KR101628677B1

KR101628677B1 - 세포외기질 단백질-골미네랄 복합체를 함유하는 조직 구조 모사체 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101628677B1
Application number: KR1020130035850A
Authority: KR
Inventors: 정종평; 박윤정; 이주연
Original assignee: 주식회사 나이벡
Priority date: 2013-04-02
Filing date: 2013-04-02
Publication date: 2016-06-09
Also published as: WO2014163371A1; EP2982387A4; KR20140120133A; EP2982387A1; US10232083B2; EP2982387B1; US20160058909A1; HK1221180A1

Abstract

본 발명은 조직의 재생을 위해 사용되는 조직 구조 모사체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 세포외기질 단백질-골미네랄 성분의 복합체와 재생기능성 펩타이드가 특이적으로 결합되어 있어 회복을 요하는 조직의 환경을 구현할 수 있는 3차원 조직 구조 모사체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 조직 구조 모사체는 골미네랄성분이 세포외기질 단백질에 미세하게 분산되어 있어 조직 구조 모사체의 기계적 강도에 도움을 주고, 조직의 재생에 관여하는 세포의 이동경로를 제공하는 전도성을 지닐 뿐 아니라, 함유되는 펩타이드에 의해 조직의 환경을 구현할 수 있어 최종적으로는 조직재생력을 극대화할 수 있다.

Description

세포외기질 단백질-골미네랄 복합체를 함유하는 조직 구조 모사체 및 그 제조방법 {Regenerative tissue mimicking complex comprising extracellular matrix protein and minerals and method for preparing the same}

본 발명은 조직의 재생을 위해 사용되는 조직 구조 모사체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 세포외기질 단백질-골미네랄 성분의 복합체 또는 세포외기질 단배질-골미네랄 성분의 복합체와 재생기능성 펩타이드로 이루어진 3차원 조직 구조 모사체 및 그 제조방법에 관한 것이다.

인체 내 뼈 및 치아를 포함하는 경조직은 대략 80%의 무기질 및 수분과 20%의 유기물질을 포함하고 있고, 유기물 중 80%는 콜라겐성 단백질, 그리고 20%는 비콜라겐성 단백질로 이루어져 있다. 이들 단백질 성분은 경조직의 생성, 구조적인 강도 및 탄성을 유지하는데 기여할 뿐 아니라 골아세포 등의 경조직 형성 세포의 부착을 유도하고, 경조직 성분을 구성하는 무기이온 성분을 배향시키는 매트릭스로서 작용한다 (Anselme, Osteoblast adhesion on biomaterials, Biomaterials, 21 (7): 667-81, 2000).

인체 유래 단백질을 생체의 기능을 치환, 대체하기 위한 의료용 생체재료로 개발하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있으며, 생명공학적 기술의 발전으로 천연조직을 모방한 다양한 생체재료도 개발되었다.

생체재료는 생물학적으로 적합해야하며, 인체와의 접촉 정도에 따라 3개의 군으로 나누며, 제1급은 인체와 직접 접촉하지 않거나 접촉하더라도 체액조성에 변화를 주지 않는 것, 제2급은 간헐적 또는 24시간 이내의 단기간 접촉하는 것 및 제3급의 인체 내에 삽입되어 지속적으로 조직과 접촉하는 것으로 구분하고 있으며, 특히 이식체인 제3급 재료는 인체에 대하여 완전한 안전성이 보장되어야 한다 (의료기기 허가·신고·심사 등에 관한 규정, 식품의약품안전청). 이들 제3급 재료는 주변 조직과의 생물학적 반응형태에 따라 이식후 면역반응을 일으키지 않으면서 형태와 구조를 유지하는 생체불활성(bioinert), 주위조직과 직접 결합하여 생물학적 기능을 제공하는 생체활성(bioactive), 및 이식후 서서히 체내에서 분해되어 재생하는 자가조직으로 치환되는 생분해성(biodegradable) 재료로 나누어 볼 수 있다. 또한 생체재료는 생체안정성(biostability)과 생체적합성(biocompativility)을 고려하여야 한다. 천연조직을 생체재료로서 이용하는 방법의 대표적인 것은 동종이식(allograft)이지만 최근 분자생물학, 단백질공학 등의 발달에 의해 천연조직 자체를 처리하여 직접 사용하거나 필요한 조직성분을 추출하여 이용하는 것이 가능하게 되었다 (의료용 고분자소재, 한국과학기술정보연구원).

생체재료로써 이용되는 천연고분자의 대표적인 것은 세포외기질 단백질이며 특히 콜라겐, 섬유결합소(Fibronectin), 비트로넥틴(Vitronectin) 등이 대표적이다. 예를 들어 콜라겐이나 섬유결합소에는 세포접착을 유도하는 아르기닌(Arginine:R) - 글리신(Glycine:G) - 아스파르트 산(Aspartic acid:D)으로 구성된 펩티드 서열이 포함되어 있어, 생체재료의 표면에 RGD 펩티드를 인공적으로 배열하면 재료표면과 세포의 접착을 유도하는 환경을 제공하므로 주위세포와의 결합으로 천연조직의 기능을 모사할 수 있다 (도 1)(Grzesik et al., Bone matrix RGD glycoproteinsimmunolocalization and interaction with human primary osteoblastic bone cells in vitro, J Bone Miner Res, 9: 487-496, 1994).

또한 이들 콜라겐성 단백질은 피부진피층, 점막층 등의 연조직에도 존재하며 이들의 교원질 섬유는 피하조직내에서 다발을 형성하고 체액성분 중 무기질이온과도 결합하여 진피 및 점막조직의 탄성을 유지하고 세포의 증식 및 연조직 형성에서의 기저 매트릭스로서의 작용하기도 한다 (Casser-Bette et al., Bone formation by osteoblast-like cells in a three dimensional cell culture, Calcif Tissue Int, 46: 46-56, 1990). 따라서 골조직 결손부나 피하조직 수복을 위한 재료로 아파타이트를 포함하는 무기질을 제조하거나 고분자나 단백질의 표면을 무기질로 코팅하여 제작한 생체재료에 대한 연구가 계속되어왔다.

그러나 기존의 아파타이트를 포함하는 무기질재 또는 합성 및 천연고분자, 특히 콜라겐 기원 단백질을 단독으로 적용되었던 조직재생술은 최종적으로 생체 기능의 완전 회복이라는 조직의 생역학적 역할 면에서는 효과가 제한적이었다.

조직 재생용 생체재료의 목적은 이식 후에 손상된 조직의 생역학적 역할을 유지하고, 이를 통해 조직의 형태학적, 생리학적 기능을 복원시키는 것이다. 따라서 생체재료로 사용하기 위한 아파타이트 이식재료는 즉시 사용이 가능하고, 면역반응을 일으키지 않으며, 빠른 조직생성 및 조직내의 재혈관화를 촉진하고 조직의 지지와 연속성을 유지하는 등의 기본적인 조건을 만족시켜야 한다 (의료용 고분자 소재, 한국과학기술정보연구원).

아파타이트-단백질 구조체는 구조안정성 측면에서 기존의 단순 혼합체와는 달리 체액에 의해 구조체가 팽윤 되더라도 보유하는 골미네랄이 구조체 밖으로 이탈되지 않아야 한다. 구조체에서 이탈되지 않고 안정하게 함유된 아파타이트는 최종적으로 세포의 이동시에 안정한 전도체로서의 역할을 수행할 수 있다. 또한 아파타이트를 함유하는 단백질성 구조체 역시 앞서 열거한 조직생성능 및 조직내 재혈관화에 기여를 해야 한다. 즉, 제작된 아파타이트-단백질 구조체는 세포의 증식 및 조직형성에 있어서의 전도성을 제공하여야 한다. 그러나 이들 구조체는 자체가 골전도성을 가지는 매개체로서의 작용은 하지만 치료기간의 단축에 필수적인 초기 조직형성을 위한 조직유도력은 가지고 있지 않다.

상기와 같은 단점을 보완하고 이러한 구조체를 더욱 조직 환경에 가깝게 모사할 수 있도록 구조체에 세포외 기질 단백질, 조직성장인자 또는 조직형성 단백질과 같은 생리활성 물질을 조직재생재료와 함께 사용된 연구들이 진행되었고, INFUSE (BMP-2 함유), GEM21S (PDGF 함유) 등의 제품이 개발되었다 (Anselme, Osteoblast adhesion on biomaterials, Biomaterials, 21 (7), 667-681, 2000). 그러나 이들 단백질은 구조체에 안정적으로 고정되어 있지 않고, 구조체로부터 방출되어 전신혈에 노출시 분해되므로, 조직재생 활성을 지속적으로 유지하기 어려운 문제점이 있다.

따라서 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 조직환경을 구현하면서 손상된 조직에 생체재료를 충진 시 조직 내에서 세포 이동을 전도할 수 있는 기능성을 가지고, 최종적으로는 단백질이나 생리활성물질에 의해 재생기능을 유도할 수 있는 구조 및 기능 모사체의 개발이 필요하게 되었다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자 예의 노력한 결과, 경조직의 구성과 유사한 조성을 가지도록 세포외기질과 골미네랄 성분이 유기적으로 결합된 조직 구조 모사체를 개발하였고, 경조직 뿐만 아니라 이식부위의에 형태에 따라 성형이 가능하여 조직 재생에 높은 효과를 가진다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 세포외기질 단백질에 기계적 강도를 증진시킬 수 있는 마이크로 크기의 아파타이트 기반 골미네랄을 안정하게 함입시킨 조직의 재생에 적합한 3차원 조직 구조 모사체 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 세포외기질 단백질과 골미네랄 입자의 혼합체를 성형하는 단계; (b) 동결 및 해동을 반복하여 단밸질의 구조를 정렬화하는 단계; (c) 단당류 용액을 가하여 가교하는 단계; 및 (d) 동결건조하는 단계를 포함하는 조직 구조 모사체의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 세포외기질 단백질과 골미네랄 입자의 혼합체를 성형하는 단계; (b) 동결 및 해동을 반복하여 단밸질의 구조를 정렬화하는 단계; (c) 단당류 용액을 가하여 가교하는 단계; (d) 가교된 세포외기질-단백질 복합체에 재상기능성 펩타이드를 결합시키는 단계; 및 (e) 동결건조하는 단계를 포함하는 조직 구조 모사체의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 세포외기질 단백질과 골미네랄 입자의 혼합체를 성형하는 단계; (b) 동결 및 해동을 반복하여 단밸질의 구조를 정렬화하는 단계; (c) 단당류 용액을 가하여 가교하는 단계; 및 (d) 동결건조하는 단계로 제조된 조직 구조 모사체를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 세포외기질 단백질과 골미네랄 입자의 혼합체를 성형하는 단계; (b) 동결 및 해동을 반복하여 단밸질의 구조를 정렬화하는 단계; (c) 단당류 용액을 가하여 가교하는 단계; (d) 가교된 세포외기질-단백질 복합체에 재상기능성 펩타이드를 결합시키는 단계; 및 (e) 동결건조하는 단계로 제조된 조직 구조 모사체를 제공한다.

본 발명의 조직 구조 모사체는 골미네랄성분이 세포외기질 단백질에 미세하게 분산되어 있어 조직 구조 모사체의 기계적 강도가 우수하고, 조직의 재생에 관여하는 세포의 이동경로를 제공하는 전도성을 가진다. 또한 조직 구조 모사체에 함유된 펩타이드에 의해 조직의 환경을 구현할 수 있어 조직재생력을 현저하게 높일 수 있다.

도 1은 이온성 용액인 체액 속에 섬유성 단백질인 교원질이 형성하는 구조체와 당, 무기질 등으로 이루어진 세포외기질에 세포가 접착되어 조직을 형성한 조직 구성의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 조직 구조 모사체의 시차주사현미경사진이다.
도 3은 동결 및 해동의 횟수에 따른 조직 구조 모사체의 압축강도의 변화를 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 조직 구조 모사체와 타사세품의 압축강도를 비교한 그래프이다.
돈 5는 본 발명의 조직 구조 모사체의 수팽윤에 의한 안정성을 측정한 결과이다.
도 6은 본 발명의 조직 구조 모사체의 공초점 주사형광 현미경 사진이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 일 관점에서, (a) 세포외기질 단백질과 마이크로 사이즈의 골미네랄 입자의 혼합체를 일정크기의 성형몰드에 주입하는 단계; (b) 급속 동결 및 해동을 반복하여 단백질의 구조를 정렬화하는 단계; (c) 단당류 용액을 가하여 가교하는 단계; (d) 동결건조 단계를 포함하는 조직구조 모사체의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서 조직 구조 모사체 중 세포외기질 단백질은 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 황산콘드로이틴 또는 피브로인 중에서 선택할 수 있다. 이들 세포외기질은 사람, 동물에서 유래한 것과 미생물에서 생산된 재조합 단백질 모두를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 골미네랄 성분은 당업계에서 사용하는 모든 종류의 아파타이트 기반 재료로 동종골, 소뼈 말뼈 돼지뼈 등에서 기인한 생물유래 골미네랄 분말 및 합성 수산화아파타이트, 트리칼슘인산 마이크로분말 등이 있다.

상기 골미네랄 성분 및 세포외기질 단백질은 재생 기능성 펩타이드의 부착이 용이하도록 표면을 개질할 수도 있다.

본 발명에 있어서 골미네랄 성분과 세포외기질 단백질의 비율은 다양하게 변화시킬 수 있다. 골조직과 같은 경조직 재생용인 경우에는 골미네랄 성분의 함량이 전체 중량의 80%이상인 것이 바람직하고 더욱 바람직하게는 80~95%이다. 피하조직과 같은 연조직의 재생용인 경우에는 골미네랄 성분의 함량이 전체 중량의 35%이하인 것이 바람직하고, 5~35% 인 것이 더욱 바람직하다. 골미네랄 성분의 함량이 높을수록 기계적 강도가 증가하기 때문에, 각 조직의 구조적 특성에 맞는 비율의 조직 구조 모사체를 사용해야 한다.

본 발명에 따른 조직 구조 모사체는 세포외기질 단백질과 마이크로 사이즈의 골미네랄 입자의 혼합체를 온도를 변화시켜 단백질의 구조를 정렬화하여 물리적으로 가교화 한 후, 단당류 더욱 바람직하게는 리보오스 등의 당 용액으로 화학적으로 가교화하여 동결건조하여 제조함으로써, 단백질 네트워크 안에 골미네랄이 포집되어 있는 구조를 이루게 한다.

본 발명의 (b) 단계에서 단백질의 구조를 정렬화하는 단계란 단백질 사슬간의 위치가 가까워지면서, 단백질 사슬사이의 소수성결합, 수소결합 등이 형성되어 단백질 사슬의 배열을 정렬시킴으로써 구조를 안정화하는 것을 의미한다.

상기의 제조방법으로 제조된 조직 구조 모사체는 단순한 혼합과 동결건조에 의해 제조된 구조체보다 탄성이 증가하고, 골미네랄 성분이 체액 등에 접촉하여도 분출되어 나오지 않아 안정하게 모사체의 구조를 유지할 수 있도록 한다.

본 발명에 따른 세포외기질 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 펩타이드는 엘라스틴 부착 펩타이드, 히알루론산 부착 펩타이드 등을 사용할 수 있고, 이들은 N-말단에 자유아미노기나 시스테인기를 가지도록 합성할 수 있거나 혹은 물리적인 혼합으로도 구조체를 이루는 단백질에 친화성이 있어 안정하게 존재할 수 있도록 할 수 있다.

엘라스틴 부착 펩타이드는 QSIDTNSHQDH, TEDVEKDQSE, EEHRQSFEDEQ, NEQQTLSRV, SRMNKNGDK, NKKPKNPKRRT, KKAQEAKNAE, EARKAEEARI, DDATSQLNGN, LKAASKDDAD, LSTLSALQQK, ADARFADAAA, KSNQQSNSQN, GSKGGKGKSS 중 어느 하나를 사용할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

히알루론산 부착 펩타이드는 CRLLGLSLA, CSYGWVGDGFV, VRYPIRAPR, VISRISPNPRC, KQKIKHVVKLK, KLRCQLAKKKQ, CRYRYEPAL, VSPRRVRVKWWK, VRSYGPRHRRLHR, CNGRCGGRRAVL, GSPRVKWTFLS, SRGRGGRGVRVKVNEAYRFR, ILREAERRRQ, EKPGDRFDRDRPLR, PLRGRGGPRGGMRGRGRGG, PRPGRGARGGTRGGRG, GRIRRAENYG, KNLSKVVAR, RPRGCGRGRGGNQGRGRGGGINK, KAVVIHKSK, RQQQLQRKRRDE, RPLRGRGGPRGGMRGRGRGGPGNR중 어느 하나의 서열을 사용할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

한편, 동결 및 해동의 시간, 온도, 동결/해동의 반복횟수에 따라 조직 구조 모사체의 기계적인 강도를 조절할 수 있고 더 나아가는 단당류 용액의 농도 및 반응시간에 따라 조직 구조 모사체의 최종적인 강도가 달라질 수 있다.

본 발명의 (b) 단계에서 - 80^oC에서 2시간, 상온 (15-30^oC)에서 1시간을 방치하는 것을 3회 내지 5회 반복하여 세포외기질 단백질의 배열을 정렬시켰다. 동결 및 해동을 3회 미만으로 실시할 경우, 구조를 배열시키는 작용이 충분치 않으며, 5회를 초과할 경우에는 세포외기질 단백질의 구조를 배열시키는 작용이 더 이상 증가하지 않는다.

본 발명의 (c) 단계에서 단당류 용액의 반응 농도는 2.5%(w/w) 내지 5%(w/w)를 사용하며, 2.5%(w/w) 미만일 경우, 가교반응이 충분히 일어나지 않으며, 7.5%(w/w)를 초과할 경우, 가교반응이 농도에비례해서 증가하지 않는다.

본 발명에 있어서, 사용되는 단당류는 알도스, 케토스, 알도스의 유도체, 케토스의 유도체, 글리세로스, 트레오스, 에리트로스, 릭소스, 자일로스, 아라비노스, 리보스, 알로스, 알트로스, 글루코스, 프룩토스, 만노스, 글로스(gulose), 아이도스(idose) 등을 사용할 수 있다. 실시예에서 예시된 것뿐만 아니라 다른 단당류를 이용하는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 용이하게 적용가능하다.

본 발명에 있어서, 세포외기질 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 펩타이드는 단당류에 의해 가교를 진행한 후에 조직 구조 모사체에 흡수·결합시킴으로써펩타이드가 고정된 구조체를 얻을 수 있다.

상기 펩타이드를 화학적으로 고정시킬 경우에는 단위무게당(g) 1-1000mg이 고정되도록 하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 상기 펩타이드는 5-30개의 아미노산으로 구성되고 이들 펩타이드는 조직 구조 모사체의 단위무게당 100-500mg을 고정하도록 한다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

실시예 1 : 소뼈유래 골미네랄 입자와 콜라겐으로 이루어진 구조체 (10% 콜라겐함유)

소뼈 유래 골미네랄 입자는 0.2-0.4mm의 입자도를 가지도록 제작하였다. 골미네랄 성분 90mg에 0.1M 아세트산에 용해한 2% (w/v) 돼지피부 유래 콜라겐 용액 500ul를 혼합하여, 콜라겐 중량이 전체 중량비율의 10%가 되도록 하였다. 상기의 혼합물을 성형몰드에 충진하였고, 이는 다시 -80^oC에서 2시간 동결 및 상온 (15-30^oC)에서 1시간 동안 해동하는 동결/해동 단계를 3 회 반복하였다. 이후에 암모니아 증기가 포화된 수조 내에 방치하여 콜라겐-골미네랄 혼합체에 포함된 아세트산을 중화시켰다. 중화된 콜라겐-골미네랄 복합체를 5% 리보스 용액과 24시간 반응시키고, 잔류 리보오스를 정제수로 세척하였다. 세척후에 동결건조를 진행하여 콜라겐과 골미네랄 성분이 함유된 조직 구조 모사체를 얻었다.

실시예 2 : 말뼈유래 골미네랄 입자와 콜라겐으로 이루어진 구조체 (10% 콜라겐함유)

말뼈 유래 골미네랄 입자는 0.2-0.4mm의 입자도를 가지도록 제작하였다. 골미네랄 성분 90mg에 0.1M 아세트산에 용해한 2% (w/v) 돼지피부 유래 콜라겐 용액 500ul를 혼합하여, 콜라겐 중량이 전체 중량비율의 10%가 되도록 하였다. 상기의 혼합물을 성형몰드에 충진하였고, 이는 다시 -80^oC에서 2시간 동결 및 상온 (15-30^oC)에서 1시간 동안 해동하는 동결/해동 단계를 3 회 반복하였다. 이후에 암모니아 증기가 포화된 수조 내에 방치하여 콜라겐-골미네랄 혼합체에 포함된 아세트산을 중화시켰다. 중화된 콜라겐-골미네랄 복합체를 5% 리보스 용액과 24시간 반응시키고, 잔류 리보오스를 정제수로 세척하였다. 세척 후에 동결건조를 진행하여 콜라겐과 골미네랄 성분이 함유된 조직 구조 모사체를 얻었다.

실시예 3 : 소뼈유래 골미네랄 입자와 콜라겐으로 이루어진 구조체 (80% 콜라겐함유)

소뼈 유래 골미네랄 입자는 0.05 - 0.1mm의 입자도를 가지도록 제작하였다. 골미네랄 성분 200mg에 0.1M 아세트산에 용해한 2% (w/v) 돼지피부 유래 콜라겐 용액 4ml를 혼합하여, 콜라겐 중량이 전체 중량비율의 80%가 되도록 하였다. 상기의 혼합물을 성형몰드에 충진하였고, 이는 다시 -80^oC에서 2시간 동결 및 상온 (15-30^oC)에서 1시간 동안 해동하는 동결/해동 단계를 3 회 반복하였다. 이후에 암모니아 증기가 포화된 수조 내에 방치하여 콜라겐-골미네랄 혼합체에 포함된 아세트산을 중화시켰다. 중화된 콜라겐-골미네랄 복합체를 5% 리보스 용액과 24시간 반응시키고, 잔류 리보오스를 정제수로 세척하였다. 세척후에 동결건조를 진행하여 콜라겐과 골미네랄 성분이 함유된 조직 구조 모사체를 얻었다

실시예 4 : 소뼈유래 골미네랄 입자와 콜라겐으로 이루어진 구조체 (70% 콜라겐함유)

소뼈 유래 골미네랄 입자는 0.2-0.4mm의 입자도를 가지도록 제작하였다. 골미네랄 성분 30mg에 0.1M 아세트산에 용해한 2% (w/v) 돼지피부 유래 콜라겐 용액 3.5ml를 혼합하여, 콜라겐 중량이 전체 중량비율의 70%가 되도록 하였다. 상기의 혼합물을 성형몰드에 충진하였고, 이는 다시 -80^oC에서 2시간 동겨 및 상온 (15-30^oC)에서 1시간 동안 해동하는 동결/해동 단계를 3 회 반복하였다. 이후에 암모니아 증기가 포화된 수조 내에 방치하여 콜라겐-골미네랄 혼합체에 포함된 아세트산을 중화시켰다. 중화된 콜라겐-골미네랄 복합체를 5% 리보스 용액과 24시간 반응시키고, 잔류 리보오스를 정제수로 세척하였다. 50ul의 인산염완충액에 엘라스틴 부착 펩타이드 (EEHRQSFEDEQ) 20mg을 용해하고, 각 성형몰드에 충진된 조직 구조 모사체에 가한 후, 24시간동안 냉장온도 (4-8^oC)에서 방치하였다. 이를 동결건조하여 콜라겐, 골미네랄 성분, 펩타이드가 함유된 조직 구조 모사체를 얻었다.

실험예 1 : 조직 구조 모사체의 구조 관찰

실시예 1 내지 4에서 제조된 조직 구조 모사체와 대조군인 타사제품(BioOss-collagen, Geistlich, 스위스)을 시차주사전자현미경으로 관찰하였다. 각각의 조직 구조 모사체를 gold로 코팅하고, 시차주사현미경 (field emission scanning electron microscope, FE-SEM, Jeol, S-4700, Japan)로 관찰하였다.

도 2는 각 조직 구조 모사체의 시차주사현미경 사진이다. 실시예 1-4에서 제조된 조직 구조 모사체는 세포외기질 단백질의 네트워크에 골미네랄 성분이 혼합되어 있는 것을 관찰할 수 있었다. 반면, 타사제품의 경우, 골미네랄 성분이 잘 관찰되지 않았다.

실험예 2 : 동결 및 해동 횟수에 따른 조직 구조 모사체의 압축 강도 변화 측정

실시예 1의 조직 구조 모사체에 대한 동결 및 해동 횟수에 따른 기계적 강도의 영향을 관찰하기 위해, 동결 및 해동 횟수를 변화시켜 제조한 조직 구조 모사체의 압축강도를 측정하였다. 시험방법은 ASTM D 638에 준하여 샘플사이즈에 맞게 지간거리 조정하였다. 측정기기는 UTM (WL2100)였고, 측정 speed는 5mm/min였다. 로드셀은 200 N를 사용하였고, 지간거리 (표점거리)는 10mm를 하여, 압축강도 (compressive strength)를 측정하였다.

표 1은 동결 및 해동 횟수를 변화시켜 제조한 조직 구조 모사체의 압축강도의 결과를 표시한 것이다. 동결건조횟수가 0회일 때는 2.77kPa였으나, 3회 3.54kPa, 5회 3.75kPa로 증가하였다. 6회이상 실시하였을 때는 3.82kPa로 압축강도가 크게 증가하지 않았다. 표 1을 그래프로 정리한 도 3에 의하면, 동결해동 횟수는 3-5회 사이에 압축강도가 많이 증가한다는 것을 알 수 있었다.

동결건조 횟수에 따른 압축강도의 변화

동결해동횟수	압축강도 (kPa)
0	2.77
1	2.89
3	3.54
5	3.75
6	3.82
8	3.81

실험예 3 : 리보오스에 의한 조직 구조 모사체의 가교도 측정

실시예 1에서 리보오스 용액의 농도 0, 1, 2.5, 5, 7.5, 10%로 변화시켜 제조한 조직구조 모사체의 가교도를 측정하였다. 가교도는 히드록시프롤린을 정량하여 측정하였다. 가교도가 높을수록, 측정되는 히드록시프롤린의 양이 감소하는 경향을 보인다. 시료는 5mg을 칭량하여 5N HCl 1ml을 첨가하여 100에서 10시간 가열하여 가수분해하였다. 히드록시프롤린 표준물질을 사용하여 검량선을 측정하였다. 표준물질과 시료에 1% 페놀프탈레인 한 방울을 첨가하고, 0.1 N KOH와 0.8 N KOH로 pH를 조정하여 옅은 핑크색이 되도록 하였다. 0.1M 붕산나트륨 완충액(sodium borate buffer) (pH 8.7)를 각 시료에 0.5ml씩 첨가하고 혼합하였다. 0.2M 클로라민 T 용액(chloramine T solution) 2ml를 첨가하고 상온에서 25분 동안 반응시켰다. 3.6M 티오황산나트륨(sodium thiosulfate) 1.2ml를 첨가하고, 1.5ml KCl과 2.5ml 톨루엔을 첨가하였다. 원심분리하여 상층의 톨루엔 층을 제거하고, 끓는 물에서 30분 동안 중탕한 후, 상온에서 냉각하였다. 2.5 ml 톨루엔을 첨가하고, 원심분리한 후, 상층의 톨루엔 층을 1.5ml을 취해 새로운 튜브에 담았다. 엘리히 시약(Ehrlich? reagent)을 0.6ml 첨가하고, 30분 동안 반응시켰다. 2개의 층으로 나눠지지 않도록 계속 혼합하고, 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표 2는 리보오스 농도 변화에 의한 가교도의 값을 표시한 것이다. 표 2에 따르면 리보오스 농도가 1%일 때는 가교도가 4%였으나, 리보오스 농도가 2.5-7.5% 사이일 때, 가교도가 11-32%로 증가하는 것을 알 수 있었다. 리보오스 농도가 7.5%를 초과하였을 때는, 가교도가 크게 증가하지 않았다.

리보오스 농도 변화에 따른 가교도 측정

리보오스 농도 (%, w/w)	가교도 (%)
0	0
1	4
2.5	11
5	28
7.5	32
10	34

실험예 4 : 각 조직 구조 모사체의 압축강도 측정

실시예 1 내지 4에서 제조된 조직 구조 모사체와 대조군인 타사제품의 압축강도를 측정하였다. 시험방법은 ASTM D 638 에 준하여 샘플사이즈에 맞게 지간거리 조정하였다. 측정기기는 UTM (WL2100)였고, 측정 speed는 5mm/min였다. 로드셀은 200 N를 사용하였고, 지간거리 (표점거리)는 10mm를 하여, 압축강도 (compressive strength)를 측정하였다.

표 3은 각 조직 구조 모사체의 압축강도의 값을 표시한 것이며, 도 4는 각 조직 구조 모사체의 압축강도를 나타낸 그래프이다. 실시예 1, 2 및 4에서 제조된 조직 구조 모사체는 각각 3.55, 3.78 및 3.67 kPa의 압축강도를 보였으며, 골미네랄 성분의 함량이 낮은 실시예 3에서 제조된 조직 구조 모사체는 1.44kPa의 압축강도를 보였다. 타사제품의 경우, 2.05kPa를 보였다. 실시예 1, 2 및 4에서 제조된 조직 구조 모사체의 기계적 강도가 우수하여 경조직의 재생에 적합하며, 실시예 3에서 제조된 조직 구조 모사체는 연조직 재생에 적합한 것을 알 수 있었다.

각 실시예에 의해 제조된 조직 구조 모사체의 압축강도 측정

	압축강도 (kPa)
실시예1	3.547
실시예2	3.78
실시예3	1.44
실시예4	3.67
타사제품	2.05

실험예 5 : 수팽윤에 의한 조직 구조 모사체의 안정성 시험

실시예 1-4에서 제조된 조직 구조 모사체의 수팽윤에 의한 안정성을 평가하였다. 제조된 조직 구조 모사체 및 타사제품의 무게를 각각 측정하고, 인산완충액 1mL을 가한 직후 과량의 인산완충액을 필터 페이퍼로 제거하고 무게를 측정하였다. 수화한지 1시간 후, 무게를 측정하여 구조안정성을 확인하였다. 표 4는 수팽윤에 의한 안정성을 측정한 결과값이며, 도 5는 측정된 수팽윤 안정성 값을 나타낸 그래프이다. 타사제품의 경우 수화 즉시 콜라겐이 붕괴되면서 골미네랄의 분출을 확인할 수 있었으며, 무게의 감소가 가장 컸다. 그러나 본 발명에 의해 제조된 조직 구조 모사체는 인산완충액에 수화되고 팽윤되어도 구조를 안정하게 유지하고 있으며, 무게의 감소도 크지 않았다. 또한 함유된 골미네랄입자의 분출도 억제하고 있음을 확인하였다 .

수팽윤 안정성 측정

	수팽윤 안정성 (%)
실시예1	89
실시예2	86
실시예3	75
실시예4	91
타사제품	45

실험예 6 : 세포 분화 시험

실시예 1 및 3의 조직구조 모사체에 C2C12 (America Type Culture Collection, CRL-1772)를 칼세인 (1ug/mL, 칼슘염색 형광물질, 녹색)이 포함된 경조직 형성 배지에서 14일 동안 배양하였다. 배양된 세포를 2% 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액으로 고정하였다. 고정된 골이식재를 1% 트리톤 엑스 100 (triton X-100)으로 처리한 후 DAPI 용액(파란색)을 첨가하여 핵을 염색하였다. 염색 후 세척하여 시편을 고정한 후, 골조직 분화의 마지막 단계인 세포외 기질에 침착된 칼슘을 고정된 골이식재 표면에서 공초점 주사형광 현미경 (Confocal Laser Scanning Microscope)으로 관찰하였다.

도 6는 각 조직 구조 모사체의 공초점 주사형광 현미경 사진이다. 타사제품의 경우, 침착된 칼슘이 거의 없었으나, 실시예 1에서 제조된 조직 구조 모사체에서 칼슘이 침착된 것이 관찰되었다. 실시예 4에서 제조된 펩타이드가 함유된 조직 구조 모사체의 경우, 침착된 칼슘의 양이 더 많았다. 본 발명에 의해 제조된 조직 구조 모사체는 골세포의 분화에 더 효과적이었으며, 엘라스틴 부착 펩타이드가 함유된 경우 조직의 환경을 구현할 수 있어서 그 효과가 더 큰 것을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 단계를 포함하는 세포외기질 단백질-골미네랄 성분의 복합체로 이루어진 경조직 재생용 조직 구조 모사체의 제조방법:
(a) 골미네랄 성분의 함량이 전체 중량의 80wt% - 95wt%인 세포외기질 단백질과 마이크로 사이즈의 골미네랄 입자의 혼합체를 성형몰드에 주입하는 단계;
(b) 급속 동결 및 해동을 반복하여 단백질의 구조를 정렬화하는 단계;
(c) 단당류 용액을 가하여 가교하는 단계;
(d) 세포외기질 단백질-골미네랄 복합체에 재생기능성 펩타이드인 엘라스틴 부착 펩타이드 또는 히알루론산 부착 펩타이드를 결합시키는 단계; 및
(e) 동결건조 단계.
제1항에 있어서, 상기 세포외기질 단백질은 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 황산콘드로이틴 및 피브로인 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조직 구조 모사체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 골미네랄 성분은 골미네랄 성분은 동종골 또는 이종골에서 기인한 생물유래 골미네랄 분말 및 합성 수산화아파타이트 및 트리칼슘인산 마이크로분말 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조직 구조 모사체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드의 결합량은 조직 구조 모사체의 단위무게당(g) 1-1000mg인 것을 특징으로 하는 조직 구조 모사체의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 펩타이드는 5-30개의 아미노산으로 구성되고, 상기 펩타이드의 결합량은 조직 구조 모사체의 단위무게당(g) 100-500mg인 것을 특징으로 하는 조직 구조 모사체의 제조방법.
다음 단계를 포함하는 세포외기질 단백질-골미네랄 성분의 복합체로 이루어진 연조직 재생용 조직 구조 모사체의 제조방법:
(a) 골미네랄 성분의 함량이 전체 중량의 5wt% 35wt%인 세포외기질 단백질과 마이크로 사이즈의 골미네랄 입자의 혼합체를 성형몰드에 주입하는 단계;
(b) 급속 동결 및 해동을 반복하여 단백질의 구조를 정렬화하는 단계;
(c) 단당류 용액을 가하여 가교하는 단계;
(d) 세포외기질 단백질-골미네랄 복합체에 재생기능성 펩타이드인 엘라스틴 부착 펩타이드 또는 히알루론산 부착 펩타이드를 결합시키는단계; 및
(e) 동결건조 단계.
제6항에 있어서, 상기 세포외기질 단백질은 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 황산콘드로이틴 및 피브로인 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조직 구조 모사체의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 골미네랄 성분은 동종골 또는 이종골에서 기인한 생물유래 골미네랄 분말 및 합성 수산화아파타이트 및 트리칼슘인산 마이크로분말 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조직 구조 모사체의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 펩타이드의 결합량은 조직 구조 모사체의 단위무게당(g) 1-1000mg인 것을 특징으로 하는 조직 구조 모사체의 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 펩타이드는 5-30개의 아미노산으로 구성되고, 상기 펩타이드의 결합량은 조직 구조 모사체의 단위무게당(g) 100-500mg인 것을 특징으로 하는 조직 구조 모사체의 제조방법.
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