KR102345330B1 - 탈세포화된 뇌조직 매트릭스 기반 뇌 오가노이드 배양용 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뇌 오가노이드 배양용 조성물 제조방법에 관한 것으로, (a) 뇌조직을 탈세포화하는 단계; (b) 상기 뇌조직을 건조하는 단계; 및 (c) 상기 뇌조직을 겔화(gelation)하는 단계;를 포함하는 제조방법을 제공한다.

Description

탈세포화된 뇌조직 매트릭스 기반 뇌 오가노이드 배양용 조성물 및 이의 제조방법{A COMPOSITION FOR CULTURING BRAIN ORGANOID BASED ON DECELLULARIZED BRAIN MATRIX AND THE METHOD FOR PREPARING THEREOF}

본 발명은 탈세포화된 뇌조직 매트릭스를 이용한 뇌 오가노이드 배양용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

조직 및 기관의 탈세포화는 세포 배양 및 이식을 위한 기능성 지지체 또는 스캐폴드(scaffold)를 제조하기 위한 유망한 방안으로써 연구되고 있다.

탈세포화 과정에서, 조직으로부터 세포 성분들이 제거되지만, 세포외기질 및 일부 성장인자 단백질들은 보존된다.

따라서, 탈세포화 조직 내 보존된 콜라겐, 파이브로넥틴(fibronectin) 및 라미닌(laminin)을 포함하는 다양한 세포외기질 성분들은 온전한 조직 내와 유사한 삼차원적인 미세환경을 제공함으로써 배양된 세포의 생존, 증식 및 분화를 향상시킬 수 있다.

추가적으로, 세포 성분의 제거는 탈세포화 매트릭스를 세포 이식에 대한 최소한의 면역원성을 가진 기능성 지지체로 변화시킨다.

최근 뇌, 심장, 혈관, 심장판막, 폐, 및 신장에서 유래된 여러 가지 형태의 탈세포화 기관을 응용한 기능성 조직공학 지지체에 대한 연구가 진행되고 있다.

특히, 뇌는 생물체를 조절하는 주요 관제탑 역할을 하는 장기로서 신경세포들과 그 외 여러 세포들 간의 긴밀한 네트워크를 통해 기능을 하는 중요한 기관이지만 복잡한 구조 및 작동원리로 인해 충분한 연구가 진행되지 못하고 있으며, 뇌신경 질환의 발병원인 및 신약 개발 연구에 있어 한계에 직면하고 있다.

따라서, 뇌 조직 및 기능을 구현하는 체외모델 시스템 구축을 통한 활발한 뇌신경 연구의 필요성이 점차 대두되고 있으며, 인간 줄기세포 유래의 오가노이드를 이용하여 미니 장기들을 제작하는 새로운 연구가 각광받고 있다.

그럼에도 불구하고, 현재 오가노이드 배양 기술로 제작된 뇌 오가노이드는 분화도 및 기능적인 측면에서 실제 뇌조직과 많은 차이를 가지고 있어 더욱 성숙한 뇌 오가노이드 배양을 위한 요소 기술 개발이 요구되는 실정이다.

한국공개특허 제10-2015-0074672호

본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 현재 배양 기술에 따른 뇌 오가노이드의 미성숙한 구조 발달 및 미성숙한 분화를 개선하고 실제 뇌와 유사한 뇌 오가노이드를 제작을 위한 삼차원 배양 플랫폼을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 뇌조직을 탈세포화하는 단계; (b) 상기 뇌조직을 건조하는 단계; 및 (c) 상기 뇌조직을 겔화(gelation)하는 단계;를 포함하는 뇌 오가노이드 배양용 조성물 제조방법이 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 (c) 단계에서 상기 뇌조직 및 매트리겔(matrigel)을 혼합하여 하이드로겔을 수득할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 하이드로겔은 뇌조직 유래 세포외기질(decellularized brain extracellular matrix; dBEM)을 0.01 내지 2.0 mg/mL 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 뇌조직을 탈세포화 용액에서 교반시킬 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 뇌조직을 3 내지 24시간 동안 교반시킬 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 탈세포화에 의해 상기 뇌조직 세포가 95% 이상 제거될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 탈세포 뇌조직 유래 세포외기질(decellularized brain extracellular matrix; dBEM)을 포함하는 뇌 오가노이드 배양용 하이드로겔 조성물이 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 매트리겔(matrigel)을 더 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 뇌조직 유래 세포외기질(dBEM)의 농도는 0.01 내지 2.0 mg/mL일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물의 1Hz 기준 탄성계수가 100 내지 150Pa일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 조성물에서 뇌 오가노이드를 배양하는 방법이 제공된다.

본 발명은 종래 뇌 오가노이드 배양 기술과 달리 실제 뇌조직을 구현하는 체외 모델로서의 적용 가능성이 높다.

본 발명의 뇌조직 매트릭스 기반 하이드로겔은 뇌 오가노이드의 신경세포 분화 및 피질층 신경세포로의 분화를 촉진할 수 있으며 유사 뇌조직 형태의 체외 모델 구축에 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 탈세포 뇌조직 기반 삼차원 하이드로겔을 이용한 뇌 오가노이드 제작 방법을 도식화한 것이다.
도 2는 인간 탈세포화 뇌조직을 제작하고 분석한 결과이다.
도 3은 탈세포 뇌조직의 성분을 분석한 결과이다.
도 4는 탈세포 뇌조직 기반 하이드로겔의 기계적 물성을 분석한 결과이다.
도 5는 탈세포 뇌조직 기반 하이드로겔의 조직 특이적인 효과를 분석한 결과이다.
도 6은 탈세포 뇌조직 기반 하이드로겔 또는 매트리겔을 이용하여 배양된 뇌 오가노이드의 신경 분화를 비교 분석한 결과이다.
도 7 내지 9는 탈세포 뇌조직 기반 하이드로겔 또는 매트리겔을 이용하여 배양된 뇌 오가노이드의 신경 분화, 구조 성숙 및 발달 정도를 확인한 것이다.
도 10은 탈세포 뇌조직 기반 하이드로겔 또는 매트리겔을 이용하여 배양된 뇌 오가노이드의 기능성을 비교 분석한 결과이다.
도 11은 탈세포 뇌조직 기반 하이드로겔 또는 매트리겔을 이용하여 배양된 뇌 오가노이드의 분화 및 세포간 네트워크를 비교 분석한 결과이다.
도 12는 탈세포 뇌조직 기반 하이드로겔 또는 매트리겔을 이용하여 배양된 뇌 오가노이드의 피질층 발달을 비교 분석한 결과이다.
도 13은 탈세포 뇌조직 기반 하이드로겔 또는 매트리겔을 이용하여 배양된 뇌 오가노이드의 피질층 및 전뇌 발달을 비교 분석한 결과이다.
도 14는 탈세포 뇌조직 기반 하이드로겔을 이용하여 배양된 뇌 오가노이드의 유전자 발현을 qPCR 분석한 결과이다.
도 15 내지 17은 탈세포 뇌조직 기반 하이드로겔을 이용하여 배양된 뇌 오가노이드의 유전자 발현을 gene ontology(GO) 분석한 결과이다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.

본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 뇌조직을 탈세포화하는 단계; (b) 상기 뇌조직을 건조하는 단계; 및 (c) 상기 뇌조직을 겔화(gelation)하는 단계;를 포함하는 뇌 오가노이드 배양용 조성물 제조방법이 제공된다.

상기 조성물은 탈세포화하여 수득한 뇌조직 매트릭스 조성물을 기반으로 제조한 3차원 배양 하이드로겔을 포함하며, 뇌 오가노이드 배양에 효과적으로 활용될 수 있다.

상기 탈세포화된 뇌조직은 실제 조직 특이적 세포외기질 성분을 포함하므로 해당 조직의 물리적, 기계적, 생화학적 환경을 제공할 수 있으며, 뇌조직 세포로의 분화 및 조직 특이적 기능성을 증진시키는데 매우 효율적이다.

상기 “오가노이드(organoid)”는 조직 또는 전분화능줄기세포에서 유래된 세포를 3D 형태로 배양하여 인공장기와 같은 형태로 제작한 초소형 생체기관을 의미한다.

상기 오가노이드는 줄기세포에서 발생하고 생체 내 상태와 유사한 방식으로 자가-조직화(또는 자가-패턴화)하는 장기 특이적 세포를 포함한 삼차원 조직 유사체로서 제한된 요소(Ex. growth factor) 패터닝에 의해 특정 조직으로 발달할 수 있다.

상기 오가노이드는 세포의 본래 생리학적 특성을 가지며, 세포 혼합물(한정된 세포 유형뿐만 아니라 잔존 줄기세포, 근접 생리학적 니치(physiological niche)를 모두 포함) 원래의 상태를 모방하는 해부학적 구조를 가질 수 있다. 상기 오가노이드는 3차원 배양 방법을 통해 세포와 세포의 기능이 더욱 잘 배열되고, 기능성을 가지는 기관 같은 형태와 조직 특이적 기능을 가질 수 있다.

상기 (b) 단계에서 세포외기질을 포함하는 탈세포 뇌조직은 공기 건조 또는 동결 건조될 수 있다. 상기 탈세포 뇌조직은 건조 후 전자 빔 또는 감마 방사선에 의해 에틸렌 옥사이드 가스 또는 초임계 이산화탄소에 노출되어 최종 멸균될 수 있다. 상기 탈세포 뇌조직은 동결 건조된 상태로 저장되고, 포장되거나 분산될 수 있다.

상기 멸균된 탈세포 뇌조직은 산성 용액에서 펩신 또는 트립신과 같은 단백질 분해 효소로 용액화될 수 있고, 중화를 위해 예컨대 등장성 완충액(isotonic buffer) 또는 NaOH 등의 염기와 혼합하여 pH 7.2 내지 7.8로 조정될 수 있으며, 25 내지 38℃의 온도에서 겔화(gelation)될 수 있다.

상기 (c) 단계에서 상기 뇌조직 및 매트리겔(matrigel)을 혼합하여 하이드로겔을 수득할 수 있다.

상기 “매트리겔(matrigel)”은 EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스의 육종세포에서 추출된 단백질 복합체로서(BD Bioscience社의 제품명), 라미닌(laminin), 콜라겐(collagen), 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)과 같은 세포외 매트릭스와 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF), 상피세포 성장인자(epidermal growth factor; EGF), 인슐린 성장인자(insulin-like growth factor; IGF), 형질전환 성장인자-베타(transforming growth factor-beta; TGF-β또는 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor; PDGF)를 포함할 수 있다.

상기 “하이드로겔”은 졸-겔 상변이를 통해 물을 분산매로 하는 액체가 굳어 유동성을 상실하고 다공성 구조를 이루는 물질로서, 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창함으로써 형성될 수 있다.

상기 하이드로겔은 상기 탈세포화된 뇌조직과 상기 매트리겔을 소정의 비율로 포함할 수 있고, 상기 하이드로겔은 뇌조직 유래 세포외기질(decellularized brain extracellular matrix; dBEM)을 0.01 내지 2.0 mg/mL 포함할 수 있다.

상기 “세포외기질(extracellular matrix)”은 포유류 및 다세포 생물(multicellular organisms)에서 발견된 조직의 탈세포화를 통해 제조된 세포 성장용 자연 지지체를 의미한다. 상기 세포외기질은 투석 또는 가교화를 통해 더 처리할 수 있다.

상기 세포외기질은 콜라겐, 엘라스틴(elastins), 라미닌(laminins), 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycans), 프로테오글리칸, 항균제(antimicrobials), 화학유인물질(chemoattractants), 시토카인(cytokines), 및 성장 인자에 제한되지 않는, 구조형 및 비구조형 생체 분자(biomolecules)의 혼합물일 수 있다.

상기 세포외기질은 포유 동물에 있어서 다양한 형태로서 약 90%의 콜라겐을 포함할 수 있다. 다양한 생체 조직에서 유래한 세포외기질은 각각의 조직에 필요한 고유 역할 때문에 전체 구조체 및 조성이 상이할 수 있으며, 상기 탈세포화된 뇌조직을 적정 비율로 혼합함으로써 뇌조직 유래 세포외기질을 0.01 내지 2.0 mg/mL 포함할 수 있다.

상기 “유래(derive)", "유래된(derived)"은 유용한 방법에 의해 언급한 원천으로부터 수득한 성분을 의미한다.

예컨대, 세포외기질-유래 겔은 세포외기질을 분리하기 위해 기술적으로 알려진 다양한 방법에 의해 조직으로부터 수득한 세포외기질 성분을 포함하는 겔을 의미한다. 또는, 상기 뇌조직-유래 세포외기질은 유용한 방법에 의해 뇌조직에서 수득한 성분을 포함하는 세포외기질을 의미할 수 있다.

상기 (a) 단계에서 상기 뇌조직을 탈세포화 용액에서 교반시킬 수 있다.

일 실시예에서, 상기 뇌조직을 3 내지 24시간 동안 교반시킬 수 있고, 상기 탈세포화에 의해 상기 뇌조직 세포가 95% 이상 제거될 수 있다.

상기 “탈세포화 용액”은 뇌조직의 세포를 제거하기 위한 다양한 세제 성분을 포함할 수 있고, 예컨대, 고장성 식염수(hypertonic saline), 과산화 아세트산(peracetic acid), 트리톤-X(Triton-X), SDS 또는 기타 세제 성분을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 탈세포화된 세포외기질은 건조될 수 있으며, 동결 건조되거나 공기 건조될 수 있다.

상기 건조된 세포외기질은 박리(tearing), 제분(milling), 절단, 분쇄 및 전단 단계를 포함하는 방법에 의해 세분될 수 있다. 상기 세분된 세포외기질은 냉동 상태 또는 냉동 건조 상태에서, 분쇄 또는 제분과 같은 방법에 의해 분말 형상으로 가공될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 탈세포 뇌조직 유래 세포외기질(decellularized brain extracellular matrix; dBEM)을 포함하는 뇌 오가노이드 배양용 하이드로겔 조성물이 제공된다.

상기 하이드로겔 조성물은 상기 탈세포 뇌조직 유래 세포외기질을 적정 비율로 포함하므로, 탄성계수가 실제 뇌조직 환경과 유사한 수준으로 유지될 수 있으며, 1Hz 기준 탄성계수 100 내지 150Pa에서 최적의 뇌 오가노이드 배양 환경이 조성될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 조성물에서 뇌 오가노이드를 배양하는 방법이 제공된다.

기존의 매트리겔 기반 배양 시스템은 동물 암조직 유래의 추출물로서 배치 간의 차이가 크고 실제 뇌의 환경을 모사해주지 못하고, 뇌 오가노이드로 분화, 발달되는 효율이 미흡한 반면, 상기 하이드로겔 조성물은 뇌조직 유사 환경을 조성할 수 있으므로 뇌 오가노이드 배양에 있어서 적합하다.

상기 뇌조직 매트릭스 기반 하이드로겔 조성물에서 배양된 뇌 오가노이드는 전반적인 신경세포 분화 및 피질층 신경세포로의 분화가 촉진될 뿐만 아니라 구조적으로도 실제 뇌와 유사한 형태로 발달될 수 있다.

상기 배양은 적합한 조건에서 세포를 유지 및 성장시키는 과정을 의미하며, 적합한 조건은 예컨대, 세포가 유지되는 온도, 영양소 가용성, 대기 CO₂ 함량 및 세포 밀도를 의미할 수 있다.

서로 다른 유형의 세포를 유지, 증식, 확대 및 분화 시키기 위한 적절한 배양 조건은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 문서화 되어있다. 상기 오가노이드 형성에 적합한 조건은 세포 분화 및 다세포 구조의 형성을 용이하게 하거나 허용하는 조건일 수 있다.

이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.

실험예 1 : 탈세포 뇌조직(dBEM) 기반 삼차원 하이드로겔을 이용한 뇌 오가노이드 제작

도 1을 참조하면, 탈세포화된 뇌조직 유래 세포외기질(dBEM)을 함유하는 하이드로겔을 이용하여 뇌 오가노이드 제작 효율이 우수한 삼차원 배양 플랫폼을 제조하였다.

상기 dBEM은 조직 특이적인 세포외기질 성분을 포함하므로 배양세포에 조직 특이적인 물리적, 생화학적 미세환경을 제공하여 오가노이드의 생성 및 분화 효능을 증진시킬 수 있다.

동결건조된 dBEM은 효소처리방법을 통한 용액화 과정을 거쳐 하이드로겔 제작에 활용되었다(도 1A).

도 1B의 배양 프로토콜을 통해 dBEM 기반 하이드로겔 내에서 뇌 오가노이드를 형성하고 장기간 배양할 수 있다.

실험예 2 : 인간 탈세포화 뇌조직(dBEM) 제작 및 분석

분리된 인간뇌조직을 1 x 1 x 1 cm³ 크기로 절단하고, 하기 순서로 탈세포화 용액에 교반시켜 탈세포화 하였다.

먼저, 증류수에서 24시간 동안 교반(60 rpm)하고, 0.05%(v/v) 트립신/EDTA(trypsin/ ethylenediaminetetraacetic acid, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에서 90분간 교반(60 rpm, 37°C)하였다.

0.1%(v/v) 수산화암모늄(Sigma, St. Louis, MO)을 포함하는 3%(v/v) Triton X-100(Wako, Osaka, Japan)에서 120분간 교반하였다.

1M 수크로스 용액(Sigma)에서 30분간 교반하고, 증류수에서 15분간 교반하였다.

3%(v/w) 황산 도데실 나트륨(Sigma)에서 60분간 교반하고, 4%(v/v) 에탄올(Sigma)에서 120분간 교반하였다.

PBS(Sigma)에서 15분간 교반하고, 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific)에서 60분간 교반(60 rpm)하였다.

마지막으로 증류수에서 15 분간 교반하고, PBS에서 15 분간 교반하였다.

각각의 용액 교체시, 증류수를 이용하여 기존의 용액을 세척하였다. 특별한 언급이 없으면 모든 과정은 4°C에서 수행되었으며 120 rpm에서 교반시켜 탈세포화 하였다.

도 2를 참조하면, 탈세포 과정을 통해 세포는 효율적으로 제거할 수 있고, 매트릭스 조직이 대부분 유지되는 탈세포 뇌조직 유래의 세포외기질(dBEM)이 확보될 수 있다.

조직학(H&E staining, Masson's trichrome staining; MT staining) 분석을 통해 탈세포 과정을 거친 후 조직으로부터 세포가 제거된 반면, 생화학적 미세환경을 모사하는 세포외기질 성분이 유지됨을 확인하였다(도 2A).

DNA를 정량한 결과 조직으로부터 대부분의 세포(98% 이상)가 제거되었다(도 2B).

GAG(Glycosaminoglycan)을 정량한 결과 탈세포 과정 후 대부분의 GAG 성분이 손실되지 않고 조직 내에 유지되었다(도 2C).

실험예 3 : 하이드로겔 성분 분석

형광면역염색(immunostaining) 및 질량분석법(mass spectrometry)을 통해 오가노이드 형성에 영향을 줄 수 있는 뇌조직 유래의 세포외기질 성분을 분석하였다.

도 3을 참조하면, 면역염색을 통해 뇌조직(탈세포 전)에 세포의 발달 및 분화에 중요한 요소인 라미닌(laminin)의 아형(subtype)을 분석한 결과, 특히 아형(subtype) α5, β1, γ1 라미닌이 다량 존재하였다(도 3A).

질량분석법(mass spectrometry)을 이용하여 탈세포 뇌조직 내의 단백질 성분을 분석한 결과 다양한 종류의 콜라겐(collagen), 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌과 같은 당단백질 뿐만 아니라 프로테오글리칸, 지질 성분들도 다량 포함되었다(도 3B).

즉, dBEM 하이드로겔은 뇌조직 특이적 미세환경을 모사하는 생화학적 성분들을 바탕으로 뇌 오가노이드 형성 및 분화를 증진시킬 것으로 평가되었다.

실험예 4 : 기계적 물성 분석

오가노이드 제작에 널리 활용되고 있는 하이드로겔 종류 중 하나인 매트리겔(Matrigel)과 상기 실험예 2에서 제작한 dBEM 성분을 혼합하여 400 μg/mL 농도의 dBEM 을 포함하는 하이드로겔을 제작하였다.

시판되는 매트리겔의 특성에 따라 낮은 온도에서는 용액 상태이며, 37 ℃에서 겔화가 진행된다. 구체적으로, 동결건조된 dBEM을 용액상태로 녹이고, 용액 상태의 매트리겔과 혼합 후 37 ℃에서 30 분 반응시켜 겔화 된 스캐폴드를 형성시켜 dBEM 을 포함하는 하이드로겔을 제작하였다. 이를 dBEM 하이드로겔이라 명명하였다.

Rheometer를 이용하여 매트리겔(Matrigel) 하이드로겔 및 dBEM 하이드로겔의 물리적 특성을 비교 분석한 결과 측정 주파수 내에서 탄성계수(elastic modulus)가 점탄성계수(viscous modulus) 보다 높게 측정되어 안정적인 하이드로겔을 형성하였다.

도 4를 참조하면, 1 Hz 기준 탄성계수를 비교한 결과 매트리겔은 약 115 Pa, dBEM은 약 126 Pa의 탄성계수로서 dBEM을 첨가에 따른 하이드로겔의 물리적 특성 변화는 크지 않았다.

실험예 5 : 하이드로겔의 조직 특이적인 효과 분석

도 5를 참조하면, 다양한 조직 유래의 탈세포화 세포외기질을 이용하여 조직 특이적 3차원 하이드로겔을 제작하고 dBEM 하이드로겔의 뇌조직 특이적 기능성을 확인하였다.

인간 유도만능줄기세포(human induced pluripotent stem cell; iPSC) 유래 뇌 오가노이드의 3차원 배양을 실시한 결과, dBEM 하이드로겔에서 배양한 뇌 오가노이드의 크기가 매트리겔 보다 컸으며(배양 초기, 20일 차), 초반 뇌 오가노이드 형성에 중요한 신경관(neural tube) 형성이 뚜렷하고 세포의 밀집도(density)도 높았다(도 5A).

각 하이드로겔 내에서 배양된 뇌 오가노이드의 크기를 정량한 결과, dBEM 하이드로겔에서 키운 뇌 오가노이드의 크기가 가장 컸으며, 뇌조직 특이적인 dBEM 하이드로겔이 뇌 오가노이드 배양에 효과적인 것으로 분석되었다(도 5B).

실험예 6 : 뇌 오가노이드 신경 분화 확인

도 6을 참조하면, dBEM 하이드로겔을 이용하여 30일동안 뇌 오가노이드를 배양하고 오가노이드 내부의 분화 및 발달 정도를 분석하였다.

형광면역염색을 통해 신경세포 계통(neuronal lineage)으로의 분화를 분석하였다.

dBEM 하이드로겔에서 분화된 오가노이드는 매트리겔에서 분화된 오가노이드보다 신경줄기세포 마커(Nestin) 및 성숙한 신경세포 마커(Tuj1, MAP2)의 발현이 증가하였다(도 6A 및 6B).

이미지 기반의 분석을 통해 dBEM 하이드로겔에 의해 신경세포의 분화뿐 아니라 신경줄기세포의 증식 및 뇌 오가노이드의 발달 역시 촉진됨을 확인하였다(도 6C 및 6D).

특히 배양환경에 상관없이(spinner flask, multiwell plate) dBEM 하이드로겔에서 배양된 뇌 오가노이드의 크기가 증가하였다(도 6D).

실험예 7 : 뇌 오가노이드 분화 및 발달 확인

dBEM 하이드로겔을 이용하여 30일동안 뇌 오가노이드를 배양하고 분화 및 발달 정도를 분석하였다.

형광면역염색을 통해 신경세포 마커(Tuj1, NeuN, MAP2), 초기 뇌 발달의 등측(dorsal)을 형성하는 마커(Pax6), 전뇌(forebrain)에 해당하는 마커(FoxG1), 줄기세포 마커(Sox2)의 발현을 분석하였다(도 7).

dBEM 하이드로겔에서 배양된 뇌 오가노이드에서 신경세포로의 분화뿐만 아니라 줄기세포의 생성도 증가하여 뇌 오가노이드 성숙이 촉진되고 크기도 현저히 증가하였다(도 7A).

또한, 조직학 및 SEM 분석을 통해서 뇌 오가노이드 내의 세포 밀집도가 증가하였고(도 7B), 뇌 오가노이드 내 빈 공간이 감소하였으며(도 7C), dBEM 하이드로겔 내에서 성숙한 오가노이드의 형성이 확인되었다.

특히, 인간 뇌의 기저판 (basal lamina)에 해당하는 라미닌 층이 dBEM에서 배양된 뇌 오가노이드에서 보다 선명하게 형성되었다(도 7D).

dBEM 하이드로겔을 이용하여 45일동안 뇌 오가노이드를 배양하고 이의 분화 및 발달 정도를 분석하였다.

도 8을 참조하면, 피질층(cortical layer) 마커인 TBR1과 TBR2를 염색한 결과 기존의 매트리겔 배양환경보다 상기 마커들을 발현하는 세포의 수도 증가하였으며, 발현하는 세포층의 두께가 증가하였다(도 8A 및 8B).

또한, 신경세포-신경세포 간의 상호작용(N-cadherin)도 촉진됨을 확인하였다(도 8C).

매트리겔, dBEM 하이드로겔을 이용하여 45일 동안 뇌 오가노이드를 배양하고 조직 투명화 기술을 이용하여 뇌 오가노이드에서의 3차원 신경세포 분포 및 구조 발달을 확인하였다.

도 9를 참조하면, dBEM 하이드로겔을 이용하여 배양한 뇌 오가노이드에서 성숙한 신경세포로의 분화가 증가하였으며, 뇌 조직 특이적인 주름구조가 실제 뇌와 유사한 형태로 발달하였다.

실험예 8 : 뇌 오가노이드 기능성 분석

형광 칼슘 이미징 실험을 통해 하이드로겔에서 45일 간 배양한 뇌 오가노이드의 글루탐산(glutamate) 및 감마아미노낙산(GABA) 신경전달물질(neurotransmitter)에 대한 반응성을 확인하였다.

도 10을 참조하면, dBEM 하이드로겔에서 배양한 뇌 오가노이드가 매트리겔에서 배양한 뇌 오가노이드에 비해 글루탐산에 반응하는 세포의 비율 및 세포 내 유입되는 칼슘의 양이 더 높은 수준이었다(도 10A 및 10D).

dBEM에서 배양한 뇌 오가노이드는 감마아미노낙산에도 반응하는 반면, 매트리겔에서 배양한 뇌 오가노이드에서는 반응하는 세포는 관찰되지 않았다(도 10B).

반면, dBEM 하이드로겔에서 배양한 뇌 오가노이드가 글루탐산에 반응하는 것이 관찰되었으며, sodium channel blocker인 tetrodotoxin(TTX)을 처리 하였을 경우 신경전달신호 및 활성도가 감소하였다(도 10C).

패치클램프를 이용하여 dBEM 하이드로겔에서 배양된 뇌 오가노이드의 전기 생리학적 기능성을 분석하였다(도 10E 내지 10G).

전압-클램프 상태에서 전압개폐성 나트륨채널에 의한 전류 생성이 확인되었으며(도 10E), Na+ channel 차단제인 TTX (Tetrodotoxin) 처리에 나트륨 채널에 의한 전류가 사라졌다(도 10G). 전류-클램프 상태에서 측정하였을 때 활동 전위가 생성되었다(도 10F).

즉, dBEM 조건에서 배양된 뇌 오가노이드가 매트리겔 조건에서 배양된 뇌 오가노이드와 비교하여 신경 전기생리학적인 기능성이 현저히 우수하였다.

실험예 9 : 뇌 오가노이드 분화 및 세포간 네트워크 확인

형광면역염색을 통해, 대조군인 매트리겔 및 dBEM 하이드로겔을 이용하여 75일간의 뇌 오가노이드 배양을 진행한 후 분화 및 세포 간 네트워크 형성을 분석하였다.

도 11을 참조하면, dBEM 하이드로겔에서 배양한 뇌 오가노이드에서 신경세포 간 adhesion 역할을 한다고 알려진 N-Cadherin의 발현 및 분포율이 매트리겔에서 배양한 뇌 오가노이드에 비해 현저히 높은 수준으로 나타났다.

상기 N-cadherin은 신경돌기 발달 촉진 및 시냅스 형성(synaptogenesis)에 관련된 단백질로 알려져 있다(도 11A 및 11B).

형광면역염색을 통해 dBEM 조건에서 배양된 뇌 오가노이드에서 시냅스 소포(synaptic vesicle) 마커인 Synapsin I 단백질의 발현을 분석하였다.

Synapsin I은 신경 시냅스의 화학적 신경신호전달 과정에 중요한 단백질이며, 상기 결과는 dBEM을 이용하여 배양된 뇌 오가노이드의 성숙도가 높은 수준임을 시사한다(도 11C).

또한, Glutamatergic neuron 대표 마커인 VGLUT의 발현을 통해 dBEM에서 배양된 뇌 오가노이드에서의 높은 분화도를 확인하였다(도 11D).

실험예 10 : 뇌 오가노이드 피질층 발달 분석

형광면역염색을 통해 75일동안 매트리겔, dBEM 하이드로겔을 이용하여 뇌 오가노이드를 배양한 후 뇌 오가노이드의 피질층 발달 정도를 분석하였다.

도 12를 참조하면, dBEM 하이드로겔에서 배양된 뇌 오가노이드에서 피질층 IV 위치에 해당하는 마커인 TBR1의 발현 및 두께가 증가하였으며, 성숙한 뇌 오가노이드로 분화하였음이 확인되었다(도 12A).

dBEM 하이드로겔에서 배양된 뇌 오가노이드에서 뇌실밑구역(subventricular zone)에 해당하는 마커인 TBR2의 발현이 전반적으로 넓게 분포하였으며(도 12B), 뇌 오가노이드의 피질층 및 특이적인 주름 구조도 잘 발달되었다(도 12C).

길이가 가장 긴 부분을 기준으로 형성된 뇌 오가노이드의 크기를 측정하였을 때 매트리겔보다 dBEM 하이드로겔에서 배양된 뇌 오가노이드의 크기가 현저히 컸으며(도 12D), dBEM 하이드로겔에서 지속적으로 피층 마커들이 지속적으로 발현하였다(도 12E).

또한, 2차원 및 3차원 광시트 현미경(light-sheet microscopy)을 이용하여 형성된 뇌 오가노이드를 분석한 결과 dBEM 하이드로겔 그룹에서 뇌 오가노이드의 주름 구조가 발달하고, 전체 부피가 증가하였다(도 12F 및 12G).

상기 결과는 dBEM 하이드로겔에 의해 뇌 오가노이드의 성숙 정도가 증가될 수 있음을 시사한다.

실험예 11 : 뇌 오가노이드 피질층 및 전뇌 발달 분석

dBEM 하이드로겔을 이용하여 뇌 오가노이드를 75일 동안 배양하고, 형광면역염색을 통해 피질층의 성숙 및 전뇌 부분의 발달을 분석하였다.

도 13을 참조하면, 뇌실밑구역에 해당하는 마커인 TBR2와 5번 피질층의 마커인 CTIP의 면역염색을 통해 dBEM 환경에서 배양된 뇌 오가노이드 피질층의 성숙 및 발달이 확인되었다(도 13A).

또한, 전뇌 마커인 FoxG1의 전반적인 분포를 비교하였을 때, dBEM 하이드로겔에서 배양된 뇌 오가노이드에서 전뇌 특이적 마커의 발현량이 현저히 증가하였으며, 크기 및 성숙도 역시 증가하였다(도 13B).

실험예 12 : 뇌 오가노이드 유전자 발현 비교(qPCR)

qPCR을 통해 75일 간 하이드로겔에서 배양된 뇌 오가노이드의 유전자 발현을 확인하고, 대조군으로 인간 태아 유래 신경줄기세포(hNSC; human fetal neural stem cell)와 인간 유래 뇌조직(hTissue; human Tissue)의 유전자 발현량을 함께 비교하였다.

도 14를 참조하면, dBEM을 이용하여 배양된 뇌 오가노이드의 경우, 매트리겔 내에서 배양된 뇌 오가노이드에 비해 신경세포 마커인 Tuj1와 도파민성 신경세포(dopaminergic neuron) 마커인 TH의 발현이 증가하였으며, 세포 간 부착(adhesion) 및 신경세포 생존에 중요한 역할을 하는 CDH1 발현 역시 증가하였다.

실험예 13 : 뇌 오가노이드 유전자 발현 비교(Gene ontology)

메트리겔에서 배양된 뇌 오가노이드 및 dBEM에서 배양된 뇌 오가노이드에 대한 전사체 발현 분석을 통해 양자의 특성을 비교 분석하였다.

RNA-sequencing을 통해 gene ontology(GO) category 분석을 기초로 상기 두 그룹간의 유전자 발현 양상을 비교하였다.

메트리겔 그룹에 비해 dBEM 그룹에서 증가된 유전자(필터링 조건: 1.2 이상 차이, p <0.05, FDR <0.1, n=3)를 clustering 하여 gene ontology(GO) 분석을 수행하였다.

도 15A를 참조하면, 가장 높은 스코어를 가진 GO term 30개는 대부분이 신경계와 관련되었다.

특히, dBEM에서 배양된 뇌 오가노이드에서 시냅스(synapse)와 neurotransmitter transmission 등 전기생리학적 기능과 관련된 많은 마커 발현이 증가하는 증가하였다. 상기 결과는 개발된 dBEM 에서 배양된 뇌 오가노이드가 기존 매트리겔 조건으로 배양된 경우보다 효율적으로 유도되었음을 시사한다.

도 15B 내지 15I를 참조하면, 전분화능(pluripotency)과 관련된 유전자들 발현이 증가하였으며, 전뇌(forebrain) 관련 마커, 성숙한 신경세포 관련 마커의 발현도 함께 증가하였다.

특히, 신경교(glial) 관련 마커는 뇌 오가노이드 배양에 있어 신경 관련 마커 발현 이후 검출되는 것으로 알려져 있다.

dBEM 그룹에서 관련 마커들이 증가하였으며, 상기 결과는 dBEM 그룹의 뇌 오가노이드의 성숙도가 촉진됨을 의미한다. 또한, 세포외기질과의 상호작용(ECM interaction)과 세포 부착(cell adhesion)과 관련된 다수의 유전자의 발현이 증가하였다.

도 16 참조하면, Gene ontology(GO)을 통해 매트리겔 그룹과 비교하여 유의적으로(p-value <0.05, FDR < 0.1) 1.2배 이상 증가한 유전자를 분석한 결과 시냅스 화학적 신호 전달과 관련된 많은 유전자의 발현이 증가하였다.

도 17을 참조하면, KEG pathway를 통해 매트리겔 그룹과 비교하여 유의적으로(p-value <0.05, FDR < 0.1) 1.2배 이상 증가한 유전자를 분석한 결과, 다양한 subtype의 뉴런 시냅스와 관련된 유전자의 발현이 증가하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

1. (a) 분리된 뇌조직을 탈세포화하는 단계;
   (b) 상기 뇌조직을 건조하는 단계; 및
   (c) 상기 뇌조직을 겔화(gelation)하는 단계;를 포함하는 뇌 오가노이드 배양용 조성물 제조방법으로서,
   상기 (c) 단계는 뇌조직 및 매트리겔(matrigel)을 혼합하여 하이드로겔을 수득하는 것이고,
   상기 하이드로겔은 뇌조직 유래 세포외기질(decellularized brain extracellular matrix; dBEM)을 0.01 내지 2.0 mg/mL 포함하고, 1Hz 기준 탄성계수가 100 내지 150Pa인, 뇌 오가노이드 3차원 배양용 조성물 제조방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 (a) 단계에서 상기 뇌조직을 탈세포화 용액에서 교반시키는 뇌 오가노이드 3차원 배양용 조성물 제조방법.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 뇌조직을 3 내지 24시간 동안 교반시키는 뇌 오가노이드 3차원 배양용 조성물 제조방법.
   
4. 제2항에 있어서,
   상기 탈세포화에 의해 상기 뇌조직 세포가 95% 이상 제거된 뇌 오가노이드 3차원 배양용 조성물 제조방법.
   
5. 탈세포 뇌조직 유래 세포외 기질(decellularized brain extracellular matrix; dBEM) 및 매트리겔(matrigel)을 포함하고,
   상기 뇌조직 유래 세포외 기질(dBEM)의 농도는 0.01 내지 2.0 mg/mL이고, 1Hz 기준 탄성계수가 100 내지 150Pa인, 뇌 오가노이드 3차원 배양용 하이드로겔 조성물.
   
6. 삭제
7. 제5항의 조성물에서 뇌 오가노이드를 배양하는 방법.
   

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