KR20210103984A - 심장 오가노이드 배양 및 이식을 위한 탈세포 심장 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법 - Google Patents

심장 오가노이드 배양 및 이식을 위한 탈세포 심장 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 탈세포 심장 조직(Heart Extracellular Matrix; HEM)을 이용한 심장 오가노이드 배양 및 이식용 지지체에 관한 것이다.

Description

심장 오가노이드 배양 및 이식을 위한 탈세포 심장 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법{HEART EXTRACELLULAR MATRIX-DERIVED SCAFFOLD FOR CULTURE AND TRANSPLANTATION OF CARDIAC ORGANOID AND PREPARING METHOD THEREOF}
본 발명은 심장 오가노이드 배양 및 이식을 위한 탈세포 심장 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
오가노이드는 3차원 세포 구조체로서 조직을 구성하고 있는 다양한 세포로 구성되어 있어 생체 조직의 환경을 모사할 수 있다는 점에서 최근에 주목받고 있다. 때문에 기초 생물학 연구 분야에서부터 신약 개발, 질병 모델링, 재생 치료 등 다양한 응용 연구 분야에 이르기까지 폭넓게 활용되고 있다.
신약 개발을 위한 질병 모델의 경우 현재 대부분 동물 모델이 많이 이용되고 있는데, 동물은 유전학적, 생리적인 측면에서 인간과 상이하기 때문에 실제 사람의 질병을 동물에서 구현하기에는 한계가 있고 동물실험에 대한 윤리적인 문제도 꾸준히 대두되는 실정이다. 환자 유래의 세포로 제작된 오가노이드 모델을 이용하면, 질병에 대한 기전 연구와 환자 맞춤형 진단 및 치료까지 가능하다는 점에서 많은 각광받고 있다.
현재 생체 내 여러 장기의 줄기세포에서 유래하는 다양한 종류의 오가노이드 모델이 구축되어 있다. 이러한 다양한 종류의 오가노이드를 배양할 때 전세계적으로 많은 연구자들이 대부분 매트리젤을 배양 지지체로서 이용하고 있다. 하지만 매트리젤은 쥐 육종암으로부터 유래한 성분으로, 감염 및 면역 거부 반응의 위험성으로 인해 매트리젤에서 배양된 오가노이드를 사람에게 이식하는 시도에 우려가 제기되고 있다. 또한, 매트리젤은 실제 조직에 포함된 세포외기질 성분이 아니기 때문에 세포의 성장 및 분화에 필수적인 조직 특이적 세포외기질 미세환경을 구현할 수 없다. 따라서 이러한 매트리젤의 문제점을 해결할 수 있는 생체적합하고 조직 특이적인 오가노이드 배양 지지체의 개발이 절실히 요구되고 있다.
본 발명은 탈세포 과정을 통해 심장 조직으로부터 세포외기질 성분만 존재하는 매트릭스를 제작하고 이를 심장 오가노이드 배양에 이용하는 새로운 배양 플랫폼을 제시하고 있다. 이렇게 탈세포화된 심장 조직 유래 지지체는 심장 조직에 존재하는 다양한 세포외기질 성분과 성장인자를 포함하고 있어 심장 조직 특이적 미세환경을 제공해 줌으로써 심장 오가노이드의 형성, 생장 및 분화를 촉진시킬 수 있을 것으로 기대된다. 이렇게 제작된 성숙한 심장 오가노이드는 심장 질환 모델링 및 약물 독성 평가 플랫폼으로 활용될 수 있을 뿐 아니라 재생의학 분야에도 적용될 수 있을 것으로 기대한다.
대한민국 공개특허공보 제10-2017-0143465호
본 발명은 돼지 심장 조직에 일련의 화학적 처리를 통해 다량의 탈세포 심장 조직 유래 지지체를 제작하였고 이를 심장 오가노이드 배양에 적용하기 위한 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.
본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.
본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양상은 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 (Heart Extracellular Matrix, HEM)을 포함한 지지체 조성물을 제공한다.
상기 “세포외기질(extracellular matrix)”은 포유류 및 다세포 생물(multicellular organisms)에서 발견된 조직의 탈세포화를 통해 제조된 세포 성장용 자연 지지체를 의미한다. 상기 세포외기질은 투석 또는 가교화를 통해 더 처리할 수 있다.
상기 세포외기질은 콜라겐, 엘라스틴(elastins), 라미닌(laminins), 글리코스아미노글리칸 (glycosaminoglycans), 프로테오글리칸, 항균제(antimicrobials), 화학유인물질(chemoattractants), 시토카인 (cytokines), 및 성장 인자에 제한되지 않는, 구조형 및 비구조형 생체 분자(biomolecules)의 혼합물일 수 있다.
상기 세포외기질은 포유 동물에 있어서 다양한 형태로서 약 90%의 콜라겐을 포함할 수 있다. 다양한 생체 조직에서 유래한 세포외기질은 각각의 조직에 필요한 고유 역할 때문에 전체 구조체 및 조성이 상이할 수 있다.
상기 “유래(derive)", "유래된(derived)"은 유용한 방법에 의해 언급한 원천으로부터 수득한 성분을 의미한다.
또한, 본 발명의 일 구체예로, 상기 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질은 0.01 내지 10 mg/mL, 구체적으로 0.5 내지 9 mg/mL 더욱 구제척으로 1 mg/mL 내지 8 mg/mL, 가장 구체적으로는 2, 4 또는 6 mg/mL, 최적화된 구체예로는 2 mg/mL로 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위 외의 농도로 포함될 경우, 본 발명이 목적하는 효과를 얻을 수 없거나, 제조 또는 활용에 있어서 부적합할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 조성물은 0.1 내지 10Hz 기준 탄성계수가 1 내지 150 Pa일 수 있고, 상기 조성물이 상기 범위의 탄성계수를 가짐으로써 안정적인 고분자 네트워크를 형성할 수 있다.
상기 지지체 조성물은 탈세포화하여 수득한 심장 조직 매트릭스 조성물을 기반으로 제조한 3차원 배양 하이드로젤을 포함하며, 심장 오가노이드 또는 심장 단일세포 배양에 효과적으로 활용될 수 있다.
상기 탈세포화된 심장 조직은 실제 조직 특이적 세포외기질 성분을 포함하므로 해당 조직의 물리적, 기계적, 생화학적 환경을 제공할 수 있으며, 심장 조직 세포로의 분화 및 조직 특이적 기능성을 증진시키는데 매우 효율적이다.
상기 "오가노이드(organoid)"는 조직 또는 전분화능줄기세포에서 유래된 세포를 3D 형태로 배양하여 인공장기와 같은 형태로 제작한 초소형 생체기관을 의미한다.
상기 오가노이드는 줄기세포에서 발생하고 생체 내 상태와 유사한 방식으로 자가-조직화(또는 자가-패턴화)하는 장기 특이적 세포를 포함한 삼차원 조직 유사체로서 제한된 요소(Ex. growth factor) 패터닝에 의해 특정 조직으로 발달할 수 있다.
상기 오가노이드는 세포의 본래 생리학적 특성을 가지며, 세포 혼합물(한정된 세포 유형뿐만 아니라 잔존 줄기 세포, 근접 생리학적 니치(physiological niche)를 모두 포함) 원래의 상태를 모방하는 해부학적 구조를 가질 수 있다. 상기 오가노이드는 3차원 배양 방법을 통해 세포와 세포의 기능이 더욱 잘 배열되고, 기능성을 가지는 기관 같은 형태와 조직 특이적 기능을 가질 수 있다.
상기 조성물은 심장 오가노이드 또는 단일 심근세포를 캡슐화 하기 위한 것일 수 있다. 구체적으로, 단일 심근세포 자체를 캡슐화 하고, 이를 배양하여 심장 오가노이드를 제작하거나, 배양된 심장 오가노이드를 캡슐화 할 수 있다. 여기에 단일 심근세포를 캡슐화 할 때는 체내 미세환경을 반영하기 위해 다른 세포를 더 포함할 수 있으며, 구체적으로는 혈관세포와 심장 섬유아세포를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물로 심장 오가노이드 또는 단일 심근세포를 캡슐화하여, 심근 분화를 증진시킬 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 (a) 분리된 심장 조직을 탈세포화하여 탈세포된 심장 조직을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 탈세포된 심장 조직을 건조하여 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 (Heart Extracellular Matrix, HEM)을 제조하는 단계; 를 포함하는 지지체 조성물 제조방법을 제공한다.
상기 (a) 단계는 분리된 심장 조직을 탈세포화하여 탈세포된 심장 조직을 제조하는 단계이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 (a) 단계는 상기 분리된 심장 조직을 1 내지 10 ℃에서 12 내지 36 시간 0.1 내지 2 % SDS (sodium dodecyl sulfate), 구체적으로 2 내지 9 ℃에서 15 내지 30 시간 0.5 내지 1.5 % SDS (sodium dodecyl sulfate), 더욱 구체적으로 24 시간 동안 4 ℃에서 1 % sodium dodecyl sulfate (SDS) 처리하고 탈세포화 용액에서 교반시켜 탈세포화 하는 것일 수 있다. 탈세포화 용액에서 교반하기 전 이러한 처리를 추가함으로써 전체적인 탈세포 효율을 높일 수 있다.
상기 탈세포화 용액은 심장 조직에서 세포를 제거하기 위한 다양한 성분을 포함할 수 있고, 예컨대, 고장성 식염수(hypertonic saline), 과산화 아세트산(peracetic acid), 트리톤 X-100 (Triton X-100), SDS 또는 기타 세제 성분을 포함할 수 있으나, 본 발명의 일 구체예에서 상기 탈세포화 용액은 0.1 내지 5 %의 Triton X-100 및 0.01 내지 0.5 % 수산화 암모늄, 더욱 구체적으로는 1 % Triton X-100 및 0.1 % 수산화 암모늄(ammonium hydroxide)을 포함하는 것일 수 있다. 상기와 같은 탈세포화 용액을 사용함으로써, 기존의 공정에 비하여 완화된 조건에서 탈세포를 진행함으로써 제조된 지지체 내 DNA를 효과적으로 제거함과 동시에 심장 조직 내의 다양한 단백질들이 더 많이 보존될 수 있다.
상기 교반은 3 내지 24 시간, 더욱 구체적으로 4 내지 12 시간, 가장 구체적으로는 5 내지 8 시간, 일 예시로 6 시간 동안 이루어지는 것일 수 있고, 상기 교반은 1 내지 10 ℃, 구체적으로 2 내지 9 ℃, 가장 구체적으로는 4 ℃에서 이루어질 수 있다. 이러한 교반 (탈세포) 과정을 통해 심장 조직 세포가 95 내지 99.9 %, 더욱 구체적으로 96 내지 98 %가 제거된 것일 수 있다. 상기 범위 외의 시간 또는 심장 조직 세포 제거 수준으로 탈세포가 이루어질 경우 제조된 지지체 조성물의 품질이 저하되거나 공정 경제성이 떨어지는 문제점이 있다.
상기 (b) 단계는 상기 탈세포된 심장 조직을 건조하여 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 (Heart Extracellular Matrix, HEM)을 제조하는 단계이다.
상기 탈세포된 심장 조직을 건조하는 방법은 공지의 방법으로 수행될 수 있으며, 자연건조 또는 동결 건조될 수 있고, 멸균을 위해 건조 후 전자 빔 또는 감마 방사선에 의해 에틸렌 옥사이드 가스 또는 초임계 이산화탄소에 노출시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 (b) 단계 이후, 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질은 0.01 내지 10 mg/mL, 구체적으로 0.5 내지 9 mg/mL 더욱 구제척으로 1 mg/mL 내지 8 mg/mL, 가장 구체적으로는 2, 4 또는 6 mg/mL, 최적화된 구체예로는 2 mg/mL로 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위 외의 농도로 포함될 경우, 본 발명이 목적하는 효과를 얻을 수 없거나, 제조 또는 활용에 있어서 부적합할 수 있다.
상기 건조된 세포외기질은 박리(tearing), 제분(milling), 절단, 분쇄 및 전단 단계를 포함하는 방법에 의해 세분될 수 있다. 상기 세분된 세포외기질은 냉동 상태 또는 냉동 건조 상태에서, 분쇄 또는 제분과 같은 방법에 의해 분말 형상으로 가공될 수 있다.
또한, 상기 지지체 조성물 제조방법은 추가적으로 (c) 상기 건조된 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질을 겔화(gelation)하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 (c) 단계는 상기 건조된 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질을 겔화(gelation)하는 단계이다.
상기 겔화를 통해 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질을 가교시켜 3차원 하이드로젤 형태의 지지체를 제작할 수 있고, 겔화된 지지체는 실험, 스크리닝 뿐만 아니라 오가노이드 배양과 관련된 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
상기 “하이드로젤”은 졸-겔 상변이를 통해 물을 분산매로 하는 액체가 굳어 유동성을 상실하고 다공성 구조를 이루는 물질로서, 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창함으로써 형성될 수 있다.
상기 겔화는 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질을 산성 용액에서 펩신 또는 트립신과 같은 단백질 분해 효소로 용액화하고, 10X PBS와 1 M NaOH를 이용하여 중성 pH와 1X PBS 버퍼의 전해질 상태로 맞추고 37℃의 온도에서 30분 동안 이루어지는 것일 수 있다.
상기 겔화를 통해 심장 오가노이드 또는 단일 심근세포를 캡슐화할 수 있다. 구체적으로, 상기 겔화를 통해 단일 심근세포 자체를 캡슐화 하고, 이를 배양하여 심장 오가노이드를 제작하거나, 배양된 심장 오가노이드를 캡슐화 할 수 있다. 여기에 단일 심근세포를 캡슐화 할 때는 체내 미세환경을 반영하기 위해 다른 세포를 더 포함할 수 있으며, 구체적으로는 혈관세포와 심장 섬유아세포를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물로 심장 오가노이드 또는 단일 심근세포를 캡슐화하여, 심근 분화를 증진시킬 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 지지체 조성물 또는 상기 제조방법에 의해 제조된 지지체 조성물에서 심장 오가노이드를 배양하는 방법을 제공한다.
기존의 매트리젤 기반 배양 시스템은 동물 암조직 유래의 추출물로서 배치 간의 차이가 크고 실제 간의 환경을 모사해주지 못하고, 심장 오가노이드로 분화, 발달되는 효율이 미흡한 반면, 상기 지지체 조성물은 심장 조직 유사 환경을 조성할 수 있으므로 심장 오가노이드 배양에 있어서 적합하다.
구체적으로 상기 지지체 조성물 또는 상기 제조방법에 의해 제조된 지지체 조성물은 심장 오가노이드 또는 단일 심근세포를 캡슐화하여 심장 오가노이드를 배양하는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로 단일 심근세포 자체를 캡슐화 하고, 이를 배양하여 심장 오가노이드를 배양하거나, 배양된 심장 오가노이드를 캡슐화하고 배양할 수 있다. 여기에 단일 심근세포를 캡슐화 할 때는 체내 미세환경을 반영하기 위해 다른 세포를 더 포함할 수 있으며, 구체적으로는 혈관세포와 심장 섬유아세포를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물로 심장 오가노이드 또는 단일 심근세포를 캡슐화 하여, 심근 분화를 증진시킬 수 있다.
상기 배양은 적합한 조건에서 세포를 유지 및 성장시키는 과정을 의미하며, 적합한 조건은 예컨대, 세포가 유지되는 온도, 영양소 가용성, 대기 CO2 함량 및 세포 밀도를 의미할 수 있다.
서로 다른 유형의 세포를 유지, 증식, 확대 및 분화시키기 위한 적절한 배양 조건은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 문서화 되어있다. 상기 오가노이드 형성에 적합한 조건은 세포 분화 및 다세포 구조의 형성을 용이하게 하거나 허용하는 조건일 수 있다.
본 발명에서 제작된 탈세포 심장 조직 유래 지지체를 이용하면 지지체 내에 풍부하게 존재하는 심장 조직 특이적 세포외기질 성분에 의한 심장 미세환경 구현이 가능하여 실제 심장 조직을 모사하는 더욱 고도화된 오가노이드를 제작할 수 있다. 이는 기존의 상용화된 대표적인 오가노이드 배양 지지체인 매트리젤을 대체하여 산업적으로 고부가가치 창출이 가능하다.
또한, 구조와 기능이 고도화된 인간 심장 오가노이드는 차세대 신약 개발 및 약물 독성 평가에 활용될 수 있는 높은 잠재성을 지닌다. 신약 개발 과정 중 약물의 심장 독성을 정확하게 예측하는 것은 신약 개발의 중요한 성공 요인 중 하나이다. 기존의 세포주 또는 동물모델이 약물의 심장 독성을 정확하게 예측하지 못하는 경우가 많기 때문에 이는 신약 개발에 있어 막대한 비용과 시간이 낭비되고 큰 걸림돌이 되어 왔다. 인간 심장 오가노이드는 약물의 유효성 및 안전성을 판단함에 있어 기존의 모델들에 비해 정확도가 높고 시간과 비용 측면에서 경제적이기 때문에 신약 개발을 위한 제약 산업에 큰 기여를 할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명에서 확립된 인간 심장 오가노이드는 심장 조직을 구조적, 기능적으로 정밀하게 모사할 수 있기 때문에, 현재 구현하기 어려운 다양한 심장 질환 모델 제작에 활용될 수 있다. 따라서 탈세포 심장 조직 유래 지지체 기반 오가노이드 배양 기술을 적용한 심장 질환 모델링 플랫폼은 난치성 심장 질환의 기전 연구에 적용되어 의료 산업 발전에 기여할 수 있다. 오가노이드를 환자 줄기세포에서 제작하면 환자 맞춤형 정밀의료 플랫폼으로 개발이 가능하며 나아가 심근경색 등 손상된 심장 조직을 재건하는 재생의학적 용도로도 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1 및 2는 심장 오가노이드 배양을 위한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체 (Heart Extracellular Matrix, HEM)를 제작 및 분석한 것이다.
도 3은 심장 오가노이드 배양을 위한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 단백체를 분석한 것이다.
도 4는 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM)의 matrisome 단백질 종류 및 정량 분석결과이다.
도 5는 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM)의 non-matrisome 단백질 분석결과이다.
도 6은 심장 조직의 탈세포 방법 비교 분석 및 최적화 선정을 나타낸 것이다.
도 7은 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM)를 이용한 심장 오가노이드 제작 과정이다.
도 8은 인간 역분화줄기세포 유래 심근세포 제작 및 오가노이드 캡슐화 방법을 이용한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 기반 인간 심장 오가노이드 제작결과를 나타낸 것이다.
도 9는 오가노이드 캡슐화 방법을 이용한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 기반 인간 심장 오가노이드의 유전자 발현을 분석한 것이다.
도 10은 오가노이드 캡슐화 방법을 이용한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 기반 인간 심장 오가노이드의 심근 분화도를 평가 분석한 것이다.
도 11은 오가노이드 캡슐화 방법을 이용한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 기반 인간 심장 오가노이드의 분화도를 평가 분석한 것이다.
도 12는 오가노이드 캡슐화 방법을 이용한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 기반 인간 심장 오가노이드의 약물 반응성 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 단일 심근세포 캡슐화 방법을 통한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 기반 인간 심장 오가노이드의 제작 방법 및 유전자 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 기반 혈관 세포 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 심근세포와 2종의 비심근세포 (Non-myocyte) 캡슐화 방법을 통한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 기반 인간 심장 오가노이드의 제작 및 최적화된 배양 조건 선별을 나타낸 것이다.
도 16 및 17은 심근세포와 2종의 비심근세포 (Non-myocyte) 캡슐화 방법을 적용한 혈관 구조를 가진 고도화된 인간 심장 오가노이드 제작 및 이를 위한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 농도 선별과정, 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 심근세포와 2종의 비심근세포 (Non-myocyte) 캡슐화 방법을 적용한 혈관 구조를 가진 고도화된 인간 심장 오가노이드 제작 및 이를 위한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 농도 선별과정을 나타낸 것이다.
도 19는 심근세포와 2종의 비심근세포 (Non-myocyte)의 HEM 캡슐화 방법 및 미세유체 칩을 활용한 인간 심장 오가노이드의 배양 방법 및 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 심근세포와 2종의 비심근세포 (Non-myocyte) 캡슐화 방법과 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM)를 이용한 LQT 환자 심장 오가노이드의 제작 과정 및 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 심근세포와 2종의 비심근세포 (Non-myocyte)의 HEM 캡슐화 방법 및 미세유체 칩을 활용한 LQT 환자 심장 오가노이드의 배양 및 분석결과를 나타낸 것이다.
본 발명에서는 돼지 심장 조직에 일련의 화학적 처리를 통해 다량의 탈세포 심장 조직 유래 지지체를 제작하였고 이를 심장 오가노이드 배양에 적용하였다. 심장 오가노이드를 배양하기 위해 세포외기질 성분이 충분히 남아있을 수 있는 최적의 프로토콜로 탈세포 지지체를 제작하여 실험을 진행하였다. 탈세포 과정을 진행한 결과, 심장 조직 내 세포를 효과적으로 제거하는 동시에 심장 조직 특이적 세포외기질 성분들을 잘 보존할 수 있음이 확인되었다. 제작된 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 성분으로 삼차원 오가노이드 배양을 위한 하이드로젤 형성이 가능함을 확인하였다.
본 발명에서는 인간 역분화줄기세포를 심근 세포로 분화시키고 이 세포를 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질로 제작된 하이드로젤 내에서 삼차원 배양하여 심장 오가노이드를 제작하였다. 탈세포 심장 조직 유래 하이드로젤 지지체에서 배양된 심장 오가노이드는 상용화된 지지체인 매트리젤 및 콜라겐 하이드로젤과 비교하여 심장 조직으로의 분화가 증진된 것을 유전자 발현 분석을 통해 확인하였다.
또한, 탈세포 심장 조직 유래 하이드로젤 지지체에서 배양된 심장 오가노이드가 매트리젤 및 콜라겐 하이드로젤에서 배양된 오가노이드에 비해서 박동도 가장 활발하였고 심근 특이적 단백질 발현이 가장 우수하며 심근 세포 특이적 근절구조가 제일 뚜렷하게 관찰되는 것을 확인하였다. 이를 통해 탈세포 심장 조직 유래 지지체가 심장 오가노이드 배양 지지체로서 기존 배양 지지체들을 대체할 수 있는 새로운 기능성 배양 플랫폼으로서 개발될 수 있는 가능성을 확인하였다.
새로 개발된 탈세포 심장 조직 유래 지지체 배양 플랫폼은 기존 고가의 배양 매트릭스 및 고분자 지지체에 비해서 제작이 간단하고 경제적이라는 장점이 있어 상용화에 매우 유리하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 심장 오가노이드 배양을 위한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체 (Heart Extracellular Matrix, HEM) 제작 및 분석
실시예 1-1. 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질의 제작 및 분석
도 1에 나타난 바와 같이, 탈세포 공정을 통해 돼지 심장 조직으로부터 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 (Heart Extracellular Matrix, HEM) 지지체를 제작하고, 이의 특성을 분석하였다.
심장 탈세포 과정은 24 시간 동안 냉장 조건에서 1 % sodium dodecyl sulfate (SDS) 처리를 한 뒤, 1 % Triton-X100과 0.1 % NH4OH를 6 시간 동안 냉장 조건에서 추가 처리하여 진행하였다. 탈세포 과정을 통해 제작된 세포외기질 성분들은 동결 건조를 통해 파우더 형태로 제작하였다. 대조군으로는 탈세포되지 않은 심장 조직을 사용하였다.
제작된 탈세포 심장 조직 유래 HEM 지지체에서 세포가 충분히 제거되었는지 세포외기질 성분들이 잘 보존되어 있는지 확인하기 위해 각각 DNA와 GAG (Glycosaminoglycans) 정량 분석한 결과, 제작된 탈세포 심장 조직 지지체에서 모두 탈세포 과정 후에 DNA는 충분히 제거되고 GAG는 실제 심장 조직과 유사한 수준으로 존재하고 있는 것을 확인하였다 (도 1(A)).
실시예 1-2. 지지체 조성물의 제작 및 분석
동결 건조하여 제작된 파우더 형태의 탈세포 심장 조직 유래 지지체 (Lyophilized HEM) 10 mg을 4 mg/ml 펩신 용액 (돼지 위 점막 유래 펩신 파우더 (4 mg)를 0.02 M HCL (1 ml)에 녹인 용액) 처리하여 48시간 동안 상온에서 용액화 과정을 진행하였다. 그 후 세포 배양에 사용될 수 있도록 10X PBS와 1 M NaOH를 이용하여 중성 pH와 1X PBS 버퍼의 전해질 상태로 맞추어 주었다. 마지막으로 인큐베이터 내 37℃ 온도 조건에서 30분 동안 하이드로젤 형성 (gelation)을 유도하였다.
유변학 분석을 실시하여 하이드로젤 물성을 측정했을 때 제작된 탈세포 심장 조직 유래 하이드로젤 지지체가 안정적인 고분자 네트워크 구조로 구성되어 있으며 오가노이드 배양에 적합한 기계적 물성을 가지고 있음을 확인하였다 (도 1 (B)).
한편, 돼지 심장 조직으로부터 탈세포 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM)를 제작하고 특성 분석하였다.
그 결과, 도 2에서 확인되는 바와 같이 탈세포 과정 전후의 심장 조직을 H&E 조직학 분석을 통해 관찰했을 때 세포핵은 대부분 제거되었으나 조직의 전반적인 구조는 유지되어 있는 것을 확인하였다 (도 2(A)). 그리고, 탈세포 심장 조직 유래 지지체로부터 형성된 하이드로젤의 내부 구조를 확인하기 위해 주사전자현미경 (scanning electron microscopy, SEM) 분석을 실시한 결과 HEM 하이드로젤의 내부가 나노섬유 형태의 세포외기질 성분으로 구성되어 있음을 알 수 있으며 이는 통해 제작된 하이드로젤이 심장 오가노이드의 성장에 적합한 미세환경을 제공해 줄 수 있음을 확인하였다 (도 2 (B)).
실험예 1: 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질의 분석
실험예 1-1. 심장 오가노이드 배양을 위한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 단백체 분석
탈세포 심장 조직 유래 지지체에 함유된 세포외기질 성분을 확인하기 위해 질량분석기를 이용한 단백체 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 3에서 확인되는 바와 같이 다양한 Collagens, Proteoglycans, Glycoproteins 등 많은 세포외기질 성분 및 당단백질들이 탈세포 심장 조직 유래 지지체에 포함되어 있는 것을 확인하였다. 이를 통해 실제 심장 조직에 존재하는 이러한 심장 특이적 성분들이 심장 오가노이드 분화, 구조 발달 및 기능 증진을 촉진시킬 수 있을 것으로 기대한다.
실험예 1-2. 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM)의 matrisome 단백질 종류 및 정량 분석
HEM에 포함된 matrisome 단백질들을 질량분석기를 이용한 단백체 분석을 통해 검출하여 단백질의 종류별로 분류하였고 상대적인 정량 분석을 진행하였다.
다양한 종류의 심장 조직 단백질들이 HEM에 존재하는 것을 확인하였고, 이 성분들이 심장 오가노이드 배양에 긍정적인 영향을 미칠 것을 예측할 수 있다 (도 4 (a, b)).
그리고, 단백질 상대 정량 분석을 통해 HEM에 가장 많이 포함되어 있는 10가지 matrisome 단백질들을 확인해 보았을 때, 콜라겐과 피브리노겐 서브타입이 많이 검출되었고 lumican, perlecan, laminin (gamma 1)도 많은 양이 검출된 것을 확인하였다. 또한, HEM 내에서 실제 심장 조직에 특이적으로 많이 존재한다고 알려진 matrisome 단백질 (laminin (alpha 2), thrombospondin 4, collagen type 6 (alpha 6), fibulin 2 등)들이 다양하게 검출되는 것을 확인하였다 (도 4(c)).
따라서, 매트리젤, 콜라겐, 피브린 등 단일 성분 단백질 또는 심장 비특이적 단백질을 기반으로 하는 기존 배양 시스템과 비교하여 다양한 심장 조직 matrisome 단백질을 함유하고 있는 HEM 하이드로젤이 심장 오가노이드 발달에 도움이 되는 심장 조직 특이적인 미세환경을 제공해 줌으로써 보다 고도화된 성숙한 심장 오가노이드를 제작하는데 도움을 줄 것을 알 수 있다.
실험예 1-3. 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM)의 non-matrisome 단백질 분석
본 발명의 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM)의 non-matrisome 단백질을 분석하였다.
그 결과, HEM에는 matrisome 뿐만 아니라 많은 양의 non-matrisome 단백질이 함유되어 있는 것을 확인하였다 (도 5 (a)). 또한, 실제 심장 조직에 많이 함유되어 있는 다양한 non-matrisome 단백질들이 HEM 내에 함유되어 있는 것을 확인하였다 (도 5 (b)).
한편, Non-matrisome 단백질들을 GOBP (gene ontology biological process) 방법으로 분석하여, 어떠한 biological process와 관련된 단백질들이 많이 포함되어 있는지 분석하였다. 그 결과 세포 골격 구성 (cytoskeleton organization), 세포 성분 구성 (cellular component organization), 세포 성분 결합 (cellular component assembly), 세포 기관 구성 (organelle organization) 등 조직의 형성에 관련된 단백질들을 특히 많이 함유하고 있는 것을 확인하였다 (도 5 (c)).
따라서, 이러한 non-matrisome 단백질들을 포함하고 있는 HEM 지지체를 이용하면 성숙한 심장 오가노이드 배양이 가능할 것을 알 수 있다.
실험예 1-4. 심장 조직의 탈세포 프로토콜 비교 분석 및 최적화
본 발명의 탈세포 방법 (Protocol 1)과 다른 탈세포 방법 (Protocol 2)을 비교하기 위한 실험을 진행하였다. 프로토콜 2는 프로토콜 1과 달리 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) 처리를 빼고, 1% Triton-X100과 0.1% NH4OH를 6시간만 처리하였다.
그 결과, 심장의 탈세포 공정 후 남아있는 DNA 양을 비교해 보았을 때 프로토콜 1로 제작된 탈세포 심장 매트릭스는 DNA가 대부분 제거된 것을 확인하였으나 프로토콜 2로 제작된 조직에서는 상당 부분 남아있는 것을 확인하였다. 또한, GAG 정량 분석을 통해 남아있는 세포외기질 성분을 비교해보면 프로토콜 1 처리 후 GAG 성분이 잘 보존되어 있는 반면 프로토콜 2 처리 후에는 남아있는 GAG 성분이 유의미하게 감소한 것을 확인할 수 있다 (도 6(a)).
그리고, 제작한 탈세포 매트릭스를 이용하여 하이드로젤을 제작한 후 기계적 물성 (modulus)을 측정한 결과 프로토콜 1로 제작한 하이드로젤의 물성이 유의미하게 높은 것을 확인하였다 (도 6 (b)).
또한, H&E 조직학 분석으로 비교해본 결과, 프로토콜 2로 제작된 매트릭스에서는 세포가 많이 남아있고 여전히 실제 심장 조직과 비슷한 형태를 유지하고 있는 것을 확인하였다 (도 6(c)).
한편, 각 탈세포 방법으로 제작된 매트릭스의 단백체 (proteomics) 분석을 실시한 결과. 프로토콜 1이 프로토콜 2에 비해 더 많은 개수의 세포외기질 단백질을 보존하는 것을 확인하였다 (도 6(d)).
따라서 본 연구에서 확립한 탈세포 방법이 다른 탈세포 방법보다 심장 조직의 세포외기질 단백질을 더욱 잘 보존할 수 있으며 심장 오가노이드 배양에 더욱 적합한 지지체 제작을 가능하게 함을 알 수 있다.
실시예 2: 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM)를 이용한 심장 오가노이드 제작
탈세포 심장 조직 유래 HEM 하이드로젤과 심근세포를 이용하여 심장 오가노이드를 제작하는 두 가지 방법을 도 7과 같이 수행하였다.
구체적으로, 첫번째 방법은 단일 심근세포를 마이크로웰 (Microwell)을 이용하여 삼차원 오가노이드 형태로 제작한 후, 제작된 심장 오가노이드를 HEM 하이드로젤 내에 캡슐화하여 배양 진행하는 방법이고, 두번째 방법은 단일 심근세포를 HEM 하이드로젤 내에 캡슐화 한 후 오가노이드 형성을 유도하여 HEM 하이드로젤이 세포 사이사이에 혼합된 형태의 심장 오가노이드를 제작하는 방법이다.
이하에서는 각 방법으로 HEM 하이드로젤을 이용하여 심근 분화가 증진된 심장 오가노이드를 제작할 수 있음을 검증한다.
실험예 2: 오가노이드 캡슐화 방법의 검증
실험예 2-1. 인간 역분화줄기세포 유래 심근세포 제작 및 오가노이드 캡슐화 방법을 이용한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 기반 인간 심장 오가노이드 제작
인간 유도만능줄기세포를 심근세포로 분화 유도하고, 분화된 심근세포를 마이크로웰 (Microwell)을 이용하여 삼차원 오가노이드 형태로 제작하였다. 그 후 심장 오가노이드를 HEM 하이드로젤 (4 mg/ml) 내에서 3차원 배양하여 분화 및 성숙도가 증진된 심장 오가노이드를 제작하였다.
일반적인 플레이트 (plate)에서 인간 유도만능줄기세포를 심근세포로 분화 유도하였을 때 분화 15일차에 세포끼리 유기적으로 연결되어 박동하는 것을 확인하였다. 또한, 17일 차에 면역염색을 통해 심장 특이적 단백질인 α-actinin의 발현과 근절 (sarcomere)구조도 확인하였다 (도 8 (A)).
마이크로웰 (Microwell)을 이용하여 분화된 심근세포를 삼차원 오가노이드 형태로 제작하였다. 형성된 오가노이드를 HEM 하이드로젤 내에서 3차원 배양을 진행하였다. 콜라겐 하이드로젤 (Col I) 및 매트리젤 (Mat)을 이용하여 배양한 그룹과 매트릭스 없이 배양액에 부유 배양한 그룹 (No ECM)을 비교군으로 사용하였다. 그 결과, HEM 하이드로젤에서 배양된 심장 오가노이드가 비교군 조건에서 배양된 오가노이드와 비교하여 더욱 활발히 박동하는 것을 확인하였다 (도 8(b)).
실험예 2-2. 오가노이드 캡슐화 방법을 이용한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 기반 인간 심장 오가노이드의 유전자 발현 분석
HEM 하이드로젤 (4 mg/ml) 내에서 삼차원 배양한 인간 심장 오가노이드의 분화 증진 정도를 확인하기 위해 배양 7일차에 qPCR 분석을 진행하였다. 콜라겐 하이드로젤 (Col I) 및 매트리젤 (Mat)을 이용하여 배양한 그룹과 매트릭스 없이 배양액에 부유 배양한 그룹 (No ECM)을 비교군으로 적용하였다.
그 결과, 도 9에서 확인되는 바와 같이 HEM 하이드로젤을 이용해서 제작한 인간 심장 오가노이드에서 심근 특이적 유전자인, TNNT2, NPPA, SCN5A의 발현이 대조군들에 비해 더욱 증진된 것을 확인하였다.
따라서, HEM 하이드로젤이 기존 오가노이드 배양 지지체 보다 인간 심장 오가노이드의 심근 분화를 더욱 촉진하는 것을 확인하였다.
실험예 2-3. 오가노이드 캡슐화 방법을 이용한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 기반 인간 심장 오가노이드의 심근 분화도 평가 분석
HEM 하이드로젤이 인간 심장 오가노이드의 심근 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해 배양 7일차에 심근 특이적 마커인 Troponin I (TNNI)에 대한 면역염색을 실시하였다. 콜라겐 하이드로젤 (Col I) 및 매트리젤 (Mat)을 이용하여 배양한 그룹과 매트릭스 없이 배양액에 부유 배양한 그룹 (No ECM)을 비교군으로 사용하였다.
그 결과, 도 10에서 확인되는 바와 같이 HEM 하이드로젤 (4 mg/ml)을 이용하여 제작한 인간 심장 오가노이드에서 심근세포의 모양이 더욱 성숙한 형태로 존재하며 TNNI 발현이 매우 높은 것을 확인하였다. 또한, 근절 (sarcomere) 특이적 구조가 대조군들에 비해 확연히 뚜렷하게 관찰되었다.
실험예 2-4. 오가노이드 캡슐화 방법을 이용한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 기반 인간 심장 오가노이드의 분화도 평가 분석
HEM 하이드로젤이 심장 오가노이드의 심근 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해 배양 7일차에 심근세포 특이적 마커인 α-actinin 및 cTnT에 대한 면역염색을 실시하여 해당 마커의 단백질 발현 수준을 비교하였다. 콜라겐 하이드로젤 (Col I) 및 매트리젤 (Mat)을 이용하여 배양한 그룹을 비교군으로 적용하였다.
그 결과, 도 11에서 HEM 하이드로젤 (4 mg/ml)을 이용해서 제작한 인간 심장 오가노이드에서 심근세포가 더욱 성숙한 형태로 존재함을 확인하였고 심근 특이적 근절 (sarcomere)구조가 대조군들에 비해 확연히 뚜렷하게 관찰되었다.
실험예 2-5. 오가노이드 캡슐화 방법을 이용한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 기반 인간 심장 오가노이드의 약물 반응성 분석
HEM 하이드로젤 (4 mg/ml)에서 배양한 인간 심장 오가노이드의 약물에 대한 반응성을 확인하기 위해 심근 박동수에 영향을 미치는 두 가지 대표 약물 (isoproterenol 및 propranolol)을 배양 7일차에 처리하고, 그에 대한 오가노이드의 반응을 칼슘 이미징을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 12에서 확인되는 바와 같이 박동수를 증가시키는 isoproterenol을 1 μM 농도로 처리하였을 때 심장 오가노이드의 박동수가 빨라지는 것을 확인하였고, propranolol을 10 μM 농도로 처리하였을 때는 박동이 느려지는 것을 확인하였다.
이를 통해 HEM 하이드로젤에서 배양한 인간 심장 오가노이드가 약물에 대한 적절한 반응성을 보여줄 수 있음을 확인하였고, 따라서 다양한 약물에 대한 심장 반응을 평가하는 용도로 활용 가능함이 검증되었다.
실험예 3: 단일 심근세포 캡슐화 방법의 검증
실험예 3-1. 단일 심근세포 캡슐화 방법을 통한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 기반 인간 심장 오가노이드의 제작 방법 및 유전자 발현 분석
형성된 오가노이드를 HEM 하이드로젤 내에 캡슐화하는 방법과 달리 인간 유도만능줄기세포 유래의 심근세포를 단일 세포 상태로 HEM 하이드로젤에 캡슐화하여 인간 심장 오가노이드를 제작하는 방법을 시도하였다.
그 결과, 세포를 배양할수록 하이드로젤이 수축하여 단단한 덩어리의 심장 오가노이드가 형성되었다. 다양한 농도의 HEM 하이드로젤을 이용하여 심장 오가노이드를 제작하였고, 오가노이드를 캡슐화 하는 방법에 비해 비교적 크기가 큰 심장 오가노이드를 제작할 수 있음을 확인하였다 (도 13 (A)).
그리고, HEM 하이드로젤의 심근 분화 증진 효과를 확인하기 위해 배양 7일차에 qPCR 분석을 진행하였고, 매트리젤 (Mat) 내에서 배양한 심장 오가노이드를 대조군으로 비교하였다.
그 결과, HEM 하이드로젤을 이용해서 제작한 인간 심장 오가노이드에서 심근 특이적 유전자인 TNNT2, NPPA의 발현이 대조군인 매트리젤에서 배양된 심장 오가노이드에 비해 더욱 증진된 것을 확인하였다 (도 13 (B)).
따라서, HEM 하이드로젤은 단일 심근세포를 캡슐화 방법을 통해서도 인간 심장 오가노이드의 형성과 심근 분화를 더욱 촉진하는 것을 확인하였다.
실험예 3-2. 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 기반 혈관 세포 배양
오가노이드 내부의 혈관 구조 형성은 오가노이드 성장, 발달 및 기능에 있어 매우 중요한 요소이기 때문에 심장 오가노이드의 혈관화를 위해 HEM 하이드로젤 내에서 혈관 세포의 배양 가능 여부를 조사하였다.
구체적으로 HEM 하이드로젤이 혈관내피세포 (endothelial cell)의 배양에 적합한지 판단하기 위해 다양한 농도의 HEM 하이드로젤에서 HUVEC (human umbilical vein endothelial cell) 세포를 단일 세포 캡슐화 방식으로 봉입하고 배양을 진행하였다.
배양 7일차에 혈관 마커 CD31과 VE-Cadherin의 면역염색을 통해 분석한 결과, 도 14에서 확인되는 바와 같이 모든 농도에서 배양은 가능하지만 2 mg/ml HEM 하이드로젤 조건에서 혈관세포 마커의 발현이 높고 세포 spreading이 가장 잘 일어남을 확인함으로써 배양에 가장 최적의 농도임을 확인하였다.
실험예 3-3. 심근세포와 2종의 비심근세포 (Non-myocyte) 캡슐화 방법을 통한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 기반 인간 심장 오가노이드의 제작 및 최적화된 배양 조건 선별
구조적, 기능적으로 더욱 고도화된 혈관 구조를 갖춘 심장 모델을 제작하기 위해, 실제 심장에 존재하는 비심근세포 (Non-myocyte)인 혈관세포 (endothelial cell)와 심장 섬유아세포 (cardiac fibroblast)를 함께 HEM 하이드로젤에 단일 세포 캡슐화 방식으로 봉입하여 3종 세포가 공배양된 심장 오가노이드를 제작하였다. 혈관세포는 HUVEC 세포를 이용하였고 심장 섬유아세포는 인간 유도만능줄기세포에서 분화하여 사용하였다 (도 15 (A)).
구체적으로, 공배양 배양액 조건의 선별을 위해, 심근세포 배양액과 혈관세포 배양액을 다양한 비율로 혼합하여 배양 조건 선별 실험을 진행하였다.
배양 7일차에 면역 염색을 통해 심근세포 마커 (cTnT)와 혈관세포 마커 (CD31)의 단백질 발현을 확인해 보았을 때, CM (심근세포 배양액) + 50% EGM (혈관세포 배양액) 조건에서 혈관화가 제일 잘 이루어지고 심근 특이적 단백질의 발현도 문제가 없는 것을 확인하였다 (도 15 (B)).
따라서, 이후의 공배양 심장 오가노이드 제작은 CM + 50% EGM 배양액 조건으로 진행하였다.
실험예 3-4. 심근세포와 2종의 비심근세포 (Non-myocyte) 캡슐화 방법을 적용한 혈관 구조를 가진 고도화된 인간 심장 오가노이드 제작 및 이를 위한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 농도 선별
심근세포와 2종의 비심근세포 (Non-myocyte) 캡슐화 방법을 적용한 혈관 구조를 가진 고도화된 인간 심장 오가노이드 제작 및 이를 위한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 농도를 선별하였다.
구체적으로, 2, 4, 6 mg/ml 농도의 HEM 하이드로젤에서 3종 세포 (심근세포, 혈관세포, 심장 섬유아세포)를 단일 세포 캡슐화 방식으로 총 2 x 105 (비율 2:1:1)의 세포를 배양하여 심장 오가노이드를 제작하였다.
그 결과 배양 7일차의 현미경 분석을 통해 성공적으로 구형의 심장 오가노이드가 제작됨을 확인하였다 (도 16 (A)). 또한, 배양 7일차에 각 농도의 HEM 하이드로젤에서 형성된 심장 오가노이드의 크기를 비교해 보았을 때, HEM 농도가 낮을수록 오가노이드가 응축하여 보다 조밀한 구조를 가지는 작은 크기의 오가노이드가 형성되는 것을 확인하였다 (도 16 (B)).
그리고, 배양 7일차에 qPCR 분석을 통해 HEM 하이드로젤의 농도 별로 mRNA 발현 정도를 비교한 결과. 심근 특이적 마커인 TNNT2, NPPA 발현과 혈관 특이적 마커인 PECAM1, vWF 발현을 확인해 보았을 때, 농도가 낮은 HEM 하이드로젤 조건에서 심근 분화와 혈관 성숙이 더욱 증진되는 것을 확인하였다 (도 16 (C)).
따라서, 2 mg/ml 농도의 HEM 하이드로젤에서 3종의 세포가 공배양된 심장 오가노이드가 조밀한 구조를 가진 가장 응축된 형태로 배양되고, 혈관화 및 심근 분화가 더욱 증진되는 것을 확인하였다.
그리고, 배양 7일차에 면역염색을 통해 심근세포 (cTnT), 혈관세포 (CD31), 심장 섬유아세포 (VIM, DDR2)의 분포를 확인하였다.
그 결과, 도 17에서 확인되는 바와 같이 농도가 낮을수록 심장 오가노이드가 응축하여 세포들 간의 연결이 잘 이루어지고 각 마커들의 발현도 우수한 것을 확인하였다.
따라서, 2 mg/ml 농도의 HEM 하이드로젤에서 3종의 세포가 공배양된 심장 오가노이드가 가장 응축된 형태로 배양되면서 혈관화 및 심근 분화가 더욱 증진되는 것을 확인하였다.
실험예 3-5. 심근세포와 2종의 비심근세포 (Non-myocyte) 캡슐화 방법을 적용한 혈관 구조를 가진 고도화된 인간 심장 오가노이드 제작 및 이를 위한 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM) 농도 선별
다양한 농도의 HEM 하이드로젤에서 14일간 3종 세포가 공배양된 심장 오가노이드의 내부 구조를 확인하기 위해 조직학 분석을 이용하여 면역염색을 진행하였다.
심근세포 마커 cTnT, 혈관세포 마커 CD31, 심장 섬유아세포 마커 VIM을 확인해 본 결과, 도18에서 확인되는 바와 같이 2 mg/ml 및 4 mg/ml 농도의 HEM 하이드로젤에서 세포들이 긴밀하게 연결되고 밀집된 구조체를 형성하고 있는 것을 확인하였다. 6 mg/ml HEM 그룹과 대조군인 매트리젤의 경우, 세포들이 단일 세포의 형태로 남아있어 오가노이드 내부에 유기적인 구조를 형성하지 못하는 것을 확인하였다.
실험예 3-6. 심근세포와 2종의 비심근세포 (Non-myocyte)의 HEM 캡슐화 방법 및 미세유체 칩을 활용한 인간 심장 오가노이드의 배양
더욱 고도화된 인간 심장 모델을 제작하기 위해, 인체의 혈류를 모사하는 미세한 배양액 흐름을 제공할 수 있는 미세유체 칩을 이용하여 칩 내에서 HEM 하이드로젤을 이용하여 심장 오가노이드를 배양하였다. 매트리젤 (Mat)은 대조군으로 사용하였다.
배양 14일차에 면역염색을 통해 심근세포 (cTnT), 혈관세포 (CD31), 심장 섬유아세포 (VIM) 마커의 발현을 비교해 보았을 때, 도 19에서 확인되는 바와 같이 2 mg/ml HEM 하이드로젤 내 심장 오가노이드에서 모든 세포 마커의 발현이 가장 우수하였고 유기적인 구조를 가지는 고도화된 오가노이드 형성이 가능하였다.
따라서, 본 실험을 통해 HEM 하이드로젤과 미세유체 칩을 접목하면 더욱 고도화된 3종 세포가 공배양된 인간 심장 오가노이드를 제작할 수 있음을 확인하였다.
실험예 4: 본 발명 지지체 조성물의 활용 가능성 확인
실험예 4-1. 심근세포와 2종의 비심근세포 (Non-myocyte) 캡슐화 방법과 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 지지체(Heart Extracellular Matrix, HEM)를 이용한 LQT 환자 심장 오가노이드의 제작
QT 연장 증후군 (long QT syndrome; LQT) 환자의 유도만능줄기세포로부터 분화한 심근세포를 이용하여 단일 세포 캡슐화 방법을 통해 심장 오가노이드를 제작하였다. 구체적으로, 2 mg/ml 농도의 HEM 하이드로젤을 이용하여 진행하였다. 심근세포 이외에 2종의 비심근세포 (혈관세포 및 심장 섬유아세포)를 함께 캡슐화 하였고, 유형이 다른 LQT 환자 줄기세포 (LQT2 및 LQT3)로부터 분화된 심근세포를 이용하여 심장 오가노이드를 제작하였다.
그 결과 도 20에서 확인되는 바와 같이 배양 14일차에 광학 현미경 분석을 통해 HEM 하이드로젤 내에서 LQT 심장 오가노이드가 형성되며 배양이 성공적으로 잘 이루어지는 것을 확인함.
이를 통해, HEM 하이드로젤을 이용하여 인간 심장 질환 오가노이드 모델 제작이 가능한 것을 확인함으로써 HEM 하이드로젤이 체외 질환 모델링을 위한 효과적인 오가노이드 배양 매트릭스로서 적용 가능함을 알 수 있다.
실험예 4-2. 심근세포와 2종의 비심근세포 (Non-myocyte)의 HEM 캡슐화 방법 및 미세유체 칩을 활용한 LQT 환자 심장 오가노이드의 배양 및 분석
실험예 4-1과 같이 LQT 환자 유도만능줄기세포 유래 심근세포와 혈관세포, 심장 섬유아세포를 2 mg/ml HEM 하이드로젤 내에 공배양하고 이를 미세유체 칩 내에 적용하여 미세 배양액 흐름을 제공하는 동적 배양을 통해 LQT 질환 심장 오가노이드를 제작하였다.
그 결과 도 21에서 확인되는 바와 같이 배양 14일차에 심장 오가노이드의 박동 분석을 통해 정상 심장 오가노이드는 규칙적인 박동을 보여주는데 반해 LQT 질환 오가노이드는 비규칙적인 박동을 보이는 것을 확인하였다.
본 실험을 통해, HEM 하이드로젤을 이용하여 제작한 LQT 질환 오가노이드가 해당 질환 특성을 가지고 있는 것을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (9)

  1. 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질 (Heart Extracellular Matrix, HEM)을 포함한 지지체 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질은 0.01 내지 10 mg/mL로 포함되는 것인 지지체 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 0.1 내지 10Hz 기준 탄성계수가 1 내지 150 Pa인 지지체 조성물.
  4. (a) 분리된 심장 조직을 탈세포화하여 탈세포된 심장 조직을 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 탈세포된 심장 조직을 건조하여 탈세포 심장 조직(Heart Extracellular Matrix, HEM)을 제조하는 단계; 를 포함하는 지지체 조성물 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 (a) 단계는 상기 분리된 심장 조직을 1 내지 10℃에서 12 내지 36시간 0.1 내지 2% SDS (sodium dodecyl sulfate) 처리하고 탈세포화 용액에서 교반시켜 탈세포화하는 것인 지지체 조성물 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 탈세포화 용액은 0.1 내지 5%의 Triton X-100 및 0.01 내지 0.5% 수산화 암모늄을 포함하는 것인 지지체 조성물 제조방법.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 탈세포는 심장 조직 세포가 95 내지 99.9% 제거된 지지체 조성물 제조방법.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 (b) 단계 이후, 탈세포 심장 조직 유래 세포외기질은 0.01 내지 10 mg/mL 로 포함되도록 조절하는 단계를 더 포함하는 것인 지지체 조성물 제조방법.
  9. 제1항의 지지체 조성물 또는 제4항의 제조방법에 의해 제조된 지지체 조성물에서 심장 오가노이드를 배양하는 방법.
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