KR20220068173A - 췌장 오가노이드 배양 및 이식을 위한 탈세포 췌장 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탈세포 췌장 조직(Pancreas Extracellular Matrix; PEM)을 이용한 췌장 오가노이드 배양 및 이식용 지지체에 관한 것이다.

Description

췌장 오가노이드 배양 및 이식을 위한 탈세포 췌장 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법{PANCREAS EXTRACELLULAR MATRIX-DERIVED SCAFFOLD FOR CULTURE AND TRANSPLANTATION OF PANCREAS ORGANOID AND PREPARING METHOD THEREOF}

본 발명은 췌장 오가노이드 배양 및 이식을 위한 탈세포 췌장 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

최근 각광받고 있는 오가노이드는 신약 스크리닝, 약물 독성 평가, 질환 모델링, 세포 치료제, 조직공학 등 다양한 임상적 적용이 가능한 조직 유사체로서 전 세계적으로 급격하게 성장하고 있는 기술이다. 오가노이드는 삼차원 구조체 내에 인체의 특정 장기 및 조직을 구성하는 다양한 세포로 이루어져 있을 뿐만 아니라 그들 간의 복합적인 상호 작용을 구현할 수 있기 때문에 단순 세포주 모델이나 동물 모델과 같은 기존에 주로 이용되던 약물 평가 모델과 비교해서 훨씬 정확한 체외 모델 플랫폼으로 적용이 가능하다.

췌장 이외에도 장기 별로 다양한 오가노이드 종류가 존재하는데 이를 연구하는 전 세계 수많은 연구팀에서 현재까지 오가노이드를 배양하기 위해 배양 지지체로서 공통적으로 매트리젤(Matrigel) 제품을 이용하고 있다. 하지만 매트리젤은 쥐의 육종암 조직에서 추출한 성분이기 때문에, 제품의 품질을 균일하게 유지하기 어려우며 고가이고 동물성 감염균 및 바이러스 전이 등 안전성 측면에서 문제가 있어 오가노이드 배양 시스템으로서 매트리젤은 해결해야 하는 많은 문제점을 가지고 있다. 특히, 암 조직 유래의 소재로서 특정 조직 오가노이드 배양을 위해 필요한 최적의 조직 특이적 미세환경을 제공해 주지 못한다. 매트리젤을 대체하기 위한 고분자 기반 하이드로젤 개발 연구가 일부 진행되어 왔으나 아직까지 매트리젤을 대체할만한 수준의 소재는 보고된 바 없다.

췌장 오가노이드는 췌장 조직에서 성체줄기세포를 추출하여 배양하거나 인간 유도만능줄기세포 또는 배아줄기세포와 같은 전분화능 줄기세포를 췌장 전구세포로 분화시킨 후 배양하는 방법으로 제작한다. 매트리젤이 생체 내 복합적인 췌장 조직 특이적 미세환경을 구현하지 못하기 때문에 췌장 오가노이드 분화 효율 및 기능에 있어 개선이 필요한 상황이다. 따라서 보다 성숙하고 기능적인 췌장 오가노이드를 제작하기 위한 배양 시스템의 개발이 절실히 요구되고 있다.

또한, 급성 및 만성 췌장염, 당뇨, 췌장암 등 대량의 세포 손실 및 췌장 기능 저하가 발생하는 난치성 췌장 질환을 체외에서 구현하고 그 기전을 밝히는 질병 모델링 연구 및 약물 테스트를 위한 체외 모델 플랫폼이 필요한 상황이다.

이러한 현재 당면한 췌장 오가노이드 배양 및 관련 응용 기술에 있어 기술적 문제를 해결하기 위해 본 발명에서는 췌장 조직으로부터 탈세포 과정을 거쳐 췌장 조직 유래 탈세포 지지체를 제작하였고, 이를 췌장 오가노이드 배양에 이용하는 새로운 플랫폼을 제시한다. 개발된 탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤 지지체는 췌장 조직 특이적 다양한 세포외기질 및 성장인자들이 풍부하게 함유되어 있어 매트리젤을 사용했을 때와 비교하여 췌장 오가노이드의 분화, 성숙도, 기능성을 증진시켰다.

KR10-2021-0069619A

본 발명은 돼지 췌장 조직을 화학적 처리하여 대량의 탈세포 조직을 얻고 이를 기반으로 하이드로젤 지지체를 제작하여 췌장 오가노이드 배양에 적용하기 위한 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.

본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양상은 췌장 조직 유래 세포외기질 (Pancreas Extracellular Matrix; PEM)을 포함하는 췌장 오가노이드 배양 및 이식용 지지체를 제공한다.

상기 “세포외기질(extracellular matrix)”은 포유류 및 다세포 생물(multicellular organisms)에서 발견된 조직의 탈세포화를 통해 제조된 세포 성장용 자연 지지체를 의미한다. 상기 세포외기질은 투석 또는 가교화를 통해 더 처리할 수 있다.

상기 세포외기질은 콜라겐(collagens), 엘라스틴(elastins), 라미닌(laminins), 글리코스아미노글리칸 (glycosaminoglycans), 프로테오글리칸(proteoglycans), 항균제(antimicrobials), 화학유인물질(chemoattractants), 시토카인 (cytokines), 및 성장 인자에 제한되지 않는, 구조형 및 비구조형 생체 분자(biomolecules)의 혼합물일 수 있다.

상기 세포외기질은 포유 동물에 있어서 다양한 형태로서 약 90%의 콜라겐을 포함할 수 있다. 다양한 생체 조직에서 유래한 세포외기질은 각각의 조직에 필요한 고유 역할 때문에 전체 구조체 및 조성이 상이할 수 있다.

상기 “유래(derive)", "유래된(derived)"은 유용한 방법에 의해 언급한 원천으로부터 수득한 성분을 의미한다.

본 발명의 일 구체예로 상기 췌장 조직 유래 세포외기질은 췌장 조직에 Triton X-100 및 수산화암모늄을 혼합한 용액을 처리하여 탈세포된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예로 상기 지지체 내 상기 췌장 조직 유래 세포외기질의 농도는 1 mg/ml 내지 10 mg/ml, 구체적으로는 2 mg/ml 내지 8 mg/ml 일 수 있다. 상기 췌장 세포외기질의 농도의 예시로, 2 mg/ml 내지 8 mg/ml, 2 mg/ml 내지 6 mg/ml, 2 mg/ml 내지 4 mg/ml, 4 mg/ml 내지 8 mg/ml, 4 mg/ml 내지 6 mg/ml 또는 6 mg/ml 내지 8 mg/ml 일 수 있고, 일 실시예로 2 mg/ml, 4 mg/ml, 6 mg/ml 또는 8 mg/ml일 수 있다. 상기 범위외의 농도로 포함될 경우, 본 발명이 목적하는 효과를 얻을 수 없다.

상기 지지체는 탈세포화하여 수득한 췌장 조직 유래 세포외기질을 기반으로 제조한 3차원 하이드로젤을 포함하며, 췌장 오가노이드 배양에 효과적으로 활용될 수 있다.

상기 탈세포화된 췌장 조직은 실제 조직 특이적 세포외기질 성분을 포함하므로 해당 조직의 물리적, 기계적, 생화학적 환경을 제공할 수 있으며, 췌장 조직 세포로의 분화 및 조직 특이적 기능성을 증진시키는데 매우 효율적이다.

상기 “오가노이드(organoid)”는 조직 또는 전분화능줄기세포에서 유래된 세포를 3D 형태로 배양하여 인공장기와 같은 형태로 제작한 초소형 생체기관을 의미한다.

상기 오가노이드는 줄기세포에서 발생하고 생체 내 상태와 유사한 방식으로 자가-조직화(또는 자가-패턴화)하는 장기 특이적 세포를 포함한 삼차원 조직 유사체로서 제한된 요소(Ex. growth factor) 패터닝에 의해 특정 조직으로 발달할 수 있다.

상기 오가노이드는 세포의 본래 생리학적 특성을 가지며, 세포 혼합물(한정된 세포 유형뿐만 아니라 잔존 줄기 세포, 근접 생리학적 니치(physiological niche)를 모두 포함) 원래의 상태를 모방하는 해부학적 구조를 가질 수 있다. 상기 오가노이드는 3차원 배양 방법을 통해 세포와 세포의 기능이 더욱 잘 배열되고, 기능성을 가지는 기관 같은 형태와 조직 특이적 기능을 가질 수 있다.

본 발명의 다른 일 양상은 1) 분리된 췌장 조직을 파쇄하는 단계; 및 2) 상기 파쇄된 췌장 조직에 Triton X-100 및 수산화 암모늄을 처리하여 탈세포하여 탈세포된 췌장 조직 유래 세포외기질 (PEM)을 제조하는 단계를 포함하는 췌장 오가노이드 배양 및 이식용 지지체 제조방법을 제공한다.

상기 1) 단계는 분리된 췌장 조직을 파쇄하는 단계로, 상기 췌장 조직은 공지의 동물에서 분리된 것일 수 있고, 상기 동물의 구체적인 예시로, 소, 돼지, 원숭이, 인간 등일 수 있다. 또한 본 발명에서는 상기 분리된 췌장 조직을 파쇄한 뒤 탈세포 처리하기 때문에 탈세포의 효율이 높다. 분리된 췌장 조직을 파쇄하는 방법은 공지의 방법으로 이루어질 수 있다. 본 발명은 상기 췌장 조직을 파쇄하여 탈세포 공정을 거쳤기 때문에 더 효율적이고 높은 수준의 세포 제거가 가능하다.

상기 2) 단계는 상기 파쇄된 췌장 조직에 Triton X-100 및 수산화 암모늄을 처리하여 탈세포하여 탈세포된 췌장 조직 유래 세포외기질 (PEM)을 제조하는 단계이다. 본 발명은 기존의 탈세포 방식과 달리 Triton X-100 및 수산화 암모늄만을 처리하여, 조직 손상을 최소화함으로써 췌장 조직 내의 다양한 단백질들이 더 많이 보존될 수 있다, 구체적인 예시로 파쇄된 췌장 조직을 Triton X-100 및 수산화 암모늄을 함께 교반하면서 탈세포 공정이 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구체예로 상기 2) 단계 이후 3) 상기 탈세포 췌장 조직 유래 세포외기질 (PEM)을 동결건조 하여 동결건조 췌장 조직 유래 세포외기질을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 3) 단계는 상기 탈세포 췌장 조직 유래 세포외기질 (PEM)을 동결건조 하여 동결건조 췌장 조직 유래 세포외기질을 제조하는 단계이다. 상기 동결건조 췌장 조직 유래 세포외기질은 멸균을 위해 건조 후 전자 빔, 감마 방사선, 에틸렌 옥사이드 가스 또는 초임계 이산화탄소에 노출시킬 수 있다.

본 발명의 일 구체예로 상기 3) 단계 이후 4) 상기 동결건조 췌장 조직 유래 세포외기질을 하이드로젤 형태의 췌장 오가노이드 배양 및 이식용 지지체로 형성하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 4) 단계는 상기 동결건조 췌장 조직 유래 세포외기질을 하이드로젤 형태의 췌장 오가노이드 배양 및 이식용 지지체로 형성하는 단계이다. 상기 단계는 젤화 (gelation)를 통해 이루어질 수 있으며, 구체적으로는 상기 동결건조 췌장 조직 유래 세포외기질을 펩신 용액에 용해시켜 용액화 한 뒤 pH를 조정하여 하이드로젤화 하는 것일 수 있다. 상기 탈세포 췌장 조직 유래 세포외기질을 가교시켜 3차원 하이드로젤 형태의 지지체를 제작할 수 있고, 겔화된 지지체는 실험, 스크리닝 뿐만 아니라 오가노이드 배양과 관련된 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

상기 “하이드로젤”은 졸-겔 상변이를 통해 물을 분산매로 하는 액체가 굳어 유동성을 상실하고 다공성 구조를 이루는 물질로서, 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창함으로써 형성될 수 있다.

상기 젤화는 동결건조 췌장 조직 유래 세포외기질을 산성 용액에서 펩신 또는 트립신과 같은 단백질 분해 효소로 용액화하고, pH를 조정, 구체적으로 10X PBS와 1 M NaOH를 이용하여 중성 pH와 1X PBS 버퍼의 전해질 상태로 맞추고 37℃의 온도에서 30분 동안 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 양상은 상기 지지체 또는 상기 제조방법에 의해 제조된 지지체에서 췌장 오가노이드를 배양하는 방법을 제공한다.

기존의 매트리젤 기반 배양 시스템은 동물 암조직 유래의 추출물로서 배치 간의 차이가 크고 실제 췌장의 환경을 모사해주지 못하고, 췌장 오가노이드로 분화, 발달되는 효율이 미흡한 반면, 상기 지지체는 췌장 조직 유사 환경을 조성할 수 있으므로 췌장 오가노이드 배양에 있어서 적합하다.

상기 배양은 적합한 조건에서 세포를 유지 및 성장시키는 과정을 의미하며, 적합한 조건은 예컨대, 세포가 유지되는 온도, 영양소 가용성, 대기 CO₂ 함량 및 세포 밀도를 의미할 수 있다.

서로 다른 유형의 세포를 유지, 증식, 확대 및 분화시키기 위한 적절한 배양 조건은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 문서화 되어있다. 상기 오가노이드 형성에 적합한 조건은 세포 분화 및 다세포 구조의 형성을 용이하게 하거나 허용하는 조건일 수 있다.

본 발명에서 개발된 췌장 오가노이드 배양 및 이식용 지지체는 기존의 대표적인 오가노이드 배양용 지지체인 매트리젤이 가지고 있는 한계를 극복한 새로운 췌장 오가노이드 배양 지지체로서 개발되어, 췌장 오가노이드 기반의 대규모 신약 스크리닝 플랫폼이나 조직 재생을 위한 세포 치료제 등 다양한 전임상, 임상 연구의 요소 기술로 활용되어 산업적, 경제적 측면에서 고부가가치를 창출하고 의료 신산업의 발전을 도모할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명에서 개발한 췌장 오가노이드 배양 및 이식용 지지체를 이용하면 기존 배양 방식과 비교하여 고도화된 췌장 오가노이드를 제작할 수 있으므로 기존의 약물 테스트를 위한 체외 모델을 뛰어넘는 경제적이면서도 더욱 정확한 플랫폼으로 활용될 수 있다. 이에 따라, 고도화된 췌장 오가노이드 기반의 체외 모델 플랫폼은 신약 개발 성공율을 크게 높이고 비용 및 소요 시간을 크게 줄여 의료 산업 발전에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대한다.

탈세포 췌장 조직 유래 인공 매트릭스 지지체는 다양한 난치성 췌장 질환(급성 및 만성 췌장염, 당뇨병, 췌장암 등)을 체외에서 구현하고 그 기전을 밝히는 질병 모델링 연구 및 이식 치료 플랫폼 구축 등 다양한 분야에서 광범위하게 이용 가능할 것으로 기대된다. 이러한 난치성 췌장 질환은 최근 유병률이 크게 증가하여 많은 연구가 필요한 상황이므로 연구용 시약으로서도 수익 창출이 가능하다.

췌장 오가노이드는 전세계적으로 인구의 10% 이상의 유병률을 보이는 각종 합병증을 야기하는 당뇨병 연구에 활용될 수 있으며 암 중에서도 가장 생존율이 낮은 췌장암 연구에도 적용될 수 있다는 점에서 매우 큰 가치가 있다.

본 발명에서 개발된 지지체는 조직 줄기세포 유래 췌장 오가노이드 뿐 아니라 췌장암 오가노이드 배양에도 적용이 가능하므로 난치성 질환 및 암 환자 맞춤형 질환 모델 구축에 기여하여 정밀의학 플랫폼 기술로서도 활용될 수 있으며 최근 급증하는 정밀의학 시장의 규모를 고려하면 막대한 부가가치 창출이 가능할 것으로 기대된다.

종합하면 위에서 기술했듯이 췌장 오가노이드의 응용을 위해서 필수적으로 요구되는 매트리젤과 비교하여 본 발명에서 개발된 인공 지지체는 배양 시스템으로서 매트리젤 이상의 기능성을 보여주며 보다 안전하고 비용적인 측면에서도 매우 유리한 장점을 가지고 있다. 따라서 이러한 매트리젤 대체 효과만으로도 막대한 경제적 수익 창출이 예측된다.

도 1은 췌장 오가노이드 배양을 위한 탈세포 췌장 조직 유래 지지체(Pancreas Extracellular Matrix; PEM) 제작과정 및 제작된 탈세포 췌장 조직 유래 지지체를 나타낸 것이다.
도 2는 췌장 오가노이드 배양을 위한 탈세포 췌장 조직 유래 지지체 (PEM) 분석결과를 나타낸 것이다.
도 3은 탈세포 췌장 조직 유래 지지체(PEM)의 농도에 따른 물성 분석을 나타낸 것이다.
도 4, 5는 탈세포 췌장 조직 유래 지지체(PEM)의 단백체 분석을 나타낸 것이다.
도 6는 탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤 지지체의 PEM 농도에 따른 마우스 췌장 오가노이드 형성 및 분화능 차이 분석을 나타낸 것이다.
도 7은 탈세포 췌장 조직 유래 지지체(PEM)와 기존의 배양 지지체(MAT)에서 형성된 췌장 오가노이드의 성장 비교를 나타낸 것이다.
도 8은 탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤 지지체에서 배양된 췌장 오가노이드를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9은 탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤 지지체(PEM)를 이용한 췌장 오가노이드 분화 증진 효과를 검증한 것이다.
도 10는 탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤 지지체(PEM)를 이용한 췌장 오가노이드의 장기배양 가능성을 확인한 것이다.
도 11, 12는 탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤(PEM)의 장기보관 가능성을 검증한 결과이다.
도 13은 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 지지체를 이용한 인간 유도만능줄기세포(Human-induced Pluripotent Stem Cell; hiPSC) 유래 췌장 오가노이드 배양을 나타낸 것이다.
도 14은 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 지지체를 이용하여 배양된 인간 유도만능줄기세포(Human-induced Pluripotent Stem Cell; hiPSC) 유래 췌장 오가노이드를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 지지체를 이용한 인간 유도만능줄기세포(Human-induced Pluripotent Stem Cell; hiPSC) 유래 췌장 오가노이드의 장기배양 가능성을 확인한 것이다.
도 16은 인간 유도만능줄기세포 유래 췌장 오가노이드 배양을 위한 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 지지체의 조직 특이적 효과를 확인한 결과이다.
도 17는 탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤 지지체를 이용한 췌장암 오가노이드 배양결과를 확인한 것이다.
도 18은 탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤 지지체의 이식용 소재로서의 사용 가능성을 확인한 결과이다.
도 19 내지 21은 탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤 지지체를 이용한 췌장 오가노이드 생체 내 이식 결과이다.

본 발명에서는 췌장 조직을 탈세포화 하여 세포 성분은 모두 제거하고 췌장 특이적 세포외기질 성분은 보존된 탈세포 췌장 조직을 제작하고 이를 기반으로 하는 삼차원 하이드로젤을 췌장 오가노이드 배양에 적용하였다.

본 발명에서 개발된 탈세포 췌장 조직 유래 지지체는 항원으로 작용하는 세포가 모두 제거되고 순수 세포외기질 성분으로만 구성되어 있기 때문에 이식 시 조직의 염증 반응 및 면역 거부 반응을 야기하지 않고 생체적합성이 매우 우수하다. 제작이 용이하고 제조 단가가 낮아 매트리젤과 비교했을 때 경제성이 높고 안전한 배양 및 이식 소재로 적용될 수 있다.

실제로 단백질체 분석을 통해 탈세포 췌장 조직 유래 지지체는 췌장 조직 특이적인 다양한 세포외기질 및 인자들을 함유하고 있는 것을 확인하였다. 제작된 탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤 지지체 안에서 줄기세포 유래 췌장 오가노이드가 발생하고 성장할 수 있음을 확인하였고 탈세포 췌장 조직 지지체의 다양한 농도를 시험하여 췌장 오가노이드 배양에 최적화된 하이드로젤 농도 조건을 선별하였다.

개발된 탈세포 췌장 조직 유래 지지체에서 배양된 췌장 오가노이드를 대조군인 매트리젤에서 배양된 오가노이드와 비교하였을 때 분화 능력이 비슷하게 유지되거나 향상된 것을 확인하였다. 이를 통해 탈세포 췌장 조직 유래 지지체가 췌장 오가노이드 배양을 위해 기존 매트리젤을 대체할 수 있음이 검증되었다. 이러한 일련의 결과를 통해 본 발명에서 개발된 지지체에서 배양된 췌장 오가노이드가 기존의 매트릭스(매트리젤)에서 배양된 오가노이드 보다 췌장 조직의 구성 및 기능을 실제와 유사하게 더욱 잘 구현할 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

췌장 오가노이드 배양을 위한 탈세포 췌장 조직 유래 지지체(Pancreas Extracellular Matrix; PEM) 제작 (도 1)

췌장 오가노이드 배양을 위한 배양 지지체를 제작하기 위해 돼지 췌장 조직으로부터 탈세포 지지체(Pancreas Extracellular Matrix; PEM)를 제작하였다. 본 탈세포 공정은 기존에 보고된 방식들과 달리 1 % Triton X-100과 0.1 % ammonium hydroxide를 혼합한 용액만을 사용하여 조직 손상을 최소화함으로써 췌장 조직 내의 다양한 단백질들이 더 많이 보존될 수 있음을 확인하였다. 또한, 췌장 조직을 잘게 자른 후에 탈세포 공정을 거쳤기 때문에 더 효율적이고 완전한 세포 제거가 가능한 장점이 있다.

구체적으로 도 1 (A)에서는 췌장 오가노이드 배양을 위한 탈세포 췌장 조직 유래 지지체의 제작 모식도를 나타낸 것이다.

(B) 돼지 췌장 조직을 잘게 자른 후, Triton X-100 용액과 ammonium hydroxide 용액을 이용한 화학적 처리를 거쳐 조직 내 세포 성분을 모두 제거하고 동결 건조하여 파우더 형태로 수득하였다.

(C) 파우더 형태의 탈세포 췌장 조직 매트릭스(Lyophilized PEM) 10 mg을 4 mg/ml 펩신 용액(펩신 파우더(4 mg)를 0.02 M HCL(1 ml)에 녹인 용액)으로 처리하고 48시간 동안 교반기 240 rpm에서 녹인 뒤 용액화 하였다. 그 후 10X PBS와 1 M NaOH를 이용하여 중성 pH로 맞추고 37℃ 온도 조건에서 30분 동안 젤화(gelation)를 유도하였다. 제작된 삼차원 하이드로젤을 췌장 오가노이드 배양 지지체로서 이용하였다.

췌장 오가노이드 배양을 위한 탈세포 췌장 조직 유래 지지체(PEM) 분석(도 2)

(A) H&E 염색을 실시하여 제작한 탈세포 췌장 조직 지지체 내에 세포 성분은 모두 제거된 것을 확인하였고, Masson's Trichrome 염색을 실시하여 탈세포 과정을 거친 후에도 Collagen 성분이 잘 보존되어 유지되는 것을 확인하였다. 추가적으로, Alcian blue 염색을 통해서 Glycosaminoglycan이 탈세포 췌장 조직 유래 지지체에 잘 보존되어 있는 것을 확인하였다.

(B) 탈세포 후 췌장 조직 내에 Fibronectin, Laminin과 같은 ECM 단백질들이 잘 유지되는지 확인하기 위해 면역염색을 실시하였다. 그 결과 탈세포 췌장 조직 매트릭스에서 Fibronectin, Laminin과 같은 ECM 단백질들이 잘 보존되어 있음을 확인하였다.

(C) 주사전자현미경(Scanning electron microscopy; SEM) 분석을 통해 탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤 지지체가 나노섬유 다발 형태의 다공성 내부 구조를 가지고 있음을 확인하였으며 따라서 췌장 오가노이드의 배양에 적합한 삼차원 미세환경을 제공해 줄 수 있음을 확인하였다.

(D) 탈세포 과정 전후 DNA 정량 비교를 통해 탈세포 과정에 의해 세포성분이 대부분 제거됨을 정량적으로 확인하였다. 또한, 대표적인 세포외기질 성분 중 하나인 Glycosaminoglycan (GAG)에 대한 정량 분석을 통해 탈세포 췌장 조직 내에 GAG가 잘 보존되어 남아있는 것을 확인하였다. 탈세포 후에 Collagen의 양을 정량했을 때에도 탈세포 조직 매트릭스 내에서 유지가 잘 되고 있음을 확인하였다.

탈세포 췌장 조직 유래 지지체(PEM)의 농도에 따른 물성 분석(도 3)

PEM 지지체의 농도 별 물성 차이를 알아보기 위해 4가지 농도조건(2, 4, 6, 8 mg/ml)에서 PEM 하이드로젤 형성을 유도한 후 유변학 분석을 통해 기계적 물성을 측정하였다. 모든 농도 조건에서 storage modulus(G′) 값이 loss modulus(G″) 값 보다 일관되게 높음을 확인함으로써 하이드로젤 내 가교를 통해 안정적인 고분자 네트워크가 형성됨을 확인하였다. PEM 농도가 증가할수록 물성도 커지는 것을 확인하였고 대조군 매트리젤(MAT) 그룹에 비해서는 전체적으로 물성이 낮은 것을 확인하였다.

탈세포 췌장 조직 유래 지지체(PEM)의 단백체 분석 (1) (도 4)

(A) 탈세포 췌장 조직 유래 지지체 PEM의 구성 성분들을 파악하기 위해 단백체 분석(Proteomics)을 실시하여 췌장 조직 특이적인 다양한 세포외기질 (Collagens, glycoproteins, proteoglycans 등) 및 성장인자 단백질들이 PEM에 포함되어 있는 것을 확인하였다. 그 결과 PEM을 구성하는 ECM 성분들 중에서는 Collagens와 Proteoglycans가 대부분이고 ECM regulators와 Glycoproteins 순으로 구성되어 있음을 확인하였다.

(B) 탈세포 췌장 조직 유래 지지체 PEM을 기존 상용화된 지지체인 매트리젤과 비교한 결과, 매트리젤은 Glycoproteins이 대부분인 반면, PEM은 Collagens, Proteoglycans, Glycoproteins 등의 다양한 성분으로 구성되어 있음을 확인하였다.

(C) 매트리젤과 PEM의 단백질 발현 차이를 살펴보기 위해 히트맵 (heatmap)과 volcano plot으로 비교해 보았을 때, 히트맵을 통한 전체 단백질의 발현량 분포가 두 지지체 간에 큰 차이를 나타내는 것을 확인했고, volcano plot을 통해 각각의 지지체에서 유의미하게 더 많이 발현되는 단백질을 확인했을 때에도 서로 상이한 발현 패턴을 보이는 것을 확인하였다.

이를 통해 탈세포 췌장 조직 유래 지지체 PEM은 기존 상용화된 오가노이드 배양 지지체인 매트리젤과 비교하여 상이한 세포외기질 단백질 성분으로 구성되어 있으며 생체 내 췌장 조직의 미세환경을 보다 더 잘 구현할 수 있을 것으로 예측된다.

탈세포 췌장 조직 유래 지지체(PEM)의 단백체 분석 (2) (도 5)

(A) 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 지지체에 포함된 Top 10 ECM 성분을 확인했을 때, 가장 많은 비율을 차지하는 COL6A1, COL6A2는 췌장 랑게르한스섬의 주요 구성 성분이자 랑게르한스섬 세포의 생존에 필수적인 성분이며 Biglycan (BGN), Lumican (LUM), Asporin (ASPN)은 췌장의 발달과 구조형성에 중요한 ECM 단백질임을 확인하였다. 이를 통해 제작된 탈세포 췌장 조직 유래 세포외기질(PEM) 지지체가 췌장 구조, 기능 등에 있어 중요한 역할을 담당하는 실제 췌장 조직에 존재하는 다양한 세포외기질 단백질들을 포함하고 있음을 확인하였다.

(B) 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 지지체에 포함된 Top 10 ECM 성분의 기능을 알아보기 위해 유전자 온톨로지(Gene Ontology) 분석을 진행했을 때, 이러한 성분들이 췌장염 및 췌장암 대사조절에 중요한 Sulfur amino acid (SAA) 황 아미노산 대사와 췌장 줄기세포의 자가재생에 필수적인 Glutathione 대사 관련된 기능을 포함하여 췌장의 기능 및 분화발달에 중요한 역할을 담당하는 것을 확인하였다.

(C) 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 성분 전체에 대한 유전자 온톨로지 (Gene Ontology) 분석을 진행했을 때에도 Top 10 ECM 성분의 유전자 온톨로지와 비슷하게 immune system process나 그 외 췌장의 기능 및 분화 발달과 관련된 carbohydrate metabolic process, NAD/NADH metabolic process 등의 역할을 주로 담당하는 것을 확인하였다.

따라서 탈세포 공정을 거쳐 제작된 PEM 하이드로젤 지지체를 이용하면 효율적인 췌장 오가노이드 배양이 가능할 것으로 생각된다.

탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤 지지체의 PEM 농도에 따른 마우스 췌장 오가노이드 형성 및 분화능 차이 분석(도 6)

탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 지지체를 농도별로 제작하여 마우스 췌장 오가노이드 배양에 적용하고, 각 농도 조건에서 7일간 배양된 오가노이드의 췌장 분화 관련 유전자 발현을 정량적 PCR(qPCR) 방법으로 비교 분석하였다. 상용화된 배양 지지체인 매트리젤(MAT)을 대조군으로 이용하였다.

(A) 췌장 오가노이드 배양을 위해 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤을 다양한 PEM 농도 조건으로 적용했을 때 모든 농도 조건(2, 4, 6, 8 mg/ml)에서 대조군인 매트리젤(MAT)에서와 유사한 형태의 췌장 오가노이드가 잘 형성되는 것을 확인하였다.

(B) 배양 7일차에 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 지지체의 농도에 따른 췌장 오가노이드 형성 효율을 비교했을 때 2 mg/ml 및 4 mg/ml 조건에서 가장 형성 효율이 높음을 확인하였다.

(C) PEM 농도 조건 별로 유전자 발현을 비교하였을 때, 줄기세포능(stemness)과 관련된 유전자(Lgr5)는 PEM 하이드로젤에서 배양된 췌장 오가노이드에서 비슷하거나 약간씩 감소하지만 췌장 분화 관련 마커(Krt19, Pdx1)들은 발현이 증가하는 경향을 보였다. PEM 농도 조건 중에서 4 mg/ml 농도의 PEM 하이드로젤이 매트리젤과 췌장 오가노이드 형성 효율이 크게 차이가 나지 않고, 췌장 분화 마커의 발현은 더 증가하는 것을 고려하여 PEM 하이드로젤 농도는 4 mg/ml PEM 조건으로 결정하여 이후에 췌장 오가노이드 배양에 적용하였다.

탈세포 췌장 조직 유래 지지체(PEM)와 기존의 배양 지지체(MAT)에서 형성된 췌장 오가노이드의 성장 비교 (도 7)

오가노이드 배양에 가장 널리 이용되는 매트리젤과 최적화된 4 mg/ml 농도 조건의 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 지지체에서 배양되는 마우스 췌관세포 유래 췌장 오가노이드의 성장속도를 비교하였다. 각 지지체에서 형성된 췌장 오가노이드가 췌관에서 형성이 시작되어 점점 크기가 커지면서 잘 배양되는 것이 확인된다. PEM 하이드로젤에서 배양되는 췌장 오가노이드가 매트리젤에서 배양되는 오가노이드와 비슷한 형태와 성장 속도를 보이면서 자라는 것을 확인하였다.

탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤 지지체에서 배양된 췌장 오가노이드 분석(도 8)

오가노이드 배양에 가장 널리 이용되는 매트리젤과 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 (4 mg/ml) 지지체에서 배양된 췌장 오가노이드의 면역염색을 진행하였다. 췌장 오가노이드는 쥐의 췌장 조직에서 추출한 췌관세포를 이용하여 제작하였고 배양 7일차에 면역염색을 통해 비교하였다.

췌장 특이적 마커에 대한 면역염색을 통해 대조군 매트리젤(Matrigel)에서 배양된 췌장 오가노이드와 비교하여 보았을 때, 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 지지체에서 배양된 췌장 오가노이드 에서도 매트리젤 그룹과 유사한 수준으로 췌장 조직 특이적 마커들이 잘 발현되는 것을 확인하였다; KRT19 (pancreatic duct marker), SOX9 (pancreatic duct progenitor marker), PDX1 (pancreatic endoderm marker).

세포 증식 마커인 Ki67 (proliferative cell marker) 발현도 두 지지체 (PEM, 매트리젤) 그룹에서 유사한 수준으로 관찰되었다.

탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤 지지체(PEM)를 이용한 췌장 오가노이드 분화 증진 효과 검증(도 9)

기존의 배양 지지체인 Matrigel을 대체하면서 췌장 특이적인 미세환경을 통해 오가노이드 분화를 증진시킬 수 있는 조직 특이적 기능성을 확인하기 위해 탈세포 췌장 조직 유래 세포외기질(PEM) 하이드로젤과 다른 장기(간) 조직 유래 세포외기질(LEM) 하이드로젤에서 배양된 췌장 오가노이드의 분화능을 비교하였다. Matrigel 그룹은 대조군으로 이용하였다.

(A) 탈세포 췌장 조직 유래 지지체의 분화 증진 효과를 확인하기 위해 PEM그룹 외에 LEM 그룹에서도 췌장 오가노이드를 배양하였다. 모든 배양 지지체에서 정상적인 모양으로 오가노이드가 잘 형성되는 것을 확인하였다.

(B) qPCR 분석을 통해 줄기세포능(Stemness) 또는 췌장 분화(Differentiation)와 관련된 마커에 대한 유전자 발현을 정량 비교해 보았을 때, 줄기세포능 관련 유전자 발현은 비슷하거나 약간 증가하는 반면 췌장 분화 마커(Krt19, Pdx1)의 발현은 췌장 조직 특이적인 PEM 그룹에서 가장 유의미하게 증가한 것을 확인하였다.

탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤 지지체(PEM)를 이용한 췌장 오가노이드의 장기배양 가능성 확인(도 10)

앞서 확립한 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 지지체 내에서 췌장 오가노이드 장기 배양을 시도하고 췌장 특이적 분화 마커의 발현을 분석하였다. 매트리젤(MAT) 그룹은 대조군으로 이용하였다.

(A) PEM 하이드로젤 내에서 계대 배양을 지속하면서 1달 이상 배양했을 때에도(passage 5) 췌장 오가노이드가 잘 자라며, 매트리젤에서 배양된 췌장 오가노이드와 모양 및 크기가 유사한 수준으로 배양되는 것을 확인하였다.

(B) 췌장 오가노이드 배양 10일차(P1)와 30일차(P5)에 줄기세포 마커 및 췌장 분화 마커의 유전자 발현을 비교해 보았을 때, 매트리젤에서 배양된 오가노이드와 비교하여 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 지지체에서 배양된 췌장 오가노이드에서 줄기세포능(Stemness) 유전자 발현은 비슷하게 유지되고 췌장 분화 마커 발현은 증가하는 것을 확인하였다. PEM 하이드로젤에서 30일 동안 장기 배양된 췌장 오가노이드에서 분화 마커의 발현이 매트리젤 그룹 보다 계속 높게 유지가 된 것을 통해 PEM 하이드로젤을 이용한 췌장 오가노이드의 장기 배양 가능성을 확인할 수 있었다.

탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤(PEM)의 장기보관 가능성 검증 (1) (도 11)

탈세포 췌장 조직 유래 PEM 용액을 -80 ℃ 냉동 및 4 ℃ 냉장 조건에서 장기간 보관한 뒤, 이를 해동하여 췌장 오가노이드 배양을 위해 이용함. 대조군으로는 매트리젤을 이용하였고 배양 7일차에 광학현미경 이미지 및 형성효율을 비교하였다.

(A) 대조군 매트리젤과 오가노이드 배양 직전에 새롭게 제조한 PEM 하이드로젤, -80℃ 냉동 및 4℃ 냉장 조건에서 장기간 보관한 PEM 하이드로젤을 이용하여 췌장 오가노이드를 배양했을 때, 모든 매트릭스 그룹에서 오가노이드가 잘 형성되는 것을 확인하였다.

(B) 배양 7일차에 췌장 오가노이드 형성 효율을 비교했을 때, 췌장 오가노이드 배양 직전에 새롭게 제작한 PEM 하이드로젤과 유사한 수준으로 2달 또는 4달 동안 냉동 및 냉장 보관된 PEM 용액으로 제작한 하이드로젤에서도 췌장 오가노이드 형성이 잘 되며, 형성효율에 있어 큰 차이가 없음을 확인하였다.

탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤(PEM)의 장기보관 가능성 검증 (2) (도 12)

탈세포 췌장 조직 유래 PEM 용액을 -80℃ 냉동 및 4℃ 냉장 조건에서 장기간 보관한 뒤, 이를 해동하여 췌장 오가노이드 배양에 이용하였다. 대조군으로는 매트리젤을 이용하였고 배양 7일차에 췌장 마커에 대한 유전자 발현량을 정량적 PCR 분석을 통해 비교하였다.

(A) 매트리젤 (MAT), 배양 직전에 새롭게 제작한 PEM 하이드로젤, 2달 또는 4달 동안 냉동 및 냉장 보관된 PEM 용액으로 제작한 하이드로젤에서 배양된 췌장 오가노이드의 췌장 마커 유전자 발현량을 비교했을 때, 췌장 분화 마커(Hnf1β, Pdx1, Krt19) 모두 매트리젤 그룹에 비해서 PEM 하이드로젤 그룹에서 증가하며 보관 조건과는 관계없이 큰 차이가 없음을 확인하였다.

(B) 배양 직전에 새롭게 제작한 PEM 하이드로젤과 장기 보관된 PEM 하이드로젤의 물성 차이를 측정하기 위해 유변학 분석을 진행했을 때, PEM 용액을 냉장 및 냉동조건에서 장기보관 후 하이드로젤을 제작해도 물성에 큰 변화없이 30~40 Pa 값을 일정하게 유지함을 확인하였다. 이를 통해 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤이 장기간 보관되어도 변성 없이 안정적으로 유지되어 췌장 오가노이드 배양에 사용 가능한 것을 확인하였다.

탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 지지체를 이용한 인간 유도만능줄기세포(Human-induced Pluripotent Stem Cell; hiPSC) 유래 췌장 오가노이드 배양(도 13)

인간 유도만능줄기세포로부터 췌장 오가노이드 형성을 위해 내배엽 (Definitive Endoderm, DE), 췌장 내배엽 (Pancreatic Endoderm, PE)을 거쳐 췌장 전구세포 (Pancreatic Progenitor, PP)로 분화시킨 뒤, PEM 하이드로젤 내에 봉입(encapsulation)하여 3D 배양하였다. 매트리젤(MAT) 그룹은 대조군으로 이용하였다.

(A) 인간 유도만능줄기세포 유래 췌장 전구세포를 PEM (4 mg/ml) 하이드로젤과 MAT 내에서 배양했을 때, 두 그룹 모두 2일 이내에 3D 오가노이드가 형성되는 것을 확인하였다.

(B) 두 그룹에서 10일간 배양된 췌장 오가노이드의 유전자 발현을 정량적 PCR (qPCR) 방법으로 비교해 보았을 때, 전분화능(Pluripotency) 마커인 OCT4 발현은 PEM 그룹에서 약간 감소하고 췌장 분화 관련 마커들(FOXA2, SOX9, KRT19, PDX1)의 발현은 PEM 그룹에서 유의미하게 증가하는 것을 확인하였다; OCT4(Pluripotency marker), FOXA2(Pancreatic β-cell differentiation marker), SOX9(Pancreatic duct progenitor marker), KRT19(Pancreatic duct marker), PDX1(Pancreatic endoderm marker). 이는 PEM 하이드로젤을 이용하여 췌장 오가노이드를 배양하면 매트리젤을 이용한 배양과 비교해서 오가노이드의 췌장 분화 및 성숙도를 증진시킬 수 있음을 보여주는 결과이다.

탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 지지체를 이용하여 배양된 인간 유도만능줄기세포(Human-induced Pluripotent Stem Cell; hiPSC) 유래 췌장 오가노이드 분석(도 14)

매트리젤(MAT)과 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 (4 mg/ml) 지지체에서 배양된 췌장 오가노이드의 면역염색을 진행하였다. 췌장 오가노이드는 인간 유도만능줄기세포에서 분화된 췌장 전구세포로부터 제작하였고, 오가노이드 형성 이후 7일차에 면역염색을 통해 비교하였다.

췌장 특이적 마커에 대한 면역염색을 통해 대조군 매트리젤(MAT)에서 배양된 췌장 오가노이드와 비교하여 보았을 때, 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 지지체에서 배양된 췌장 오가노이드에서도 매트리젤 그룹과 유사한 수준으로 췌장 조직 특이적 마커들이 잘 발현되는 것을 확인하였다; KRT19 (pancreatic duct marker), SOX9 (pancreatic duct progenitor marker), PDX1 (pancreatic endoderm marker), NKX6.1 (pancreatic β-cell differentiation marker)

세포 증식 마커인 Ki67 (proliferative cell marker) 발현도 두 지지체 (PEM, 매트리젤) 그룹에서 유사한 수준으로 관찰되었다.

탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 지지체를 이용한 인간 유도만능줄기세포(Human-induced Pluripotent Stem Cell; hiPSC) 유래 췌장 오가노이드의 장기배양 가능성 확인(도 15)

앞서 확립한 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 지지체 내에서 췌장 오가노이드 장기 배양을 시도하고 췌장 특이적 분화 마커의 발현을 분석하였다. 매트리젤(MAT)그룹은 대조군으로 이용하였다.

(A) PEM 하이드로젤 내에서 계대 배양을 지속하면서 25일 이상 배양했을 때에도 췌장 오가노이드가 잘 자라며, 매트리젤에서 배양된 췌장 오가노이드와 모양 및 크기가 유사한 수준으로 배양되는 것을 확인하였다.

(B) 췌장 오가노이드를 25일 이상 장기배양 하였을 때에도 매트리젤 기반 오가노이드 보다 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 지지체에서 배양된 췌장 오가노이드에서 췌장 분화 마커 발현이 증가하는 것을 확인하였고 장기간 배양할수록 PEM 하이드로젤에서는 췌장 오가노이드 분화가 더욱 증진되는 것을 확인하였다.

인간 유도만능줄기세포 유래 췌장 오가노이드 배양을 위한 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 지지체의 조직 특이적 효과 확인 (도 16)

탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 지지체에 포함된 췌장 특이적 세포외기질 성분들이 췌장 오가노이드 배양에 있어 조직 특이적 효과를 보여주는지 확인하기 위해 다른 장기 유래 탈세포 지지체에서도 췌장 오가노이드를 배양하고 비교하는 실험을 진행하였다. 각 조직 유래 탈세포 지지체에서 췌장 오가노이드를 5일 간 배양한 후 유전자 발현량을 비교하였다.

(A) 심장, 위, 장, 근육, 췌장 유래 탈세포 하이드로젤을 이용하여 배양을 시도한 결과, 심장 조직 유래 하이드로젤에서는 췌장 오가노이드가 발생하지 못하였고 그 외 조직 유래 탈세포 하이드로젤에서는 오가노이드가 형성된 것을 확인하였다.

(B) 각 장기 유래 탈세포 지지체에서 5일동안 배양한 뒤, 췌장 오가노이드 분화 관련 유전자 발현량을 정량적 PCR 분석을 통해 비교하였다. 췌관세포 분화와 관련된 SOX9, KRT19, 췌장 내배엽 분화와 관련된 PDX1, 췌장 전구세포 발달과 관련된 NKX6.1 마커를 분석했을 때 탈세포 췌장 조직 유래 지지체에서 배양된 오가노이드에서 가장 높은 수준으로 발현되는 것을 확인하였다. 이를 통해 췌장 오가노이드 배양에 있어 췌장 조직 유래 탈세포 지지체가 가지는 조직 특이적인 효과를 확인할 수 있었다.

탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤 지지체를 이용한 췌장암 오가노이드 배양 (도 17)

탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 지지체를 이용하여 췌장암 오가노이드의 배양 가능성을 확인하였다. 인간 유래 PANC-1 췌장암 세포주를 PEM 하이드로젤에서 삼차원 배양했을 때 암 오가노이드가 형성됨을 확인하였다 (배양 5일차 오가노이드 이미지 및 면역염색 분석).

광학 현미경 이미지 분석을 통해 매트리젤과 PEM 하이드로젤 내에서 모두 췌장암 오가노이드가 잘 형성된 것을 확인하였고, 면역염색을 통해 외분비 췌장암에서 과발현 되는 KRT13, KRT19 단백질을 모두 검출함으로써 췌장암 오가노이드 내 세포들의 증식이 활발히 일어나고 췌장암 관련 마커들이 잘 발현되고 있는 것을 확인하였다.

본 실험을 통해 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 지지체는 줄기세포 유래의 췌장 오가노이드 뿐 아니라 췌장암 오가노이드의 배양도 가능함을 확인하여 PEM 하이드로젤이 췌장암 체외 모델 구축을 위한 배양 플랫폼의 요소 기술로 활용될 수 있는 가능성을 확인하였다.

탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤 지지체의 이식용 소재로서의 사용 가능성 확인 (도 18)

탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 지지체 이식 시 면역반응의 유발 여부를 확인하기 위해 마우스의 피하에 PEM 하이드로젤을 이식하고 일주일간 면역반응 및 염증반응 여부를 확인하였다.

H&E 염색을 통해 정상 조직과 비교했을 때, PEM 하이드로젤이 이식된 부위와 진피(dermis) 모두에서 염증반응 및 면역세포의 침윤(infiltration)이 일어나지 않은 것을 확인하였고, 이식 시 침투한 mast cell을 염색하는 Toluidine blue 염색을 통해서도 일주일 동안 침투한 mast cell이 염색되지 않은 것을 통해 탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤이 이식 시에 면역반응을 유발하지 않으며 따라서 오가노이드 이식용 소재로서 사용 가능함을 확인하였다.

탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤 지지체를 이용한 췌장 오가노이드 생체 내 이식 (1) (도 19)

탈세포 췌장 조직 유래 PEM 하이드로젤 지지체를 췌장 오가노이드 이식용 소재로서 활용하기 위한 동물 실험을 수행하고 조직학 분석을 진행하였다. 췌장 오가노이드를 마우스 급성 췌장염 모델의 손상된 췌장 조직 내에 효율적으로 전달하고 생착시키기 위해 4 mg/ml의 PEM 하이드로젤을 이용하여 1000~1200개의 췌장 오가노이드를 이식하였다. 이식 시 주사가 용이한 하이드로젤 점도를 맞추고 오가노이드의 효율적인 생착을 위해 PEM 하이드로젤 50 μl에 오가노이드를 같이 혼합하여 이식하였다.

(A) 복강주사를 통해 1시간마다 40 μg/kg의 cerulein을 5번 투입하여 급성 췌장염 마우스 모델을 제작하고 H&E 염색을 통해 유발정도를 확인하였다. PBS를 주입한 그룹에 비해 cerulein 주입을 통해 췌장염을 유발한 조직에서 세포질의 공포화(vacuolization), 면역세포의 침습이 일어나면서 췌장염의 특징을 나타내는 것을 확인하였다.

(B) 마우스 급성 췌장염 모델에 췌장 오가노이드를 탈세포 PEM 하이드로젤 지지체를 이용하여 이식하고, 생착 및 조직 재생여부를 이식 1주차와 2주차에 H&E 염색을 통해 관찰하였다. 췌장 조직 표면에 이식된 오가노이드가 잘 생착되어 있고, 이식된 오가노이드의 성장으로 인해 1주차 보다 2주차에 이식된 면적이 커지고 기존 조직과의 통합이 더욱 잘 일어난 것을 확인하였다.

탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤 지지체를 이용한 췌장 오가노이드 생체 내 이식 (2) (도 20)

마우스 급성 췌장염 모델에 DiI 형광시약으로 표지된 췌장 오가노이드를 탈세포 PEM 하이드로젤 지지체를 이용하여 이식하고, 생착 여부를 이식 일주일 뒤에 형광 발현을 통해 관찰하였다. 손상된 췌장 조직 부위에 이식한 췌장 오가노이드는 일주일 동안 잘 생착되어 존재하는 것을 확인하였다. 또한, 췌관(pancreatic duct) 세포 마커인 KRT19을 동시에 염색했을 때, 췌관의 특징을 가진 췌장 오가노이드가 주변 췌장조직의 췌관부와 함께 KRT19 마커를 잘 발현하고 있는 것을 확인하였다. 이식되지 않은 조직에서는 DiI 형광이 관찰되지 않았다.

이러한 결과는 PEM 하이드로젤이 췌장 오가노이드 배양뿐 아니라 생체 내 이식용 소재로서도 적용이 가능함을 알 수 있다.

탈세포 췌장 조직 유래 하이드로젤 지지체를 이용한 췌장 오가노이드 생체 내 이식 (3) (도 21)

마우스 급성 췌장염 모델에 DiI 형광시약으로 표지된 췌장 오가노이드를 탈세포 PEM 하이드로젤 지지체를 이용하여 이식하고, 생착 여부를 이식 2주일 뒤에 형광 발현을 통해 관찰하였다. 손상된 췌장 조직 부위에 이식한 췌장 오가노이드는 2주일 동안 잘 생착되어 존재하는 것을 확인하였다. 또한, 췌관(pancreatic duct)세포 마커인 KRT19을 동시에 염색했을 때, 췌관의 특징을 가진 췌장 오가노이드가 주변 췌장조직의 췌관부와 함께 KRT19 마커를 잘 발현하고 있는 것을 확인하였다. 이식되지 않은 조직에서는 DiI 형광이 관찰되지 않았다.

이러한 결과는 PEM 하이드로젤이 췌장 오가노이드 배양뿐 아니라 생체 내 이식용 소재로서도 적용이 가능함을 보여준다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (8)

1. 췌장 조직 유래 세포외기질(Pancreas Extracellular Matrix; PEM)을 포함하는 췌장 오가노이드 배양 및 이식용 지지체.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 췌장 조직 유래 세포외기질은 췌장 조직에 Triton X-100 및 수산화암모늄을 혼합한 용액을 처리하여 탈세포된 것인, 지지체.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 지지체 내 상기 췌장 조직 유래 세포외기질의 농도는 1 mg/ml 내지 10 mg/ml인, 지지체.
   
4. 1) 분리된 췌장 조직을 파쇄하는 단계; 및
   2) 상기 파쇄된 췌장 조직에 Triton X-100 및 수산화 암모늄을 처리하여 탈세포하여 탈세포된 췌장 조직 유래 세포외기질 (PEM)을 제조하는 단계
   를 포함하는 췌장 오가노이드 배양 및 이식용 지지체 제조방법.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 2) 단계 이후 3) 상기 탈세포 췌장 조직 유래 세포외기질 (PEM)을 동결건조 하여 동결건조 췌장 조직 유래 세포외기질을 제조하는 단계를 더 포함하는 췌장 오가노이드 배양 및 이식용 지지체 제조방법.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 3) 단계 이후 4) 상기 동결건조 췌장 조직 유래 세포외기질을 하이드로젤 형태의 췌장 오가노이드 배양 및 이식용 지지체로 형성하는 단계를 더 포함하는 췌장 오가노이드 배양 및 이식용 지지체 제조방법.
   
7. 제 6항에 있어서,
   상기 4) 단계는 상기 동결건조 췌장 조직 유래 세포외기질을 펩신 용액에 용해시켜 용액화 한 뒤 pH를 조정하여 하이드로젤화 하는 것인 췌장 오가노이드 배양 및 이식용 지지체 제조방법.
   
8. 제1항의 지지체 또는 제4항의 제조방법에 의해 제조된 지지체에서 췌장 오가노이드를 배양하는 방법.
   
   

Images