RU2683557C1 - Способ получения биодеградируемых скаффолдов из фиброина шелка с улучшенными биологическими свойствами - Google Patents
Способ получения биодеградируемых скаффолдов из фиброина шелка с улучшенными биологическими свойствами Download PDFInfo
- Publication number
- RU2683557C1 RU2683557C1 RU2017140585A RU2017140585A RU2683557C1 RU 2683557 C1 RU2683557 C1 RU 2683557C1 RU 2017140585 A RU2017140585 A RU 2017140585A RU 2017140585 A RU2017140585 A RU 2017140585A RU 2683557 C1 RU2683557 C1 RU 2683557C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- silk fibroin
- intercellular matrix
- aqueous solution
- biodegradable
- microparticles
- Prior art date
Links
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 title description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 12
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 4
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 2
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 210000003699 striated muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000003746 surface roughness Effects 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/28—Materials for coating prostheses
- A61L27/34—Macromolecular materials
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению биодеградируемых скаффолдов. Способ включает смешение водного раствора фиброина шелка с микрочастицами межклеточного матрикса размером менее 0,5 мм при соотношении компонентов водный раствор фиброин шелка 10-95 масс. % и частицы межклеточного матрикса 90-5 масс. %. Далее вносят диметилсульфоксид до конечной концентрации 0,5-2%. Из полученной смеси формируют изделия необходимой формы и выдерживают не менее 5 дней при температуре от -10 до -80°С. После чего производят размораживание изделий в 96% этиловом спирте в течение 0,5-10 ч со сменой этилового спирта не менее 3 раз. Изобретение позволяет получить биодеградируемые скаффолды с оптимизацией культуральных условий для прикрепления и пролиферации клеток при сохранении механической прочности и эластичности. 2 ил., 1 пр.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно, к регенеративной медицине и тканевой инженерии, конкретно, к способам получения биодеградируемых скаффолдов, используемых для восстановления поврежденных органов и тканей.
Одной из актуальных проблем современной трансплантологии является нехватка донорских органов для пересадки. Решением этой проблемы может стать создание искусственных органов и тканей, представляющих собой конструкции, содержащие матриксный и клеточный компоненты. Выбор материала, который будет использоваться как каркас будущего искусственного органа, является первостепенной задачей. Этот материал должен максимально точно имитировать свойства нативного межклеточного матрикса и выполнять его функции: определять физические свойства тканей, обеспечивать адгезию, пролиферацию, дифференцировку и миграцию клеток. В настоящее время в качестве таких материалов рассматривают как синтетические материалы, так и материалы природного происхождения.
Одним из универсальных материалов, используемых в качестве каркасного компонента, является фиброин шелка из коконов тутового шелкопряда Bombyx mori. Фиброин обладает свойствами, которые позволяют формировать из него различные изделия: покрытия, пленки, трубки, пористые матриксы, микро- и наночастицы, гели - а также широко использовать его в тканевой инженерии как самостоятельный материал, так и в составе композитов. К таким свойствам можно отнести его механические показатели, позволяющие осуществлять хирургические манипуляции, а так же возможность контроля скорости биодеградации за счет регулирования конформационного состояния белка [Сафонова Л.А. Боброва М.М., Агапова О.И., Котлярова М.С., Архипова А.Ю., Мойсенович М.М., Агапов И.И. Биологические свойства пленок из регенерированного фиброина шелка // Современные технологии в медицине. - 2015. - Том 7. - №3. - С. 6-13.]. Однако, изделия из чистого фиброина шелка обладают низкими адгезионными свойствами для клеток млекопитающих.
Известен способ получения биодеградируемых скаффолдов из фиброина шелка, включающий внесение в состав скаффолда, по меньшей мере, одного биодеградируемого полимера, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего [US 7842780] (прототип). Известный способ предполагает включение в рабочий раствор фиброина шелка биодеградируемого полимера.
Однако при использовании в регенеративной медицине биодеградируемые скаффолды, полученные по указанному выше способу, не позволяют воссоздать нативные условия - трехмерное микроокружение и комплекс молекулярно-биологических сигналов для клеток млекопитающих.
Техническая проблема заключается в создании биодеградируемых скаффолдов, обеспечивающих одновременно нативные условия существования для клеток млекопитающего и обладающих механическими свойствами, позволяющими формировать из него изделия различных размеров и формы.
Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в одновременном достижении комплекса характеристик у биодеградируемых скаффолдов, включая оптимизацию культуральных условий для прикрепления и пролиферации клеток при сохранении механической прочности и эластичности путем сочетанного введения в рабочий раствор (композицию) для получения скаффолдов водного раствора фиброина шелка и микрочастиц межклеточного матрикса при определенном соотношении компонентов.
Нами было установлено, что при соединении в рабочем растворе указанных компонентов они сохраняют свои свойства. Причем эти свойства сохраняются и в биодеградируемых скаффолдах, полученных из такого рабочего раствора.
Сущность изобретения состоит в следующем.
При изготовлении биодеградируемых скаффолдов суспензию микрочастиц межклеточного матрикса размером менее 0,5 мм, по меньшей мере, одной ткани млекопитающего, смешивают с водным раствором фиброина шелка при следующем соотношении компонентов, масс. %:
| водный раствор фиброин шелка | 10-95 |
| частицы межклеточного матрикса | 90-5. |
Затем вносят диметилсульфоксид до конечной концентрации 0,5-2%. Из полученной смеси формируют изделия необходимой формы и выдерживают не менее 5 дней при температуре от -10°С до -80°С. После чего производят размораживание изделий в 96% этиловом спирте в течение 0,5-10 часов со сменой этилового спирта не менее 3 раз.
Изобретения поясняются следующими фигурами
На фиг. 1 представлено изображение поры биодеградируемого скаффолда из фиброина шелка, на фиг. 2 изображение поры биодеградируемого скаффолда из фиброина шелка с внесенными в состав скаффолда микрочастицами децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани печени. Изображения получены методом сканирующей электронной микроскопии, увеличение ×200.
Способ получения биодеградируемых скаффолдов осуществляется следующим образом.
Суспензию частиц межклеточного матрикса размером менее 0,5 мм, по меньшей мере, одной ткани млекопитающего, смешивают, тщательно перемешивая, с водным раствором фиброина шелка при следующем соотношении компонентов, масс. %:
| водный раствор фиброин шелка | 10-95 |
| частицы межклеточного матрикса | 90-5. |
В качестве ткани млекопитающего суспензия может содержать одну из следующих тканей млекопитающего, например человека или крысы: ткань сердца, ткань легкого, ткань мозга, ткань печени, ткань почки, ткань поперечнополосатой мышцы, ткань кожи, что расширяет возможности способа при применении в регенеративной медицине.
Затем вносят диметилсульфоксид до конечной концентрации 0,5-2%. Из полученной смеси формируют изделия необходимой формы, например, в культуральном 48- или 96-луночном планшете, аккуратно внося смесь в лунки и не позволяя смеси отстояться, и выдерживают не менее 5 дней при температуре в диапазоне (-10°С)-(-80°С). После чего производят размораживание изделий, внося в форму с изделием 96% этиловый спирт, в течение 0,5-10 часов со сменой этилового спирта не менее 3 раз. Далее изделие извлекают из формы и хранят в 70% этаноловом спирте.
Для доказательства возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.
В качестве примера реализации получения биодеградируемых скаффолдов представлено изображение макропоры биодеградируемого скаффолда из фиброина шелка с внесенными в состав скаффолда микрочастицами децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани печени (в соответствии с предлагаемым способом) (фиг. 2), полученное методом сканирующей электронной микроскопии.
Ткань печени человека была децеллюляризована раствором натрий-фосфатного буфера рН 7,4, содержащим в качестве детергентов тритон X-100 с концентрацией 3% и додецилсульфат натрия с концентрацией 0,1%; и раствором трипсина с концентрацией 0,025% в течение 10 дней. Предварительно ткань печени была измельчена ножницами до размера 0,5-3 мм. Децеллюляризованный межклеточный матрикс ткани печени человека был отмыт раствором натрий-фосфатного буфера рН 7,4 в течение 24 часов. После чего была произведена заморозка децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани печени человека в жидком азоте, а затем было произведено измельчение децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани до размера частиц меньше 0,5 мм при помощи ступки и пестика. Далее было произведено выделение фракции микрочастиц децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани печени человека размером 1 мкм и меньше путем центрифугирования по 10 минут при 1350 g два раза, отбора супернатанта и повторного центрифугирования по 10 минут при 12100 g 8 раз. Затем был изготовлен биодеградируемый скаффолд методом замораживания-оттаивания из смеси раствора фиброина шелка и суспензии микрочастиц децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани, доля которых по массе составляет 30% от общей массы смеси. Для этого к композиции, включающей раствор фиброина шелка и суспензию микрочастиц децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани, вносят диметилсульфоксид до конечной концентрации 1%; из полученной смеси формируют изделия в 96-луночном культуральном планшете и выдерживают 7 дней при температуре от -20°С, после чего производят размораживание изделий в 96% этиловом спирте в течение 2 часов с четырехкратной сменой этилового спирта. Для сравнения на фиг. 1 приведено изображение макропоры биодеградируемого скаффолда из фиброина шелка. При сравнении микрофотографий модифицированного и немодифицированного биодеградируемого скаффолда из фиброина шелка можно увидеть, что предлагаемый способ обработки приводит к изменению поверхности макропор биодеградируемого скаффолда из фиброина шелка, что обеспечивает нативное микроокружение для клеток млекопитающих как за счет биохимического состава микрочастиц, так и за счет увеличения шероховатости поверхности макропор.
Был проведен сравнительный анализ адгезии клеток культуры гепатокарциномы человека Hep G2 на модифицированном (предлагаемом нами) и немодифицированном биодеградируемом скаффолде из фиброина шелка. Было выявлено, что уровень адгезии клеток на модифицированном скаффолде на 30% выше, чем на немодифицированном скаффолде из фиброина шелка. Механические свойства скаффолда, полученного предлагаемым способом, аналогичны таковым у скаффолда-прототипа.
Claims (3)
- Способ получения биодеградируемых скаффолдов, отличающийся тем, что суспензию микрочастиц межклеточного матрикса размером менее 0,5 мм по меньшей мере одной ткани млекопитающего смешивают с водным раствором фиброина шелка при следующем соотношении компонентов, масс. %:
-
водный раствор фиброин шелка 10-95 микрочастицы межклеточного матрикса размером менее 0,5 мм 90-5, - затем вносят диметилсульфоксид до конечной концентрации 0,5-2%; из полученной смеси формируют изделия необходимой формы и выдерживают не менее 5 дней при температуре от -10 до -80°C, после чего производят размораживание изделий в 96% этиловом спирте в течение 0,5-10 ч со сменой этилового спирта не менее 3 раз.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017140585A RU2683557C1 (ru) | 2017-11-22 | 2017-11-22 | Способ получения биодеградируемых скаффолдов из фиброина шелка с улучшенными биологическими свойствами |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017140585A RU2683557C1 (ru) | 2017-11-22 | 2017-11-22 | Способ получения биодеградируемых скаффолдов из фиброина шелка с улучшенными биологическими свойствами |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2683557C1 true RU2683557C1 (ru) | 2019-03-28 |
Family
ID=66090024
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017140585A RU2683557C1 (ru) | 2017-11-22 | 2017-11-22 | Способ получения биодеградируемых скаффолдов из фиброина шелка с улучшенными биологическими свойствами |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2683557C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013071107A1 (en) * | 2011-11-09 | 2013-05-16 | Trustees Of Tufts College | Injectable silk fibroin particles and uses thereof |
| KR101628677B1 (ko) * | 2013-04-02 | 2016-06-09 | 주식회사 나이벡 | 세포외기질 단백질-골미네랄 복합체를 함유하는 조직 구조 모사체 및 그 제조방법 |
-
2017
- 2017-11-22 RU RU2017140585A patent/RU2683557C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013071107A1 (en) * | 2011-11-09 | 2013-05-16 | Trustees Of Tufts College | Injectable silk fibroin particles and uses thereof |
| KR101628677B1 (ko) * | 2013-04-02 | 2016-06-09 | 주식회사 나이벡 | 세포외기질 단백질-골미네랄 복합체를 함유하는 조직 구조 모사체 및 그 제조방법 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| АРХИПОВА А.Ю. "Биорезорбируемые скаффолды на основе фиброина шелка для тканевой инженерии и регенеративной медицины", Дисс. канд. биол. наук, Москва. 2016; 161 с. * |
| САДОВОЙ М.А. и др. "Клеточные матрицы (скаффолды) для целей регенерации кости: современное состояние проблемы", Хирургия позвоночника. 2014; 2:79-86. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6506326B2 (ja) | 細胞移植用細胞構造体、生体親和性高分子ブロック及びそれらの製造方法 | |
| Moisenovich et al. | Tissue regeneration in vivo within recombinant spidroin 1 scaffolds | |
| Wu et al. | Three-dimensional bioprinting of artificial ovaries by an extrusion-based method using gelatin-methacryloyl bioink | |
| US20220280694A1 (en) | Detergent-free decellularized extracellular matrix preparation methods and bioinks for 3d printing | |
| WO2019100454A1 (zh) | 一种三维肿瘤模型脱细胞多孔支架、构建方法及其应用 | |
| Herrero-Herrero et al. | Influence of chemistry and fiber diameter of electrospun PLA, PCL and their blend membranes, intended as cell supports, on their biological behavior | |
| CN106492281B (zh) | 一种生物相容性骨移植物及其制备方法 | |
| RU2483756C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОДЕГРАДИРУЕМОГО КОМПОЗИТНОГО МАТРИКСА НА ОСНОВЕ РЕГЕНЕРИРОВАННОГО ФИБРОИНА ШЕЛКА Bombyx mori И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | |
| Narayan et al. | Ectopic vascularized bone formation by human mesenchymal stem cell microtissues in a biocomposite scaffold | |
| Agapov et al. | Three-dimensional scaffold made from recombinant spider silk protein for tissue engineering | |
| EP3573672A1 (en) | Templated assembly of collagen fibers and uses thereof | |
| US10525162B2 (en) | Sophorolipid mediated accelerated gelation of silk fibroin | |
| US10940237B2 (en) | Tissue structure scaffolds | |
| Wibowo et al. | Development of salt leached silk fibroin scaffold using direct dissolution techniques for cartilage tissue engineering | |
| Liu et al. | Synergy of inorganic and organic inks in bioprinted tissue substitutes: construct stability and cell response during long-term cultivation in vitro | |
| Arkhipova et al. | New silk fibroin-based bioresorbable microcarriers | |
| RU2683557C1 (ru) | Способ получения биодеградируемых скаффолдов из фиброина шелка с улучшенными биологическими свойствами | |
| KR20130091824A (ko) | 조직공학용 다공성 히알루론산-겔라틴 하이드로겔 지지체의 제조방법 및 이에 의해 제조된 그 지지체 | |
| RU2684769C1 (ru) | Композиция для изготовления биодеградируемых скаффолдов и способ ее получения | |
| Bessonov et al. | Photocurable hydrogels containing spidroin or fibroin | |
| Li et al. | 3D printed hydroxyapatite/silk fibroin/polycaprolactone artificial bone scaffold and bone tissue engineering materials constructed with double-transfected bone morphogenetic protein-2 and vascular endothelial growth factor mesenchymal stem cells to repair rabbit radial bone defects | |
| Bogush et al. | Characterization of biodegradable cell micro and macro carriers based on recombinant spidroin | |
| KR20210103984A (ko) | 심장 오가노이드 배양 및 이식을 위한 탈세포 심장 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법 | |
| Popryadukhin et al. | Bioresorption of porous 3D matrices based on collagen in liver and muscular tissue | |
| Denkbas et al. | EGF loaded chitosan sponges as wound dressing material |