겐일 수 있다.

본 발명에 있어서 "피브리노겐"이란 글로불린에 속하는 단백질로 섬유소원이라고도 하며, 효소 트롬빈에 의하여 불용성인 피브린이 된다. 때로는 5M Urea로 용해하여 산성용액으로 대체시킨 후 만들어진 Fibrin 용액에 중화물질과 함께 트롬빈을 가하여 불용성인 물질을 만들기도 한다.

본 발명에 있어서 "피브린"이란 경단백질(硬蛋白質)의 하나로 혈장 속의 피브리노겐에 효소 트롬빈이 작용하여 생기는 불용성 단백질이다.

또한, 본 발명에 있어서 "트롬빈"이란 혈액이 응고할 때 피브리노겐의 일부 펩타이드를 잘라냄으로써 피브린 중합체를 형성하도록 촉매역할을 하는 단백질 가수분해 효소의 하나이다.

본 발명에 있어서 "콜라겐"이란 동물의 뼈 ·연골 ·이 ·건(腱) ·피부 외에 물고기의 비늘 등을 구성하는 경단백질(硬蛋白質)로 교원질(膠原質)이라고도 한다.　 섬유상 고체로 존재하고, 전자현미경으로 보면 복잡한 가로무늬 구조로 되어 있으며 물 ·묽은 산 ·묽은 알칼리에 녹지 않지만 끓이면 젤라틴이 되어 용해된다.　

본 발명에 있어서 "젤라틴"이란 경단백질 콜라겐의 입체구조를 파괴하여 얻어지는 변성 콜라겐을 의미한다.

본 발명에 있어서 "키토산"이란 게나 가재, 새우 등의 갑각류의 껍질에 들어 있는 키틴을 분해하여 얻어낸 물질을 의미한다.

본 발명에 있어서 "알지네이트"란 알긴산 (Alginic acid)의 다른 이름으로, 갈조류(褐藻類)의 세포막을 구성하는 다당류이다.

본 발명에 있어서 "홍합접착단백질"은 홍합이 바다 속 젖은 표면에 단단히 부착하기 위해 생산 및 분비하는 접착 성분으로서, 이를 직접 추출하거나, 유전자재조합 기술로 제조할 수 있으며, 그 수득 방법을 제한하지 않는다.

본 발명에 있어서 "히알루론산"이란 β-D-N-아세틸글루코사민과 β-D-글루쿠론산이 β-1,3과 β-1,4 결합으로 교대로 결합한 곧은 사슬상의 천연산성 뮤코다당류로써 친수성 때문에 수분을 다량 함유하므로 겔 형태를 생성할 수 있다.

또한, 상기의 피브리노겐, 피브린, 트롬빈, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 홍합접착단백질 또는 히알루론산에는 당해 기술분야의 통상의 기술자가 행할 수 있는 화학적 변형을 가한 산물일 수 있다.

본 발명에 있어서 "스캐폴드"란 조직의 인공적 대체품으로 생체내외에서 세포가 부착하여 자랄 수 있는 지지체 역할을 수행하는 생체재료들을 의미한다. 또한 일정시간이 지나면 생분해되어 사라지고 본래의 조직으로 완전히 복원되도록 하는 기능을 갖는다.

본 발명에 있어서 "3차원 프린팅"이란 분말을 3차원입체를 다층으로 단면화한 정보를 가지고 분말 위에 결합제를 뿌려서 특정부위의 분말을 결합시킴으로써 본래와 유사한 구조로 입체화시키는 기술이다. 즉 분말을 평면에 균일하게 펼친 후 결합제를 뿌려 입자들이 상호 가교되도록 작용하게 되고, 그 위에 다시 분말을 펼치고 결합제를 뿌리는 과정을 반복함으로써 목적하는 형태를 쌓아올려서 입체화된 형태를 만들어 낸다. 이는 잉크젯프린팅 기술을 응용하여 적용하는 것으로 평면에 펼쳐진 분말은 종이에 해당되고, 분말위에 뿌려지는 결합제는 잉크에 해당한다.

본 발명에 있어서 "적층"이란 3차원 구조를 형상화 하기 위하여 목적하는 입체의 구조를 다층으로 단면화시킨 정보를 이용하여 분말 위에 층층이 쌓는 것을 의미하며, 그 방식은 자동식 또는 수동식일 수 있으며 이를 제한하지 않는다.

본 발명에 있어서, "골분말"은 뼈의 재료로 사용될 수 있는 분말형 재료를 의미하며, 그 입수방법을 제한하지 않으며, 의료부산물, 산업 부산물일 수 있으며 상업적으로도 입수할 수 있다. 골분말은 예를 들면 사람의 사체에서 유래된 골 분말, 사람을 제외한 동물에서 유래된 골 분말 또는 합성된 골분말일 수 있으며, 상기 사람을 제외한 동물에서 유래된 골 분말은 바람직하게는 산호, 갑오징어 뼈, 어폐류의 껍질 등의 해산물 유래 골분말 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 갑오징어 뼈에서 유래한 골분말일 수 있다.

상기 골 재생용 스캐폴드의 3차원 프린팅 적층은 도포된 골분말에 결합제를 적용하여 적층하는 것일 수 있으며, 상기 결합제는 결합제는 피브리노겐, 피브린, 트롬빈, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 홍합접착단백질 및 히알루론산으로 이루어진 그룹에서 선택된 코팅제와 가교 될 수 있는 물질인 것일 수 있으며, 바람직하게는 트롬빈일 수 있다.

코딩제와 이와 가교될 수 있는 결합제는 아래 표1과 같이 상호 조합될 수 있으며, 이러한 상호 조합을 제한하지 않는다.

코팅제	결합제
피브리노겐 또는 피브린	Thrombin, Hyaluronic acid, or Glutaraldehyde
트롬빈	Fibrinogen or fibrin
콜라겐	Glutaraldehyde, polyepoxy, EDC {N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride}, Hyaluronic acid
젤라틴	포르말린, 카르보디이미드, Hyaluronic acid
키토산	Glutaraldehyde, 염기성용액, Hyaluronic acid
알지네이트	2가 양이온 용액(예, 염화칼슘), Hyaluronic acid
히알루론산	폴리에틸렌 옥사이드
홍합유래 접착제	Hyaluronic acid

본 발명에서 사용하는 용어인 "조골세포 (osteoblast)"란 골기질을 합성, 분비하고, 기질에 Ca, Mg이온 등의 무기염을 침착시킴으로써 골조직을 석회화시키는 능력을 갖고 있는 세포를 의미한다.

본 발명에서 있어서 골형성촉진제의 예로써 골형성촉진 단백질 (BMP), 부갑상선호르몬 (PTH), Angiogenin, RGD (Arginine-glycine-spartic acid)를 들 수 있으며, 그 범위 및 수득 방법을 제한하지 않는다.

또한 본 발명은

상기 (1)단계의 골분말은 사람의 사체에서 유래된 골 분말, 사람을 제외한 동물에서 유래된 골 분말 또는 합성된 골분말일 수 있으며, 바람직하게는 상기 사람을 제외한 동물에서 유래된 골 분말은 산호, 갑오징어 뼈, 어폐류의 껍질 등의 해산물 유래 골분말 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 갑오징어 뼈에서 유래한 골분말일 수 있다.

상기 (1)단계의 코팅제는 피브리노겐, 피브린, 트롬빈, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 홍합접착단백질 및 히알루론산으로 이루어진 그룹에서 선택된 것일 수 있으며, 바람직하게는 피브리노겐일 수 있다.

상기 (3)단계의 결합제는 피브리노겐, 피브린, 트롬빈, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 홍합접착단백질 및 히알루론산으로 이루어진 그룹에서 선택된 코팅제와 가교될 수 있는 것일 수 있으며, 바람직하게는 트롬빈일 수 있다.

본 발명에 있어서 결합제를 적용시키는 방법으로 펼친 골분말에 결합제를 분사, 도포하는 것 등이 이에 해당 할 수 있으며, 그 방식을 제한하지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 3차원 형상의 골 재생용 스캐폴드를 제공한다.

본 발명에 따는 스캐폴드는 세포 부착 및 세포 성장에 적합한 공극 및 공극률을 갖고 있어, 효율적인 골 재생용 스캐폴드로 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 >

1. 재료 및 방법

1-1: 분말 시료의 준비

본 발명에서 3D printing 을 위한 재료로서 갑오징어 뼈에서 유래한 분말을 사용하였다. 이는 사람뼈와 유사한 물질들을 함유하고 있으며 합성골에 비해 재료비가 저렴하며, 재료확보가 용이하여 본 실험을 위한 분말재료로 선택한 것으로, 권리범위를 한정하고자 함이 아니다. 갑오징어 뼈 분말 (cuttlebone; CB powder)은 서해안에서 서식하는 갑오징어의 가공과정에서 분리된 갑오징어 뼈의 내부 라멜라 (lamellae) 구조층을 분말화하여 건조한 뒤 사용하였다.

1-2: 피브리노겐으로 코팅한 분말시료의 준비

갑오징어뼈 분말을 체로 걸러0.01~50mm크기를 갖는 분말을 30~40mg/mL 농도의 피브리노겐 용액 (Greenplast, 녹십자, Korea)을 동일한 volume으로 혼합하고, 피브리노겐이 각 각의 분말에 함습 및 코팅될 때까지 약 30분동안 충분히 반응시킨후 슬러시 상태로 동결건조기에서 동결하고 진공건조함으로써 다시 분말로 만들었다. 피브리노겐으로 코팅한 골분말의 모식도는 도1과 같다.

1-3: 적층 ( layer - by - layer ) 방법으로 스캐폴드를 형성

피브리노겐에 반응시킨 갑오징어뼈 분말을 이용하여 스캐폴드를 제조하기 위해 도 2의 모식도와 같이 일반적인 3차원 프린팅 방식인 적층 (layer by layer) 원리를 이용하였다. 피브리노겐이 코팅되어있는 갑오징어 뼈 분말을 롤링을 통하여 얇은 층이 형성되게 뿌린 뒤, 결합제인 트롬빈 용액을 뿌려 분말시료의 중합반응을 유도하였다. 일정 높이의 스캐폴드를 제작하기 위하여 도 2 A 에서 도 2C의 과정을 반복해 가며 스캐폴드를 제작하였다.

1-4: 중간엽줄기세포의 배양

실험에 사용된 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cells, MSCs)는 원광대학교 골 재생 연구소에서 분양 받은 장골능 골수에서 분화된 줄기세포를 사용하였다. 세포의 배양은 37 ºC, 5 % 이산화탄소의 조건에서 10 % 우 태아 혈청 (GibcoTM, Invitrogen, USA)과 1 % 항생물질 penicillin-streptomycin (GibcoTM, Invitrogen, USA) 이 함유된 alpha-MEM (GibcoTM, Invitrogen, USA) 배지에 배양하였다.

1-5: 준비한 스캐폴드에 MSCs 의 배양

적층 방식으로 제조된 스캐폴드에서의 중간엽 줄기세포의 세포의 성장과 부착을 평가하기 위하여 도 3과 같이 각각 4 mm x 4 mm x 2 mm 의 형태크기와 8 mm x 8 mm x 2mm 크기의 형태로 제작된 스캐폴드를 사용하였다. 시료의 멸균을 위해 70 % 에탄올에 30 분간 담군 뒤, 1 x PBS 로 10분씩 3회 세척한 뒤 세포배양의 실험에 사용하였다.

1-6: MTS (3-(4,5- dimethylthiazol -2- yl )-5-(3- carboxymethoxyphenyl )-2-(4- sulfophenyl )-2H-tetrazolium) assay

100 mm 조직배양접시에 자란 중간엽 줄기세포를 Tryple Express (GibcoTM, Invitrogen, USA) 를 이용하여 떼어낸 후, 원심분리과정을 거쳐 모아진 세포를 세포 배양액으로 재 부유시킨뒤, 96-well 조직배양접시에 준비된 4 mm x 4 mm x 2 mm 사이즈로 제작된 스캐폴드 위에 5 x 10³ 개의 세포를 접종하고 세포가 스캐폴드에 충분히 붙을 수 있도록 하기 위하여 3시간 뒤에 배지를 첨가하여 배양하였다. 각 예정한 시간에 따라 20 ul 의 MTS solution (CellTiter96? Aqueous solution kit, Promega, Madision, WI)을 첨가한 후, 37℃, 5 % 이산화탄소의 조건에서 4 시간 동안 반응시킨 후, ELISA leader (SpectraMAX M3, Molecular Devices, Sunnyvale, CA )를 이용하여 490 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

1-7: 스캐폴드에서 배양한 MSCs 세포의 생존률 /세포독성 ( Viability / Cytotoxcity ) 검사

스캐폴드에서의 세포의 생존도를 측정하기 위하여 Live/Dead^? Viability/Cytotoxcity kit (Molecular Probe, UK) 를 사용하여 형광 염색을 하였다. 24-well 조직배양접시에 준비된 8 mm x 8 mm x 2 mm 형태의 스캐폴드에 5 x 10⁴ cells씩 접종하고 3시간 뒤에 배지를 첨가하여 세포를 배양하였다. 세포 배양 3 일 후, PBS 를 이용하여 30분간 시료를 세척하여 페놀 레드 (phenol red)와 혈청 (serum)을 제거하고 30 분간 Live/Dead ? Viability/Cytotoxcity solution 을 사용하여 염색하고 형광현미경 (DM IL LED Fluo, Leica, Germany)를 이용하여 세포를 관찰하였다.

1-8: SEM 관찰

제조된 스캐폴드에 1 x 10⁴ cells 세포를 접종 후 3일간 배양 후 scanning electron micrograph (SEM) 촬영을 하였다. 이미지 촬영을 위해 세포가 배양된 스캐폴드를 PBS 로 3회 세척 후 2.5% glutaraldehyde solution (pH 7.4)에서 고정 후 다시 0.1 % osmium tetraoxide solution 에서 1 시간 반응하여 후 고정하였다. 탈수화를 위해 농도별 에탄올 (25 %, 50 %, 75 %, 95 % 및 100 %)에서 반응하였다. 건조된 시료를 백금을 이용하여 코팅하고 SEM (JOM-6360, JEOL, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였다.

2. 결과

2-1: 스캐폴드의 SEM 사진의 관찰

피브리노겐을 분말시료인 갑오징어 뼈 분말에 전 처리하여 재료를 준비하고, 이를 도 2와 같이 결합제 (바인터, binder) 용액으로서 트롬빈을 사용하여 적층방식을 통하여 스캐폴드를 제조하였다. 이 스캐폴드의 표면을 SEM 을 통하여 관찰한 결과, 도4에서 보는 바와 같이 제조된 스캐폴드는 거친 표면을 가지고 있었으며, 각 각의 분말은 피브리노겐과 트롬빈의 중합반응에 의하여 분말이 서로 연결되어 있음을 확인 할 수 있었다. 또한 분말과 분말사이는 공간적 거리가 형성되어 무작위적인 공극이 형성되었음을 알 수 있다.

2-2: 스캐폴드의 측면 layer 사진의 관찰

도2에 제시된 바와 같은 적층 (layer-by-layer) 방식을 통하여 제조된 스캐폴드의 측면을 SEM 을 통하여 관찰한 결과, 도5 에서 보는 바와 같이 각 층들은 약 500㎛ 정도의 두께로 적층되었으며, 그에 따라 적층마다 형성화된 골이 관찰되었다. 이는 피브리노겐을 전 처리한 재료를 사용하고 적층방식을 통한 스캐폴드를 제조하였을 때, 각 분말간의 결합과 함께 각 적층된 면과 면사이가 피브리노겐과 트롬빈의 중합반응에 의하여 적절하게 연결된 스캐폴드가 제조되었음을 제시한다.

2-3: 세포 성장곡선

제조된 스캐폴드에서의 중간엽 줄기세포의 세포 성장을 관찰하기 위하여, 일반적인 세포배양 용기에 접종하여 배양한 세포를 대조구로 사용하였다. 스캐폴드에서의 세포의 성장이 시간에 따라 증가하는 결과로 확인되었다.

또한 도 6에서 보는 바와 같이 1일째 세포의 성장에 따른 OD 값은, 3D 프린팅 스캐폴드 에서 대조구보다 조금 낮은 값을 보였으나 최종 12일째 세포의 성장은 오히려 인공배양 (plastic culture)인 대조구보다 더 높은 OD 값을 보였다.

2-4: 생존률 /세포독성

중간엽 줄기세포에 대한 세포의 독성을 평가하기 위하여 스캐폴드에서 줄기세포를 3일간 배양 후 Live/Dead staining 을 수행하였다. Live/Dead 염색 시약의 성분 중 Calcein AM (green color) 은 살아있는 세포를 염색하며, EthD-1 (red color) 는 손상을 입은 세포나 사멸된 세포를 염색시킨다. 도7에서 보는 바와 같이 제조된 스캐폴드에서 배양되는 세포의 대부분이 녹색 영역에서 관찰되는 반면 붉은 영역은 거의 관찰되지 못하였다. 이는 피브리노겐을 이용한 골 분말 시료와 트롬빈을 이용하여 중합반응으로 제조된 스캐폴드는 중간엽 줄기세포의 생장에 있어서 특이적 독성이 없음을 나타낸다.

2-5: SEM 을 통한 스캐폴드에서의 세포의 부착 관찰

제조된 스캐폴드에서 중간엽 줄기세포를 3일간 배양 후, SEM 을 이용하여 스캐폴드에서의 세포의 부착을 관찰하였다. 도 8에서 보는 바와 같이 세포가 스캐폴드의 표면에 잘 부착되어 자라고 있으며, 이는 스캐폴드 표면내에서 분말과 분말사이의 공간적 표면 구조에서도 세포들끼리 연결부(bridge)가 형성되어 연결상으로 자라고 있음을 알 수 있다.

Claims

코팅제로 코팅된 골 분말을 유효성분으로 포함하는, 골 재생용 스캐폴드의 3차원 프린팅 적층용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 코팅제는 피브리노겐, 피브린, 트롬빈, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 홍합접착단백질 및 히알루론산으로 이루어진 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 골 재생용 스캐폴드의 3차원 프린팅 적층용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 골분말은 사람의 사체에서 유래된 골 분말, 사람을 제외한 동물에서 유래된 골 분말, 합성된 골분말로 이루어진 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 골 재생용 스캐폴드의 3차원 프린팅 적층용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 사람을 제외한 동물에서 유래된 골 분말은 갑오징어 뼈에서 유래한 골분말인 것을 특징으로 하는 골 재생용 스캐폴드의 3차원 프린팅 적층용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 골 재생용 스캐폴드의 3차원 프린팅 적층은 도포된 골분말에 결합제를 적용하여 적층하는 것을 특징으로 하는 골 재생용 스캐폴드의 3차원 프린팅 적층용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 결합제는 피브리노겐, 피브린, 트롬빈, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 홍합접착단백질 및 히알루론산으로 이루어진 그룹에서 선택된 코팅제와 가교 될 수 있는 물질인 것을 특징으로 하는 골 재생용 스캐폴드의 3차원 프린팅 적층용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 코팅제는 골수유래 줄기세포, 조골세포, 골형성촉진제, 항암제, 면역질환치료제 및 항생제로 이루어진 그룹에서 선택된 것이 추가로 첨가된 것을 특징으로 하는 골 재생용 스캐폴드의 3차원 프린팅 적층용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 결합제는 골수유래 줄기세포, 조골세포, 골형성촉진제, 항암제, 면역질환치료제 및 항생제로 이루어진 그룹에서 선택된 것이 추가로 첨가된 것을 특징으로 하는 골 재생용 스캐폴드의 3차원 프린팅 적층용 조성물.
(1) 골분말을 코팅제로 코팅하여 3차원 프린팅 적층용 조성물을 제조하는 단계;
(2) 상기 (1)단계의 3차원 프린팅 적층용 조성물을 균일하게 펼치는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계의 균일하게 펼친 골분말에 대하여 골 재생이 필요한 결손부에 적합한 형상으로 결합제를 적용하는 단계;
를 포함하는 3차원 형상의 골 재생용 스캐폴드의 제조 방법.
제9항에 있어서, 상기 (1)단계의 골분말은 사람의 사체에서 유래된 골 분말, 사람을 제외한 동물에서 유래된 골 분말 및 합성된 골분말로 이루어진 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 3차원 형상의 골 재생용 스캐폴드를 제작하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 사람을 제외한 동물에서 유래된 골분말은 갑오징어 뼈에서 유래한 골분말인 것을 특징으로 하는 3차원 형상의 골 재생용 스캐폴드의 제조 방법.
제9항에 있어서, 상기 (1)단계의 코팅제는 피브리노겐, 피브린, 트롬빈, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 홍합접착단백질 및 히알루론산으로 이루어진 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 3차원 형상의 골 재생용 스캐폴드의 제조 방법.
제9항에 있어서, 상기 (3)단계의 결합제는 피브리노겐, 피브린, 트롬빈, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 홍합접착단백질 및 히알루론산으로 이루어진 그룹에서 선택된 코팅제와 가교될 수 있는 것을 특징으로 하는 3차원 형상의 골 재생용 스캐폴드의 제조 방법.
제9항에 있어서, 상기 (1)단계의 코팅제는 골수유래 줄기세포, 조골세포, 골형성촉진제, 항암제, 면역질환치료제 및 항생제로 이루어진 그룹에서 선택된 것이 추가로 첨가된 것을 특징으로 하는 3차원 형상의 골 재생용 스캐폴드의 제조 방법.
제9항에 있어서, 상기 (3) 단계의 결합제는 골수유래 줄기세포, 조골세포, 골형성촉진제, 항암제, 면역질환치료제 및 항생제로 이루어진 그룹에서 선택된 것이 추가로 첨가된 것을 특징으로 하는 3차원 형상의 골 재생용 스캐폴드의 제조 방법.
제9항 내지 15항의 방법으로 제조된 3차원 형상의 골 재생용 스캐폴드.