RU2683557C1 - Способ получения биодеградируемых скаффолдов из фиброина шелка с улучшенными биологическими свойствами - Google Patents

Способ получения биодеградируемых скаффолдов из фиброина шелка с улучшенными биологическими свойствами Download PDF

Info

Publication number
RU2683557C1
RU2683557C1 RU2017140585A RU2017140585A RU2683557C1 RU 2683557 C1 RU2683557 C1 RU 2683557C1 RU 2017140585 A RU2017140585 A RU 2017140585A RU 2017140585 A RU2017140585 A RU 2017140585A RU 2683557 C1 RU2683557 C1 RU 2683557C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
silk fibroin
intercellular matrix
aqueous solution
biodegradable
microparticles
Prior art date
Application number
RU2017140585A
Other languages
English (en)
Inventor
Игорь Иванович Агапов
Ольга Игоревна Агапова
Антон Евгеньевич Ефимов
Мария Михайловна Боброва
Любовь Александровна Сафонова
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России)
Priority to RU2017140585A priority Critical patent/RU2683557C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2683557C1 publication Critical patent/RU2683557C1/ru

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28Materials for coating prostheses
    • A61L27/34Macromolecular materials

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению биодеградируемых скаффолдов. Способ включает смешение водного раствора фиброина шелка с микрочастицами межклеточного матрикса размером менее 0,5 мм при соотношении компонентов водный раствор фиброин шелка 10-95 масс. % и частицы межклеточного матрикса 90-5 масс. %. Далее вносят диметилсульфоксид до конечной концентрации 0,5-2%. Из полученной смеси формируют изделия необходимой формы и выдерживают не менее 5 дней при температуре от -10 до -80°С. После чего производят размораживание изделий в 96% этиловом спирте в течение 0,5-10 ч со сменой этилового спирта не менее 3 раз. Изобретение позволяет получить биодеградируемые скаффолды с оптимизацией культуральных условий для прикрепления и пролиферации клеток при сохранении механической прочности и эластичности. 2 ил., 1 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно, к регенеративной медицине и тканевой инженерии, конкретно, к способам получения биодеградируемых скаффолдов, используемых для восстановления поврежденных органов и тканей.
Одной из актуальных проблем современной трансплантологии является нехватка донорских органов для пересадки. Решением этой проблемы может стать создание искусственных органов и тканей, представляющих собой конструкции, содержащие матриксный и клеточный компоненты. Выбор материала, который будет использоваться как каркас будущего искусственного органа, является первостепенной задачей. Этот материал должен максимально точно имитировать свойства нативного межклеточного матрикса и выполнять его функции: определять физические свойства тканей, обеспечивать адгезию, пролиферацию, дифференцировку и миграцию клеток. В настоящее время в качестве таких материалов рассматривают как синтетические материалы, так и материалы природного происхождения.
Одним из универсальных материалов, используемых в качестве каркасного компонента, является фиброин шелка из коконов тутового шелкопряда Bombyx mori. Фиброин обладает свойствами, которые позволяют формировать из него различные изделия: покрытия, пленки, трубки, пористые матриксы, микро- и наночастицы, гели - а также широко использовать его в тканевой инженерии как самостоятельный материал, так и в составе композитов. К таким свойствам можно отнести его механические показатели, позволяющие осуществлять хирургические манипуляции, а так же возможность контроля скорости биодеградации за счет регулирования конформационного состояния белка [Сафонова Л.А. Боброва М.М., Агапова О.И., Котлярова М.С., Архипова А.Ю., Мойсенович М.М., Агапов И.И. Биологические свойства пленок из регенерированного фиброина шелка // Современные технологии в медицине. - 2015. - Том 7. - №3. - С. 6-13.]. Однако, изделия из чистого фиброина шелка обладают низкими адгезионными свойствами для клеток млекопитающих.
Известен способ получения биодеградируемых скаффолдов из фиброина шелка, включающий внесение в состав скаффолда, по меньшей мере, одного биодеградируемого полимера, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего [US 7842780] (прототип). Известный способ предполагает включение в рабочий раствор фиброина шелка биодеградируемого полимера.
Однако при использовании в регенеративной медицине биодеградируемые скаффолды, полученные по указанному выше способу, не позволяют воссоздать нативные условия - трехмерное микроокружение и комплекс молекулярно-биологических сигналов для клеток млекопитающих.
Техническая проблема заключается в создании биодеградируемых скаффолдов, обеспечивающих одновременно нативные условия существования для клеток млекопитающего и обладающих механическими свойствами, позволяющими формировать из него изделия различных размеров и формы.
Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в одновременном достижении комплекса характеристик у биодеградируемых скаффолдов, включая оптимизацию культуральных условий для прикрепления и пролиферации клеток при сохранении механической прочности и эластичности путем сочетанного введения в рабочий раствор (композицию) для получения скаффолдов водного раствора фиброина шелка и микрочастиц межклеточного матрикса при определенном соотношении компонентов.
Нами было установлено, что при соединении в рабочем растворе указанных компонентов они сохраняют свои свойства. Причем эти свойства сохраняются и в биодеградируемых скаффолдах, полученных из такого рабочего раствора.
Сущность изобретения состоит в следующем.
При изготовлении биодеградируемых скаффолдов суспензию микрочастиц межклеточного матрикса размером менее 0,5 мм, по меньшей мере, одной ткани млекопитающего, смешивают с водным раствором фиброина шелка при следующем соотношении компонентов, масс. %:
водный раствор фиброин шелка 10-95
частицы межклеточного матрикса 90-5.
Затем вносят диметилсульфоксид до конечной концентрации 0,5-2%. Из полученной смеси формируют изделия необходимой формы и выдерживают не менее 5 дней при температуре от -10°С до -80°С. После чего производят размораживание изделий в 96% этиловом спирте в течение 0,5-10 часов со сменой этилового спирта не менее 3 раз.
Изобретения поясняются следующими фигурами
На фиг. 1 представлено изображение поры биодеградируемого скаффолда из фиброина шелка, на фиг. 2 изображение поры биодеградируемого скаффолда из фиброина шелка с внесенными в состав скаффолда микрочастицами децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани печени. Изображения получены методом сканирующей электронной микроскопии, увеличение ×200.
Способ получения биодеградируемых скаффолдов осуществляется следующим образом.
Суспензию частиц межклеточного матрикса размером менее 0,5 мм, по меньшей мере, одной ткани млекопитающего, смешивают, тщательно перемешивая, с водным раствором фиброина шелка при следующем соотношении компонентов, масс. %:
водный раствор фиброин шелка 10-95
частицы межклеточного матрикса 90-5.
В качестве ткани млекопитающего суспензия может содержать одну из следующих тканей млекопитающего, например человека или крысы: ткань сердца, ткань легкого, ткань мозга, ткань печени, ткань почки, ткань поперечнополосатой мышцы, ткань кожи, что расширяет возможности способа при применении в регенеративной медицине.
Затем вносят диметилсульфоксид до конечной концентрации 0,5-2%. Из полученной смеси формируют изделия необходимой формы, например, в культуральном 48- или 96-луночном планшете, аккуратно внося смесь в лунки и не позволяя смеси отстояться, и выдерживают не менее 5 дней при температуре в диапазоне (-10°С)-(-80°С). После чего производят размораживание изделий, внося в форму с изделием 96% этиловый спирт, в течение 0,5-10 часов со сменой этилового спирта не менее 3 раз. Далее изделие извлекают из формы и хранят в 70% этаноловом спирте.
Для доказательства возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.
В качестве примера реализации получения биодеградируемых скаффолдов представлено изображение макропоры биодеградируемого скаффолда из фиброина шелка с внесенными в состав скаффолда микрочастицами децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани печени (в соответствии с предлагаемым способом) (фиг. 2), полученное методом сканирующей электронной микроскопии.
Ткань печени человека была децеллюляризована раствором натрий-фосфатного буфера рН 7,4, содержащим в качестве детергентов тритон X-100 с концентрацией 3% и додецилсульфат натрия с концентрацией 0,1%; и раствором трипсина с концентрацией 0,025% в течение 10 дней. Предварительно ткань печени была измельчена ножницами до размера 0,5-3 мм. Децеллюляризованный межклеточный матрикс ткани печени человека был отмыт раствором натрий-фосфатного буфера рН 7,4 в течение 24 часов. После чего была произведена заморозка децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани печени человека в жидком азоте, а затем было произведено измельчение децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани до размера частиц меньше 0,5 мм при помощи ступки и пестика. Далее было произведено выделение фракции микрочастиц децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани печени человека размером 1 мкм и меньше путем центрифугирования по 10 минут при 1350 g два раза, отбора супернатанта и повторного центрифугирования по 10 минут при 12100 g 8 раз. Затем был изготовлен биодеградируемый скаффолд методом замораживания-оттаивания из смеси раствора фиброина шелка и суспензии микрочастиц децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани, доля которых по массе составляет 30% от общей массы смеси. Для этого к композиции, включающей раствор фиброина шелка и суспензию микрочастиц децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани, вносят диметилсульфоксид до конечной концентрации 1%; из полученной смеси формируют изделия в 96-луночном культуральном планшете и выдерживают 7 дней при температуре от -20°С, после чего производят размораживание изделий в 96% этиловом спирте в течение 2 часов с четырехкратной сменой этилового спирта. Для сравнения на фиг. 1 приведено изображение макропоры биодеградируемого скаффолда из фиброина шелка. При сравнении микрофотографий модифицированного и немодифицированного биодеградируемого скаффолда из фиброина шелка можно увидеть, что предлагаемый способ обработки приводит к изменению поверхности макропор биодеградируемого скаффолда из фиброина шелка, что обеспечивает нативное микроокружение для клеток млекопитающих как за счет биохимического состава микрочастиц, так и за счет увеличения шероховатости поверхности макропор.
Был проведен сравнительный анализ адгезии клеток культуры гепатокарциномы человека Hep G2 на модифицированном (предлагаемом нами) и немодифицированном биодеградируемом скаффолде из фиброина шелка. Было выявлено, что уровень адгезии клеток на модифицированном скаффолде на 30% выше, чем на немодифицированном скаффолде из фиброина шелка. Механические свойства скаффолда, полученного предлагаемым способом, аналогичны таковым у скаффолда-прототипа.

Claims (3)

  1. Способ получения биодеградируемых скаффолдов, отличающийся тем, что суспензию микрочастиц межклеточного матрикса размером менее 0,5 мм по меньшей мере одной ткани млекопитающего смешивают с водным раствором фиброина шелка при следующем соотношении компонентов, масс. %:
  2. водный раствор фиброин шелка 10-95 микрочастицы межклеточного матрикса размером менее 0,5 мм 90-5,
  3. затем вносят диметилсульфоксид до конечной концентрации 0,5-2%; из полученной смеси формируют изделия необходимой формы и выдерживают не менее 5 дней при температуре от -10 до -80°C, после чего производят размораживание изделий в 96% этиловом спирте в течение 0,5-10 ч со сменой этилового спирта не менее 3 раз.
RU2017140585A 2017-11-22 2017-11-22 Способ получения биодеградируемых скаффолдов из фиброина шелка с улучшенными биологическими свойствами RU2683557C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017140585A RU2683557C1 (ru) 2017-11-22 2017-11-22 Способ получения биодеградируемых скаффолдов из фиброина шелка с улучшенными биологическими свойствами

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017140585A RU2683557C1 (ru) 2017-11-22 2017-11-22 Способ получения биодеградируемых скаффолдов из фиброина шелка с улучшенными биологическими свойствами

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2683557C1 true RU2683557C1 (ru) 2019-03-28

Family

ID=66090024

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2017140585A RU2683557C1 (ru) 2017-11-22 2017-11-22 Способ получения биодеградируемых скаффолдов из фиброина шелка с улучшенными биологическими свойствами

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2683557C1 (ru)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013071107A1 (en) * 2011-11-09 2013-05-16 Trustees Of Tufts College Injectable silk fibroin particles and uses thereof
KR101628677B1 (ko) * 2013-04-02 2016-06-09 주식회사 나이벡 세포외기질 단백질-골미네랄 복합체를 함유하는 조직 구조 모사체 및 그 제조방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013071107A1 (en) * 2011-11-09 2013-05-16 Trustees Of Tufts College Injectable silk fibroin particles and uses thereof
KR101628677B1 (ko) * 2013-04-02 2016-06-09 주식회사 나이벡 세포외기질 단백질-골미네랄 복합체를 함유하는 조직 구조 모사체 및 그 제조방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
АРХИПОВА А.Ю. "Биорезорбируемые скаффолды на основе фиброина шелка для тканевой инженерии и регенеративной медицины", Дисс. канд. биол. наук, Москва. 2016; 161 с. *
САДОВОЙ М.А. и др. "Клеточные матрицы (скаффолды) для целей регенерации кости: современное состояние проблемы", Хирургия позвоночника. 2014; 2:79-86. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6506326B2 (ja) 細胞移植用細胞構造体、生体親和性高分子ブロック及びそれらの製造方法
Moisenovich et al. Tissue regeneration in vivo within recombinant spidroin 1 scaffolds
Wu et al. Three-dimensional bioprinting of artificial ovaries by an extrusion-based method using gelatin-methacryloyl bioink
US20220280694A1 (en) Detergent-free decellularized extracellular matrix preparation methods and bioinks for 3d printing
WO2019100454A1 (zh) 一种三维肿瘤模型脱细胞多孔支架、构建方法及其应用
Herrero-Herrero et al. Influence of chemistry and fiber diameter of electrospun PLA, PCL and their blend membranes, intended as cell supports, on their biological behavior
EP3573672B1 (en) Templated assembly of collagen fibers and uses thereof
CN106492281B (zh) 一种生物相容性骨移植物及其制备方法
RU2483756C1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОДЕГРАДИРУЕМОГО КОМПОЗИТНОГО МАТРИКСА НА ОСНОВЕ РЕГЕНЕРИРОВАННОГО ФИБРОИНА ШЕЛКА Bombyx mori И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
Agapov et al. Three-dimensional scaffold made from recombinant spider silk protein for tissue engineering
Narayan et al. Ectopic vascularized bone formation by human mesenchymal stem cell microtissues in a biocomposite scaffold
US10525162B2 (en) Sophorolipid mediated accelerated gelation of silk fibroin
Wang et al. Polylactic acid scaffold with directional porous structure for large-segment bone repair
Wibowo et al. Development of salt leached silk fibroin scaffold using direct dissolution techniques for cartilage tissue engineering
US20190134264A1 (en) Tissue structure scaffolds
Liu et al. Synergy of inorganic and organic inks in bioprinted tissue substitutes: construct stability and cell response during long-term cultivation in vitro
Arkhipova et al. New silk fibroin-based bioresorbable microcarriers
RU2683557C1 (ru) Способ получения биодеградируемых скаффолдов из фиброина шелка с улучшенными биологическими свойствами
RU2684769C1 (ru) Композиция для изготовления биодеградируемых скаффолдов и способ ее получения
Bessonov et al. Photocurable hydrogels containing spidroin or fibroin
Popryadukhin et al. Bioresorption of porous 3D matrices based on collagen in liver and muscular tissue
Li et al. 3D printed hydroxyapatite/silk fibroin/polycaprolactone artificial bone scaffold and bone tissue engineering materials constructed with double-transfected bone morphogenetic protein-2 and vascular endothelial growth factor mesenchymal stem cells to repair rabbit radial bone defects
Bogush et al. Characterization of biodegradable cell micro and macro carriers based on recombinant spidroin
KR20220102581A (ko) 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법
KR20210103984A (ko) 심장 오가노이드 배양 및 이식을 위한 탈세포 심장 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법