KR102041360B1 - 탈세포화된 세포외 기질을 포함하는 직접교차분화 촉진용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탈세포화된 세포외 기질을 포함하는 직접교차분화 촉진용 조성물 및 이를 이용한 신경 또는 간세포로의 직접교차분화방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 직접교차분화용 조성물은, 생체로부터 분리된 조직 유래 세포외 기질을 포함하며, 상기 세포외 기질에 기반한 배양 표면 또는 하이드로겔은 조직 특이적인 미세 환경을 효과적으로 제공함으로써, 직접교차분화 효율을 현저하게 향상시킬 수 있었는바, 본 발명은 세포 치료제 생산용 배양 플렛폼 또는 이식용 생체소재 등 다양한 조직 공학적 응용 기술에 적용될 수 있을 뿐만 아니라, 독성 평가 및 약물 스크리닝 등의 분야에도 폭넓게 활용될 수 있을 것이다.

Description

탈세포화된 세포외 기질을 포함하는 직접교차분화 촉진용 조성물 및 이의 용도 {Composition for promoting direct conversion comprising decellularized extracellular matrix and use thereof}

본 발명은 탈세포화된 세포외 기질을 포함하는 직접교차분화 촉진용 조성물 및 이를 이용한 신경 또는 간세포로의 직접교차분화방법에 관한 것이다.

인구의 고령화 및 이에 따른 난치성 질환의 증가에 따라 재생 의학적 조직 재생 및 세포 치료의 수요가 급증하는 추세에 맞추어 줄기세포 치료제 개발의 필요성이 크게 대두되고 있다. 특히, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈, 척수손상 등과 같은 뇌신경 질환 치료에 있어서, 신경세포의 재생을 촉진시키기 위하여 성체 줄기세포, 배아줄기세포, 및 유도만능 줄기세포 등을 이용한 다양한 치료법이 개발되고 있는 실정이다. 다만, 성체줄기세포의 경우, 제한된 분화능과 낮은 치료 효능을 가지고 있고, 배아줄기세포의 경우에는 윤리적 문제, 안전성 이슈 및 낮은 분화 효율성 문제로 인해 이들 줄기세포는 자가 세포 치료제로서의 개발이 어려운 단점이 있다. 또한, 환자 맞춤형 세포 치료제 생산을 위해 리프로그래밍 (reprogramming) 기법으로 체세포로부터 유도만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cell)를 제작하고 이를 다시 조직 특이적 세포로 분화시키는 연구가 최근 각광 받고 있으나, 낮은 리프로그래밍 효율 및 기형종 형성 가능성 등의 해결해야 하는 문제점이 존재한다.

한편, 특정 체세포로부터 다른 조직 특이적인 세포로의 전환을 유도하는 직접교차분화 기술은 면역거부반응, 기형종 형성, 윤리적 문제 등을 피할 수 있어 최근 환자맞춤형 세포 치료제 생산 기술로 각광 받고 있다. 하지만, 연구팀마다 직접교차분화를 유도하기 위해 각기 다른 전사인자 유전자를 사용하고 있고, 신경세포로의 직접교차분화를 유도할 수 있는 전사인자 유전자를 체세포 내로 이입하는 경우, 신경세포로의 직접교차분화를 일부 촉진시킬 수 있지만, 기존의 배양 기술만으로는, 아직 그 전환 효율 및 분화능이 매우 낮고 신경세포로서의 기능성이 제한적이어서 실질적인 세포 치료제로서의 효능을 기대하기 힘든 실정이다.

이러한 배경 하에서, 직접교차분화의 효율을 향상시키기 위한 다양한 시도가 이루어지고 있으나 (한국 특허공개번호 10-2015-0015294), 실제 세포 치료용으로 생체 내에서도 효율적으로 이용될 수 있는 직접교차분화 기술에 대한 개발은 아직 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은, 직접교차분화의 효율을 증진시킬 수 있는 기술을 개발하고자 예의 노력한 결과, 탈세포화된 뇌 또는 간 조직으로부터 수득한 세포외 기질 성분을 이용하여 직접교차분화시킴으로써, 신경세포 또는 간 세포의 직접교차분화 효율이 현저하게 향상됨을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은, 생체로부터 분리된 조직 유래의 세포외 기질 (Extracellular matrix, ECM)을 포함하는, 직접교차분화 촉진용 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 함유하는 직접교차분화용 배양용기 또는 직접교차분화용 3차원 지지체를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 생체로부터 분리된 조직 유래의 세포외 기질을 포함하는, 직접교차분화용 배양용기 또는 3차원 지지체에서, 전사인자가 도입된 체세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 신경 또는 간세포로의 직접교차분화방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 직접교차분화된 신경 또는 간세포를 포함하는, 세포 치료제를 제공하는데 있다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생체로부터 분리된 조직 유래의 세포외 기질 (Extracellular matrix, ECM)을 포함하는, 직접교차분화 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 조직은, 뇌 또는 간 조직일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 세포외 기질은, 상기 생체로부터 분리된 조직을 탈세포화 (Decellularization) 처리하여 수득될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 세포외 기질은 상기 조성물에 용해물 형태로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물로 표면이 코팅된, 직접교차분화용 배양용기를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 직접교차분화용 배양용기의 표면은, 세포외 기질을 0.005 내지 0.03mg/ml의 농도로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물 및 하이드로겔을 포함하는, 직접교차분화용 3차원 지지체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 하이드로겔은 콜라겐, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 폴리에틸렌글라이콜, 키토산, 마트리젤, 코드로이틴 설페이트, 및 셀룰로스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 직접교차분화용 3차원 지지체는 세포외 기질을 4 내지 16mg/ml의 농도로 포함할 수 있다.

또한, 생체로부터 분리된 조직 유래의 세포외 기질을 포함하는 직접교차분화용 배양용기 또는 3차원 지지체에서, 전사인자가 도입된 체세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 신경 또는 간세포로의 직접교차분화방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 세포외 기질은 (a) 생체로부터 분리된 조직을 탈세포화 (Decellularization) 처리하여 수득한 세포외 기질을 동결 건조 한 후, 분쇄하는 단계; 및 (b) 상기 분쇄물을 용매에 용해시켜 용해물을 제조하는 단계를 포함하는, 방법에 의해 제조되는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 체세포는 섬유아세포일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 직접교차분화용 3차원 지지체에서 배양하는 단계는 미세유체 장치 (Microfluidic device) 내에서 배양되는 것을 특징으로 하며, 상기 미세유체 장치는 (a) 직접교차분화용 3차원 지지체 및 전사인자가 도입된 체세포가 로딩되는 배양채널; 및 (b) 상기 배양채널과 유체의 이동이 가능한 미세관으로 연결되어 있는 리저버를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 방법으로 직접교차분화된 신경 또는 간세포를 포함하는 세포 치료제를 제공한다.

본 발명에 따른 직접교차분화 촉진용 조성물은, 생체로부터 분리된 조직 유래 세포외 기질을 포함하며, 상기 세포외 기질에 기반한 배양 표면 또는 하이드로겔은 조직 특이적인 미세 환경을 효과적으로 제공함으로써, 직접교차분화의 효율을 현저하게 향상시킬 수 있었는바, 본 발명은 세포 치료제 생산용 배양 플렛폼 또는 이식용 생체소재 등 다양한 조직 공학적 응용 기술에 적용될 수 있을 뿐만 아니라, 독성 평가 및 약물 스크리닝 등의 분야에도 폭넓게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은, 본 발명에 따른 뇌 조직 유래 세포외 기질 용해물의 제조 과정 및 이의 활용을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는, 탈세포화 처리에 따른 (a) 세포 성분의 제거를 육안으로 관찰한 결과, (b) 세포 핵의 변화를 H&E 염색을 통해 확인한 결과, (c) DNA 함량 변화를 비교한 결과, (d) 글라이코사미노글리칸 (GAG) 함량 변화를 비교한 결과이다.
도 3은, 탈세포화 처리 후, 뇌 조직에 존재하는 (a) 단백질 및 (b) 지질 성분의 분포를 확인한 결과이다.
도 4는, 본 발명에 따른 직접교차분화용 배양용기에서, 세포외 기질 성분의 표면 코팅에 따른 (a) 표면 원소 분석결과 및 (b) 수분 접촉 각도를 측정한 결과이다.
도 5는, 본 발명에 따른 직접교차분화용 배양용기에서, (a) Laminin 면역염색 결과, (b) 주사전자현미경으로 기질 표면을 관찰한 결과이다.
도 6은, 본 발명에 따른 직접교차분화용 3차원 지지체에서, (a) 내부 구조를 주사전자현미경으로 관찰한 결과, (b) 탄성계수 및 점성계수를 회전형 유량계로 측정한 결과이다.
도 7은, 본 발명에 따른 직접교차분화용 배양용기를 이용하여 신경세포로의 직접교차분화 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 8은, 섬유아세포에 BAM-encoding plasmid를 전달한 후 7-10일째, (a) 세포외 기질의 농도 (0.01 0.05, 0.1 mg/ml)에 따른 Sox2, Nestin, 및 Tuj1의 발현을 qRT-PCR을 통하여 확인한 결과, (b) neurosphere-like cluster 형성을 확인한 결과이다.
도 9는, 섬유아세포에 BAM-encoding plasmid를 전달한 후 10-15일째, (a) 세포외 기질의 농도 (0.005, 0.01 mg/ml)에 따른 Tuj1+ 세포를 면역염색을 통하여 확인하고, (b) 이를 정량화한 결과이다.
도 10은, 신경세포 유도용 배지를 첨가한지 14일째, 세포외 기질의 농도 (0.005, 0.01 mg/ml)에 따른 Nestin, Tuj1, 및 MAP2의 발현을 면역염색을 통하여 확인하고, b) 이를 qRT-PCR을 통하여 비교한 결과이다.
도 11은, 신경세포 유도용 배지를 첨가한지 14일째, 세포외 기질의 농도 (0.005, 0.01 mg/ml)에 따른 신경돌기 (Neurite)의 평균 길이를 비교한 결과이다.
도 12는, 신경세포 유도용 배지를 첨가한지 30일째, (a) 본 발명에 따른 PLL-BEM (0.01) 세포외 기질 단일 성분을 포함한 PLL-LN 군, 세포외 기질 복합 성분을 포함한 PLL-LN+FN 군의 Synapsin I+, Tuj1+ 세포를 면역염색을 통하여 확인한 결과, (b) Nestin, Tuj1, 및 MAP2의 발현을 qRT-PCR을 통하여 비교한 결과이다.
도 13은, 본 발명에 따른 직접교차분화용 배양용기에서 직접교차분화된 유도신경세포 (iN-BEM)에 대하여, (a) RNA-sequencing을 통하여 유전자 발현 프로파일을 분석한 결과, (b) gene ontology (GO) category 분석 결과이다.
도 14는, 본 발명에 따른 직접교차분화용 배양용기에서 직접교차분화된 유도신경세포 (iN-BEM)에 대하여, 전기생리학적 기능을 평가한 것으로서, (a) Rest membrane potential, (b) 전압-클램프 상태에서의 특정 채널에 의한 전류, (c) 전류-클램프 상태에서의 활동전위, (d) Post-synaptic current 및 PiTx와 CNQX 처리에 의한 전류 변화, (e) glutamate neurotransmitter에 대한 반응성을 확인한 결과이다.
도 15는, 본 발명에 따른 유도신경세포의 뇌졸중 동물모델에 대한 치료 효과를 확인하기 위한 실험과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 16은, 유도신경세포를 이식한 후 7일째, (a) DiI 형광 분포를 통하여 이식된 세포의 분포를 확인한 결과, (b) DiI+ BrdU+ 세포 및 (c) DiI+ Tuj1+세포의 분포를 면역염색을 통하여 확인한 결과이다.
도 17은, 유도신경세포가 이식된 뇌졸중 마우스 모델의 신경행동학적 특성을 확인 것으로서, (a) Rotarod test, (b) Ladder walking test, (c) Grip strength test 결과이다.
도 18은, 나노패턴 구조로 이루어진 기질 표면을 갖는 본 발명의 직접교차분화용 배양용기에서 유도된 유도신경세포의 Tuj1 발현을 면역염색을 통하여 확인한 결과이다.
도 19는, 본 발명에 따른 직접교차분화용 배양용기를 이용하여 성체 쥐 유래 꼬리 섬유아세포로부터 신경세포로의 직접교차분화를 유도한 후, Tuj1 및 NeuN의 발현을 면역염색을 통하여 확인한 결과이다.
도 20은, 본 발명에 따른 직접교차분화용 3차원 지지체를 이용하여 (a) 신경세포로의 직접교차분화시키는 과정, (b) 비교군과 본 발명간 배양 조건의 차이, (c) 미세유체 장치를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 21은, 미세 환경 조건의 변화에 따른, (a) 유도신경세포의 Tuj1과 MAP 발현을 정량적으로 비교한 결과, (b) Tuj1과 MAP 발현을 면역염색을 통하여 확인한 결과, (c) Tuj1과 H3K4me3 또는 H3K27Ac 단백질간 결합을 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay를 통하여 비교한 결과이다.
도 22는, 미세 환경 조건의 변화에 따른 유도신경세포의 (a) 세포질 내 YAP 발현을 면역염색을 통하여 확인한 결과, (b) 핵 내 YAP 발현을 정량적으로 비교한 결과이다.
도 23은, Y-27632 또는 blebbistatin 처리에 따른 유도신경세포의 (a) 세포질 내 YAP 발현을 면역염색을 통하여 확인한 결과, (b) 핵 내 YAP 발현을 정량적으로 비교한 결과이고, (c) Y-27632의 처리 농도 (5, 10 uM)에 따른 Tuj1 발현 변화를 비교한 결과, (d) blebbistatin의 처리 농도(5, 15 uM)에 따른 Tuj1 발현 변화를 비교한 결과이다.
도 24는, 미세 환경 조건의 변화에 따른 (a) 유도신경세포의 H3K4me3 히스톤 변형 정도를 면역염색을 통하여 확인하고, (b) 이를 비교한 결과이다.
도 25는, 미세유체 장치에서 배양한 후 7-9일째, NeuN, Tuj1, 및 MAP2의 발현을 면역염색을 통하여 확인한 결과이다.
도 26은, 미세유체 장치에서 배양한 후 7-9일째, Nestin, Tuj1, 및 MAP2의 발현을 qRT-PCR을 통하여 비교한 결과이다.
도 27은, 미세유체 장치에서 배양한 후 7-9일째, (a) 신경돌기의 평균 길이, (b) Tuj1+ 세포 수, (c) glutamate neurotransmitter에 대한 반응성을 확인한 결과이다.
도 28은, 본 발명에 따른 직접교차분화용 3차원 지지체에서 유도된 유도신경세포의 부착성 및 신경돌기를 확인한 결과이다.
도 29는, 뇌졸중 동물모델을 이용하여 본 발명에 따른 유도신경세포의 치료효과를 확인한 것으로서, (a) DiI 형광 분포를 통하여 이식된 세포의 분포를 확인한 결과, (b) Rotarod test 결과이다.
도 30은, 히알루론산을 이용한 직접교차분화용 3차원 지지체에서 유도된 유도신경세포의 (a) Tuj1, MAP2의 발현을 면역 염색으로 확인한 결과, (b) Tuj1, MAP2, Nestin의 발현을 qRT-PCR을 통하여 비교한 결과이다.
도 31은, 본 발명에 따른 직접교차분화용 배양용기를 이용하여 간세포로의 직접교차분화 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 32는, 전사인자 전달에 따른 (a) 세포의 형태를 광학현미경으로 관찰한 결과, (b) albumin 및 E-cadherin 발현을 면역염색을 통하여 확인한 결과이다.
도 33은, 세포외 기질의 농도 (0.02mg/ml, 0.1mg/ml)에 따른 (a) albumin의 발현, (b) 유도간세포 내 glycogen의 존재 여부를 확인한 결과이다.
도 34는, 본 발명에 따른 직접교차분화용 배양용기에서 유도된 유도간세포의 (a) 간 특이적 마커 (HNF4A, AFP, ALB, CYP7A1)의 발현, (b) 세포 당 albumin, (c) 세포 당 urea의 분비량을 비교한 결과이다.
도 35는, 본 발명에 따른 직접교차분화용 3차원 지지체를 이용한 간세포로의 직접교차분화에서, Bi-directional flow 또는 HUVEC과 공배양에 따른 albumin 발현을 면역염색을 통하여 비교한 결과이다.
도 36은, Bi-directional flow 또는 HUVEC과 공배양에 따른 (a) 세포당 urea 분비량, (b) 세포당 albumin 분비량, (c) CYP3A4A의 활성도를 비교한 결과이다.
도 37은 (a) Rifampicin, 또는 (b) Verapamil 처리에 따른 CYP3A4A의 활성도를 비교한 결과이다.
도 38은, Bi-directional flow 또는 HUVEC과 공배양에 따른, (a) F-actin 및 vinculin, (b) E-cadherin, (c) Caspase-3 발현을 비교한 결과이다.
도 39는, 미세유체 장치 내 조건 및 하이드로겔의 차이에 따른 albumin의 발현을 면역염색을 통하여 비교한 결과이다.
도 40은, 본 발명에 따른 직접교차분화용 3차원 지지체에서 유도된 유도간세포 및 HUVEC 세포로 이루어진 세포 덩어리를 이용하여 약물에 대한 간 독성평가를 실시한 것으로서, (a) Acetaminophen 및 (b) Alcohol 처리에 따른 세포 사멸의 정도를 확인한 결과이다.
도 41은, 본 발명에 따른 직접교차분화용 3차원 지지체에서 유도된 유도간세포 및 HUVEC 세포로 이루어진 세포 덩어리를 이용하여 간 이식을 실시한 것으로서, DiI 형광 분포를 통하여 이식된 세포의 분포를 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 생체로부터 분리된 조직 유래의 세포외 기질 (Extracellular matrix, ECM)을 포함하는, 직접교차분화 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "직접교차분화 (Direct lineage reprogramming, Direct conversion, Transdifferentiation)"는 전혀 다른 세포 타입을 가지는 성체 세포간 전환을 유도하는 기술로서, 유도만능줄기세포를 제조하는 단계 없이 바로 목적하는 세포로의 전환을 유도한다는 점에서 종래의 기술과 차이가 있다. 현재 직접 교차분화 기술은 질병 모델링, 신약 발굴, 유전자 치료, 및 재생 의학 분야 등에서 이용 가능성을 인정받고 있으며, 이를 이용한 뇌신경 질환 치료에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있으나, 분화 효율이 높지 않아 실질적인 임상에 적용함에 어려움을 겪고 있다. 또한, 직접교차분화를 통한 생체 내 교차분화 적용은 임상적으로 상당한 의미를 가짐에도, 적절한 유도방법의 부재로 인해 상용화에 문제가 있었다. 직접교차분화 기술과는 다소 차이가 있으나, 줄기세포의 분화와 관련하여, 종래에는 화학물질 (Poly L-lysine, Poly L-ornithine)이나 세포외 기질의 일부 성분 (fibronectin, collagen)을 이용한 표면 코팅 기술, 또는 콜라겐이나 메트리겔 기반의 하이드로겔을 사용하여 왔다. 그러나 이들 역시 세포의 생존율, 분화능, 및 기능성을 향상시키는데 어려움을 겪고 있는 실정이다. 이에, 본 발명은 생체로부터 분리된 조직 유래 세포외 기질을 이용하여 조직 특이적인 미세환경을 모사함으로써 직접교차분화의 효율을 향상시키고자 하였다.

본 발명에서 사용되는 용어, "세포외 기질"은 조직내 또는 세포외의 공간을 채우고 있는 생체 고분자의 집합체로서, 교원질, 탄력소 등의 섬유성 단백질, 프로테오글리칸, 클리코사미노글리칸 등의 복합단백질, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴 등의 세포 부착성 당단백질 등 함유하는 것으로 알려져 있다. 한편 본 발명에서, 조직 유래의 세포외 기질은 탈세포화 용액 등과 같이 당업계에서 널리 알려진 탈세포화 기술을 통하여 수득될 수 있으며, 상기 조직은 세포외 기질 성분을 함유하는 모든 생체 조직을 대상으로 할 수 있으나, 본 발명의 목적상, 상기 조직은 뇌 또는 간 조직일 수 있다.

또한 본 발명에 따른 조성물은 직접교차분화를 위한 기질 표면을 갖는 배양용기 또는 3차원 지지체에 적용하기 위하여, 세포외 기질을 용해물 형태로 포함할 수 있다. 한 구체 예로서, 상기 탈세포화된 세포외 기질을 동결 건조시킨 후, 펩신 용액 등을 이용하여 용해물을 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 본 발명에 따른 조성물에 포함되어 있는 세포외 기질에는, collagen, fibronectin과 같은 세포외 기질 단백질 성분뿐만 아니라, 다양한 지질 성분들도 함께 포함되어 있는바, 상기 세포외 기질이 과량이 함유될 경우, 조성물 전체의 친수성이 저하되고, 이에 따라 세포의 부착성이 감소되어 직접교차분화 효율의 저하 요인으로 작용될 우려가 있다. 따라서 본 발명의 주요 목표인 생체조직 모사 환경 조건을 제공함과 동시에, 상기 지질 성분에 의한 직접교차분화 효율의 저하를 최소화시킬 수 있는 적정 농도의 세포외 기질을 사용하여야 하며, 상기 적정 농도는 바람직하게, 직접교차분화용 배양용기 표면을 코팅함에 있어서, 0.005 내지 0.03mg/ml, 보다 바람직하게 0.007 내지 0.02mg/ml, 직접교차분화용 3차원 지지체에 있어서는, 4 내지 16mg/ml일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물로 코팅된 직접교차분화용 배양용기; 및 상기 조성물 및 하이드로겔을 포함하는 직접교차분화용 3차원 지지체를 제공한다.

본 발명에 따른 직접교차분화용 배양용기는, 전사인자가 도입된 체세포가 부착되어 배양 및 직접교차분화될 수 있는 표면을 제공하며, 특히, 상기 표면은 세포외 기질 성분으로 코팅되어 있는바, 이러한 구성을 통해 생체조직 모사 환경 조건 속에서 직접교차분화의 효율을 향상시킬 수 있다.

본 발명에 따른 직접교차분화용 3차원 지지체는, 전사인자가 도입된 체세포가 담지되어 배양 및 직접교차분화될 수 있는 공간을 제공하며, 상기와 마찬가지로, 하이드로겔 내 세포외 기질 성분은 직접교차분화 효율을 향상시키는데 크게 기여할 수 있다. 상기 하이드로겔은 콜라겐 등 다양한 생체적합성 고분자로 이루어질 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 신경세포로의 직접교차분화에 있어, 뇌 조직에 다량 존재하는 것으로 알려진 히알루론산으로 이루어진 겔을 이용할 수 있다.

한편, 본 발명의 또 다른 양태로서, 생체로부터 분리된 조직 유래의 세포외 기질을 포함하는 직접교자분화용 배양용기 또는 3차원 지지체에서, 전사인자가 도입된 체세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 신경 또는 간세포로의 직접교차분화방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "체세포"는 분화가 일어난 세포로서, 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 능력을 말하는 다분화능을 완전히 소실하거나 대부분 소실한 상태의 세포를 의미하며, 섬유아세포 및 기타 신경 또는 간세포를 제외한 모든 체세포일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "신경세포"는 도파민 신경세포, 가바 신경세포, 글루탐 신경세포, 척수신경 세포, 및 모든 종류의 신경세포를 의미하며, 뇌 또는 척추 등에 위치하여 신경계를 구성하는 세포라면, 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, 간세포는 간소엽을 구성하는 세포로서, 유해 물질을 분해하고, 알부민, 혈액 응고인자, 보체 등의 여러 종의 혈청 단백질과 빌리루빈 등을 생산하는 기능을 가진 세포로서, 간 조직에 이식하여 이러한 기능들이 향상될 수 있는 세포라면, 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "전사인자"는 직접교차분화를 유도하는 인자로서, 신경세포로의 직접교차분화를 유도하는 인자는 바람직하게는 Lmx1a, Nurr1, Lhx3, Hb9, Isl1, Ngn2, Sox2, Foxg1, Zic1, Olig2, Foxa2, Brn2, Ascl1, 및 Myt1l로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 간세포로의 직접교차분화를 유도하는 인자는 HNF1a, HNF4a, Foxa3, Gata4, Foxa1, 및 Foxa2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이러한 전사인자들은 바이러스 또는 비바이러스성 전달체 등 당업계에 널리 알려진 방법을 통해서 체세포에 도입될 수 있으며, 한 구체예로서, 전기천공법, 또는 비바이러스성 전달체인 PBAE 고분자 기반 나노파티클 전달체 (C32-122 poly(beta-amino) esters)를 이용할 수 있으나, 이 역시 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명에 따른 직접교차분화 방법은 다양한 형태로 응용될 수 있다. 한 구체예로서, 본 발명의 직접교차분화용 배양용기의 표면은 상기 직접교차분화용 조성물이 코팅된 나노패턴 구조의 표면을 포함할 수 있고 (도 18참조), 미세유체 장치 (도 20c 참조)를 이용하여 생체조직과 더욱 유사한 조건을 제공할 수 있다. 한 구체예로서, 상기 미세유체 장치는 상기 직접교차분화용 3차원 지지체 및 전사인자가 도입된 체세포가 로딩되는 배양채널; 및 신경 또는 간세포 분화를 유도하는 배지 등을 함유하는 리저버로 이루어지며, 이들은 유체적 상호작용이 가능한 미세관으로 연결되어 미세 환경 조건을 세포에 제공할 수 있다.

또 다른 구체예로서, 상기 방법은 전술한 조성물과 함께, 세포의 부착 (adhesion) 및 수축 (contractility)과 같은 기계적 특성 변화에 의해 특정 신호전달체계 활성화를 조절하는 물질, 즉, 기계역학신호전달 (mechanotransduction)을 조절하는 물질을 첨가함으로써, 직접교차분화 효율을 보다 향상시킬 수 있다. 상기 기계역학신호전달을 조절하는 물질은, 바람직하게 배양 조건의 기계적 물성을 감소시키는 물질, 예를 들어, Y27632 또는 blebbistatin일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

따라서, 본 발명의 직접교차분화 방법에 상기와 같은 추가적 기술 요소와 접목시킴으로써, 직접교차분화 효율을 보다 증진시킬 수 있다.

한편, 본 발명의 또 다른 양태로서, 상기의 방법으로 직접교차분화된 신경 또는 간 세포를 포함하는, 세포 치료제를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 세포 치료제의 투여에 의해 뇌신경 질환 또는 간 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "세포 치료제"는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다.

한편, 본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 조성물 또는 세포 치료제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌신경 질환 또는 간 질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명에서, "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 탈세포화 처리에 의한 세포외 기질을 함유하는 조성물의 제조

본 실시예에서는, 도 1에 도시한 과정에 따라 직접교차분화 촉진을 위한 성분으로서, 탈세포화된 뇌 조직 유래 기질을 포함하는 조성물을 제조하였다. 구체적으로, 뇌 조직에 탈세포화 용액을 순차적으로 처리하여 뇌 조직 내 세포 성분을 제거하였다. (0.05% Trypsin/EDTA [Gibco, Gaithersburg, MD, USA] 90분; 3% (v/v) Triton-X 100 [Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan] 2시간; 1M sucrose [Sigma, St. Louis, MO, USA] 30분; 3% sodium deoxycholate [Sigma] 1시간; 4% ethanol [Sigma] 2시간; phosphate buffered saline [Sigma] 15분) 이후, 상기 뇌 조직을 증류수로 세척하여 잔존하는 탈세포화 용액을 제거하였으며, 페니실린/스트렙토마이신을 이용한 멸균과정을 거친 후, 감압 동결 건조하여 사용 전까지 보관하였다. 상기 감압 동결 건조시킨 뇌 조직 유래 세포외 기질을 입자 형태로 분쇄하고, 상기 분쇄물에 펩신을 함유하는 염산 용액을 첨가하여 뇌 조직 유래 세포외 기질 용해물 (세포외 기질의 농도: 40mg/ml, 펩신 농도: 4mg/ml, 염산의 농도: 0.01M)을 제조하였다. 한편, 간 조직 유래 세포외 기질 용해물은 탈세포화 용액으로 1% (v/v) Triton-X 100 [Wako Pure chemical industries, Osaka, Japan] 및 0.1%(v/v) 수산 화암모늄[Sigma]을 이용하여 상기와 동일한 과정을 통하여 제조하였다.

한편, 상기의 제조과정 중 탈세포화 처리에 따른 뇌 조직의 변화를 육안, H&E (Hematoxylin &eosin) 염색, 및 DNA 함량 변화 측정 등을 통하여 비교하였다. 또한 Q-TOF mass spectrometry를 실시하여 탈세포화 처리 후 뇌 조직 내 존재하는 단백질의 분포를 Unused protein score (펩타이드 분포 수치의 합)를 통해 비교하였으며, 단백질외 다른 성분들의 존재 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 탈세포화 처리 후, 세포 성분이 제거되어 투명한 상태가 되었음을 확인할 수 있었다 (도 2a 참조). 또한 뇌 조직 내 존재하는 세포 핵과 DNA 함량이 현저하게 감소된 반면 (도 2b 및 도 2c 참조), 글라이코사미노글리칸 (GAG)의 함량은 큰 차이를 보이지 않았는바, 상기 탈세포화 과정을 통하여 대부분의 세포 성분은 제거되었으나, 세포외 기질 성분은 여전히 보존되어 있음을 알 수 있었다 (도 2d 참조). 아울러 도 3에 나타낸 바와 같이, 세포외 기질을 구성하는 단백질로 알려진, collagen, fibronectin 등이 다량 검출되었으며 (도 3a 참조), 이러한 성분들 외에도 glycerophosphocholines (PC), glycerophosphoethanolamines (PE), glycerophosphoglycerols (PG), 및 cholesterol (Cho) 등의 지질 성분이 다량 존재함을 확인할 수 있었다 (도 3b 참조).

실시예 2. 탈세포화 세포외 기질 기반의 이차원 표면 코팅 및 특성 분석

직접교차분화를 촉진시킬 수 있는 기질 표면을 제공하기 위하여, 상기 실시예 1의 용해물을 아세트산 (AcOH. 0.02M)로 상기 세포외 기질의 농도가 0.005-0.1mg/ml가 되도록 희석하였다. 이후, 상기 희석된 용액을 처리하여 플레이트를 코팅한 뒤, PBS 용액으로 세척하여, 탈세포화 세포외 기질을 함유하는 직접교차분화용 플레이트 (이하, 직접교차분화용 배양용기이라 명명함.)를 제조하였다(BEM coating). 이후, 상기 방법에 의해 제조된 직접교차분화용 배양용기에서, 세포외 기질 성분의 표면 코팅에 따른 원자 화학적 변화를 확인하기 위하여, 표면 원소분석 (X-ray Photoelectron Spectroscopy, XPS)을 실시하였으며, 일정 부피의 물방울을 코팅된 표면에 떨어뜨린 뒤, 이의 수분 접촉 각도를 측정하여 배양용기의 표면 친수성 표면 친수성 (hydrophilicity)을 평가하였다. 또한, 신경세포의 부착에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 Laminin을 면역염색을 통해 검출하였으며, 기질 표면을 주사전자현미경 (Scanning Electron Microscope, SEM)으로 관찰하여 부착 물질의 존재 여부를 확인하였다. 한편, 대조군으로 코팅을 실시하지 않은 군 (No coating), 비교군으로 신경세포 배양에 널리 사용되고 있는 poly L-lysine으로 코팅된 군 (PLL coating)을 이용하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 직접교차분화용 배양용기는 코팅을 실시하지 않은 대조군과 달리, C1s 및 N1s peak의 변화가 관찰되어 신경세포 배양에 널리 사용되고 있는 비교군과 유사한 경향을 보였으며 (도 4a 참조), 수분 접촉 각도는 56.9로서, 표면의 친수성 성질도 큰 변화를 보이지 않음을 알 수 있었다 (도 4b 참조). 또한 도 5에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 비교군에서 거의 검출되지 않았던, Laminin이 표면이 고르게 존재하였으며 (도 5a 참조), 이에 따른 부착 물질의 존재를 확인할 수 있었다 (도 5b 참조).

이러한 결과로부터, 세포외 기질 성분이 코팅된 본 발명의 기질 표면은, 종래 기질 표면의 친수성 성질이 유지되는바, 본 발명은 기질 표면과 접촉하는 과정을 포함하는 직접교차분화 기술 분야에도 적용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3. 탈세포화 세포외 기질 기반의 하이드로겔 및 특성 분석

상기 실시예 2의 2차원 배양뿐만 아니라, 직접교차분화를 촉진시킬 수 있는 3차원 배양 조건을 제공하기 위하여, 상기 실시예 1의 용해물을 증류수로 희석시킨 PBS 및 콜라겐 Ⅰ과 혼합하여 탈세포화 세포외 기질을 함유하는 직접교차분화용 하이드로겔 (이하, 직접교차분화용 3차원 지지체라 명명함.)을 제조하였다 (BEM). 구체적으로, 상기 실시예 1의 용해물과, 콜라겐 Ⅰ 용액을 증류수, 10X PBS와 혼합하여, 최종적으로 혼합물 내 세포외 기질; 8mg/ml, PBS; 1X, 콜라겐 Ⅰ; 2mg/ml가 되도록 하였다. 혼합물 내 pH는 pH 7.4로 조절한 후, 37℃에서 30분간 배양하였다. 한편, 간 조직 유래 세포외 기질 기반의 하이드로겔의 경우, 콜라겐 Ⅰ과의 혼합없이, 세포외 기질 용해물만으로 제조하였다.

이후, 상기 방법에 의해 제조된 직접교차분화용 3차원 지지체의 내부구조를 주사전자현미경 (SEM)을 통하여 관찰하였으며, 0.1-1 Hz의 주파수 (frequency) 범위에서의 탄성계수 (Elastic modulus), 및 점성계수 (Viscous modulus)를 회전형 유량계로 측정하여 직접교차분화용 3차원 지지체의 기계적 특성을 확인하였다. 한편, 비교군으로 콜라겐 Ⅰ만으로 이루어진 하이드로겔 (Col)을 이용하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 직접교차분화용 3차원 지지체는 콜라겐 나노섬유 구조로 이루어져 있었으나, 비교군과 달리, 상기 나노섬유 상, 생체 조직과 유사한 환경을 제공할 수 있는 특유의 가로 줄무늬(striation)가 관찰되었으며 (도 6a 참조), 기계적 특성을 확인한 결과, 액체상을 나타내는 점성계수에 비해 고체상을 나타내는 탄성계수가 모든 주파수 영역에서 높게 관찰되었는바, 상기 콜라겐 성분과 세포외 기질 성분이 중합되어, 안정적으로 하이드로겔을 형성하였음을 알 수 있었다 (도 6b 참조).

이러한 결과로부터, 세포외 기질 성분을 함유한 본 발명의 하이드로겔은, 균질한 조성으로 제조될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 효율적으로 생체 조직 모사 환경을 제공할 수 있었는바, 본 발명은 조직 특이적인 미세 환경이 큰 영향을 미치는 직접교차분화 기술 분야에 적용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4. 직접교차분화용 배양용기를 이용한 신경세포로의 직접교차분화

본 실시예에서는, 뇌 조직 유래 세포외 기질을 함유하는 poly L-lysine (PLL) 용액으로 코팅된, 직접교차분화용 배양용기 (PLL-BEM)를 이용하여 마우스의 섬유아세포에서 신경세포로의 직접교차분화를 유도하였다. 구체적으로, 도 7에 나타낸 바와 같이, PMEF 배지 (DMEM, 10% FBS, 1% P/S)에 배양된 섬유아세포에 BAM-encoding plasmid를 전기천공법을 통하여 전달하고, 이로부터 3일 후, 상기 PMEF 배지를 신경세포 유도용 배지 (DMEM/F12, N2 supplement, 10ng/ml bFGF, 10ng/ml EGF)로 교체하여 배양하였다.

4-1. 신경세포로의 직접교차분화 효율 및 유도신경세포의 성숙도 증진 효과 확인

섬유아세포에 BAM-encoding plasmid를 전달한 후 10-12일째, 세포외 기질의 농도 (0.01, 0.05, 0.1 mg/ml)에 따른 초기분화 관련 유전자 (Sox2, Nestin, Tuj1)의 발현 변화를 qRT-PCR을 통하여 분석하였으며, 상기와 마찬가지로, neurosphere-like cluster 형성여부, 및 신경 특이적 마커인 Tuj1+ 세포수를 비교하였다. 비교군으로는 PLL 용액으로만 코팅한 군 (PLL), Laminin을 함유하는 PLL 용액으로 코팅한 군 (PLL-LN)을 이용하였다.

한편, 유도신경세포의 성숙도 증가여부를 평가하기 위하여, 신경세포 유도용 배지에서 배양한지 14일째, 세포외 기질의 농도 (0.005, 0.01 mg/ml)에 따른 Nestin, Tuj1, 및 MAP2의 발현 변화를 면역염색 및 qRT-PCR을 통하여 분석하였으며, 신경돌기 (Neurite)의 평균 길이를 비교하였다. 상기와 마찬가지로, 비교군은 PLL군 및 PLL-LN 군을 이용하였다. 또한, 신경세포 유도용 배지에서 배양한지 30일째, PLL-LN 군 및 PLL-LN+FN 군 (상기 PLL-LN 용액에 fibronectin이 첨가됨)과 본 발명에 따른 PLL-BEM (0.01) 군들간 mature neuronal marker인 Synapsin I+, Tuj1+ 세포의 분포를 면역염색을 통하여 비교하였으며, Nestin, Tuj1, 및 MAP2의 발현을 qRT-PCR을 통하여 비교하였다.

그 결과, 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, PLL-LN 군과 비교하여, 0.01 mg/ml의 뇌 조직 유래 세포외 기질을 함유하는, PLL-BEM (0.01)으로 코팅한 군에서, Sox2, Nestin, Tuj1 유전자의 발현이 현저하게 증가되었으며 (도 8a 참조), 이에 따른 neurosphere-like cluster 형성을 확인할 수 있었다 (도 8b 참조). 또한, 상기 결과와 마찬가지로, Tuj1+ 세포 수를 면역염색을 통해 산출한 결과, PLL-BEM (0.01)으로 코팅한 군에서 가장 많은 수의 Tuj1+ 세포가 관찰되었으며, 그 이하의 농도 (0.005 mg/ml)에서는, 오히려 PLL-LN 군보다도 적은 수의 Tuj1+ 세포가 관찰되었다 (도 9 참조). 즉, 본 발명의 탈세포화된 뇌 조직 유래 세포외 기질에는 collagen, fibronectin 등의 단백질과 함께 지질 성분을 포함하고 있는바, 과량의 농도가 함유될 경우, 상기 실험 결과로부터 알 수 있듯이, 부착성과 관련된 친수성 성질을 감소시켜 직접교차분화 효율을 저하시킬 수 있으며, 이와 반대로, 극히 소량의 농도가 함유될 경우, 생체조직 모사 환경 조건을 제공함에 미흡할 우려가 있는바, 적정 농도 (0.01mg/ml)의 세포외 기질은 본 기술에서 중요한 요소로 작용함을 확인할 수 있었다.

또한, 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, PLL-BEM (0.01)으로 코팅한 군에서, Tuj1와 MAP2의 발현이 가장 높게 관찰되었고 (도 10 참조), 신경돌기 길이 역시 가장 길게 측정되었다 (도 11 참조). 아울러, PLL-BEM (0.01)으로 코팅한 군은, 세포외 기질 단일 성분을 포함한 PLL-LN 군뿐만 아니라, 세포외 기질 복합 성분을 포함한 PLL-LN+FN 군에 비해서도 Synapsin I+, Tuj1+ 세포가 다량 관찰되었으며, early neuronal marker인 Nestin 발현은 가장 적고, later neuronal marker인 Tuj1과 MAP2 발현은 가장 높게 관찰되었는바 (도 12 참조), 본 발명에 따른 뇌 조직 유래 세포외 기질 성분은 세포외 기질 단일 또는 복합 성분에 비해 유도신경세포의 분화도 및 성숙도를 더욱 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.

4-2. 유도신경세포의 전사체 발현 및 전기생리학적 기능 분석

섬유아세포 (PMEF), Laminin 코팅 표면에서 직접교차분화된 유도신경세포 (iN-LN) 및 본 발명의 직접교차분화용 배양용기에서 직접교차분화된 유도신경세포 (iN-BEM)에 대한 대사체 발현 분석을 통해 이들간 특성을 분석하였다. RNA-sequencing을 통해 상기 세포들의 유전자 발현 프로파일을 비교하였으며, gene ontology (GO) category 분석을 기초로 iN-BEM과 iN-LN간 신경세포 특이적인 유전자의 발현 양상을 비교하였다.

또한, 상기 3-1의 실시예에서 가장 우수한 효과를 보였던 BEM (0.01) 군에서 장기간 (30일 동안) 직접교차분화시킨 유도신경세포들의 전기생리학적 기능을 패치클램프 분석을 실시하여 확인하였다.

그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 직접교차분화된 유도신경세포 (iN-LN, iN-BEM)는 비슷한 발현 프로파일을 나타내는 반면, 이들은 섬유아세포 (PMEF)와는 명백히 다른 양상을 보였다 (도 13a). 또한, 상기 유도신경세포 (iN-LN, iN-BEM)에서, synapse part, synapse, neuron projection, neuron differentiation 등 신경세포 특이적인 마커의 발현이 크게 증가하였으며, 이들 중 다수의 마커들은 본 발명에 따른 iN-BEM에서 가장 높게 관찰되었다 (도 13b).

또한, 도 14에 나타낸 바와 같이, 배양 기간 (14일, 21일, 30일)에 따라 Rest membrane potential (RMP) 값이 낮아지는바, 세포의 막 성숙도가 점차 향상되었으며 (도 14a 참조), 전압-클램프 또는 전류-클램프 상태에서, 활동 전위 및 전압개폐성 나트륨채널에 의한 전류 생성을 확인하였고, Na+ channel 차단제인 TTX (Tetrodotoxin) 처리에 따른 활동 전위와 나트륨 채널에 의한 전류가 사라짐을 확인할 수 있었다 (도 14b 및 도 14c 참조). 아울러, Post-synaptic current 및 PiTx 처리에 의한 current의 감소가 관찰되었고, PiTx와 CNQX (6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione)을 동시에 처리하였을 때, current가 완전히 소실되었는바, excitatory 및 inhibitory population이 존재함을 알 수 있었고 (도 14d 참조), calcium imaging을 통해 glutamate neurotransmitter에 대한 반응성을 확인하였다 (도 14e 참조).

4-3 뇌졸중 동물모델을 이용한 유도신경세포의 치료효과 확인

BEM (0.01) 군에서 30일간 배양하여 직접교차분화시킨 유도신경세포를 Brain acute ischemic injury 마우스 모델의 striatum과 cortex 부위에 이식한 뒤, 유도신경세포의 이식여부 및 이에 따른 치료효과를 확인하고자 하였다 (도 15 참조). 상기 질병이 유발된 마우스 모델에 이식하기 전, 세포를 DiI 형광 염색을 처리하여 이식된 유도신경세포의 tracking이 가능하도록 처리하였다.

구체적으로, 유도신경세포를 이식한 후 7일째, DiI 형광 분포를 통하여 이식된 세포의 분포를 확인하였으며, DiI+ BrdU+ 세포 및 DiI+ Tuj1+세포의 분포를 통하여 이식된 세포의 특성을 확인하였다. 또한 유도신경세포 이식에 따른 뇌졸중의 치료효과를 확인하고자 Rotarod test (이식 14일, 28일째, 및 56일째), Ladder walking test (이식 56일째), 및 Grip strength test (이식 56일째)를 통하여 신경행동학적 분석을 실시하였다. 한편, 상기 신경행동학적 분석에서의 비교군으로 PBS를 투여한 군 (PBS)을 이용하였다.

그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 유도신경세포를 이식한지 7일이 경과한 후에도 대부분의 세포가 이식한 부위에 존재함을 확인할 수 있었으며 (도 16a 참조), 일부 population에서 DiI+ BrdU+ 세포 및 DiI+ Tuj1+세포가 관찰되었는바, 이식된 세포 중 일부는 증식하며, 이들은 병변 부위의 신경 발생 (neurogenesis)에 관여함을 알 수 있었다 (도 16b 및 도 16c 참조).

한편, 도 17에 나타낸 바와 같이, 유도신경세포가 이식된 마우스의 신경행동학적 특성을 확인한 결과, 비교군에서 비해, 이식한지 4주가 경과한 시점부터, 트레드밀에서 바닥으로 떨어지는데 소요되는 시간이 현저하게 증가되었다 (Rotarod test; 도 17a 참조). 또한 상기 결과와 마찬가지로, 비교군에서 비해, 사다리에서 slip되는 비율의 감소 및 grip strength의 증가를 확인할 수 있었는바, 본 발명에 따른 직접교차분화된 유도신경세포를 이식함으로써, 뇌졸중 동물모델의 운동능력이 향상되거나 보존됨을 알 수 있었다 (Ladder walking test; 도 17b, Grip strength test; 도 17c).

4-4. 나노패턴 구조를 포함하는 직접교차분화용 배양용기를 이용한 직접교차분화

본 발명에 따른 직접교차분화용 배양용기의 다른 형태로서, 300-300nm groove/ridge 나노패턴 구조로 이루어진 기질 표면을 포함하는 직접교차분화용 배양용기를 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 본 발명의 세포외 기질 성분을 이용하여 코팅하였다. 이후, 상기와 마찬가지로 섬유아세포를 직접교차분화시켜 유도신경세포를 제조하였으며, 이에 따른 신경세포 특이적 마커인 Tuj1의 발현을 확인하였다. 한편, 비교군으로는, 나노패턴 구조를 포함하지 않는 일반적인 기질 표면을 포함하는 직접교차분화용 배양용기를 이용한 군 (No pattern)을 이용하였다.

그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, BEM 코팅이 나노패턴 구조로 이루어진 기질 표면에 적용될 경우 (300-300nm nanopattern), 표면 구조로 인한 자극(topographical stimulation)과 함께 뇌조직 특이적 미세환경 제공함으로써, 직접교차분화 효율이 증진됨을 알 수 있었다.

4-5. Tail-tip fibroblast 세포부터 유도신경세포로의 직접교차분화

본 발명에 따른 직접교차분화용 배양용기를 이용하여 태아 유래 섬유아세포 (MEF)외에도, 성체 쥐 유래 꼬리 섬유아세포 (tail-tip fibroblast, TTFs)로부터 유도신경세포로의 직접교차 분화가 가능한지 여부를 확인하고자 하였다. 상기 도 7에 나타낸 과정과 동일한 방법을 통해 직접교차분화를 유도하였으며, 이후, 면역염색을 통하여 신경세포 특이적 마커인 Tuj1 및 NeuN의 발현 변화를 측정하여 평가하였다.

그 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, 분화능이 완전히 상실된, 성체 쥐-유래 꼬리 섬유아세포에 본 발명의 방법을 적용한 경우에도, Tuj1 및 NeuN의 발현이 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 본 발명에 따른 직접교차분화 기술은 분화능의 잔존 여부에 관계없이 다양한 종류의 피부세포에 적용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 5. 직접교차분화용 3차원 지지체를 이용한 신경세포로의 직접교차분화

본 실시예에서는, 상기 실시예 3의 뇌 조직 유래 세포외 기질을 함유하는 하이드로겔 (직접교차분화용 3차원 지지체) 및 미세유체 장치 (Microfluidic device)를 이용하여 마우스의 섬유아세포에서 신경세포로의 직접교차분화를 유도하였다. 구체적으로, 도 20a에 나타낸 바와 같이, 전기천공법 (day 0), 및 PBAE (poly(beta amino ester)) 고분자 나노파티클 기반 유전자 전달체 (day 2)를 이용하여 2회에 걸쳐 BAM factor 유전자를 섬유아세포에 전달하였으며, 이로부터 4-5일 후, 세포를 수거하고, 본 발명의 3차원 지지체 (BEM겔)에 세포를 봉입 (encapsulation) 시켰다. 이후, 상기 봉입된 세포를 미세유체 장치의 channel 내부에 채운 뒤, 상기 channel과 연결된 챔버를 통해 신경세포 유도용 배지를 세포에 공급함으로써, 미세 환경 조건 하에서 3차원 배양하였다.

5-1. 미세 환경 조건 변화에 따른 직접교차분화 효율 비교

본 발명에 따른 직접교차분화시스템은 실제 뇌 조직의 미세환경을 효율적으로 모사하였다는 점에 기술적 특징이 있는바, 이러한 효과를 구체적으로 확인하고자 다양한 비교군을 설정하여 직접교자분화에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 세포 내 transcription의 지표이자 직접교차분화에서 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 알려진, H3K4me3 히스톤 변형 정도를 비교하였고, 신경 특이적 마커인 Tuj1의 발현량 및 ChiP assay를 통해 H3K4me3 또는 H3K27Ac 단백질이 상기 Tuj1 유전자의 프로모터에 결합하는 정도를 확인하였다. YAP 발현은 세포가 부착 및 배양되는 조건의 기계적 물성 (강도 등)에 의해 영향을 받는다고 알려져 있다. 구체적으로, 높은 기계적 물성의 조건에서 부착 및 배양되는 경우 YAP이 주로 핵 내에서 발현되고 이는 세포의 자가복제을 위한 신호를 활성화시키는 반면, 낮은 기계적 물성의 조건에서 부착 및 배양되는 경우에는 YAP이 주로 세포질 내에서 발현되고 이는 세포의 분화를 위한 신호 활성화에 기여한다고 알려져 있다. 이러한 사실에 기초하여, 미세환경 조건 변화에 따른 유도신경세포 내 YAP의 발현 위치를 면역 염색을 통해 확인하였다. 한편, 본 실시예에서의 비교군은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다 (도 20b 참조).

그 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이, 2D BEM 및 3D Col 배양 환경과 비교하여 3D BEM 배양 조건에서 유도신경세포의 분화가 더욱 촉진되었음을 확인하였으며 (도 21a 및 도 21b 참고), ChIP 후성유전학 분석을 통해 3D BEM 배양 환경에 의해 유도신경세포 내 Tuj1과 H3K4me3 또는 H3K27Ac의 결합이 크게 증진됨을 알 수 있었는바 (도 21c 참조), 본 발명에 따른 3D BEM 조건은 신경세포로의 직접교차분화를 증진시킬 수 있음을 보여주는 것이다. 또한, 도 22에 나타낸 바와 같이, 2D BEM으로 코팅된 표면 배양 조건에서는 YAP의 핵 내 발현이 크게 상승하였던 반면, 3D 하이드로젤 배양 조건 (3D Col, 3D BEM)에서는 YAP이 주로 세포질에서 발현되는 것을 확인하였다 (도 22a 및 도 22b 참조). 따라서, 신경세포의 직접교차분화를 증진시키기 위한 미세환경 조건으로서 3D 배양 조건의 필요성을 재차 확인할 수 있었다.

아울러, 세포의 엑토미오신 수축 기능과 연관된 기작을 저해하는 물질 (Y-27632 (Rho-kinase inhibitor) 또는 blebbistatin (myosin-II activity inhibitor))을 처리하고 YAP의 발현 위치를 분석하였다. 그 결과, 도 23에 나타낸 바와 같이, 3D Col과 3D BEM 군은 저해 물질의 처리 전 후, 큰 차이를 보이지 않았던 반면, 2D BEM 군에서는 저해 물질 처리에 따라 YAP의 핵 내 발현이 크게 감소하였다. 이러한 결과는 2D BEM 군의 경우, Y27632 또는 blebbistatin의 처리에 의해 배양 조건의 기계적 물성 (mechanical signaling)이 감소하여, 세포의 분화를 위한 신호가 활성화되는 조건으로 전환되었음을 의미한다. 한편, 5 uM 농도의 Y27632 또는 blebbistatin를 처리한 경우 모든 군에서 tuj1 mRNA 발현 변화는 미미하였으나, 10 uM 농도의 Y27632을 처리한 경우에는 2D BEM 군에서 tuj1의 발현이 유의적으로 증가하였고, 15 uM 농도의 blebbistatin를 처리한 경우에는, 2D BEM 군 뿐만 아니라 3D Col과 3D BEM 군에서도 tuj1의 발현이 유의적으로 증가함을 알 수 있었다. 즉, 배양 조건에서 기계적 물성의 감소는 직접교차분화 효율의 증진으로 이어질 수 있으며, 이러한 효과는 처리 물질의 농도에 따라, 2D 및 3D 배양 조건 모두에서 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 미세환경의 변화에 따라, 세포 전환 과정과 관련된 세포의 후성 유전학적 특징 (epigenetic) 및 기계역학 신호전달 (mechanotransduction)을 조절하여 직접교차분화 효율을 더욱 증진시킬 수 있음을 알 수 있었다.

5-2. 미세 유체 장치에서의 배양에 따른 직접교차분화 효율 비교

미세유체 장치에서 배양한 후 8-10일째, 세포외 기질 함유에 따른 NeuN, Tuj1, 및 MAP2의 발현 변화를 면역염색을 통해 비교하였으며, Nestin, Tuj1, 및 MAP2의 발현 변화를 qRT-PCR을 통하여 분석하였다 (3Dμ BEM). 이 밖에도, 이들간 신경돌기의 평균 길이, 신경 특이적 마커인 Tuj1+ 세포 수, 및 glutamate neurotransmitter에 대한 반응성을 비교하였다. 비교군으로는 세포외 기질 성분이 함유되지 않은 콜라겐겔로 봉입한 뒤, 상기와 같이 3차원 배양시킨 군 (3Dμ Col)을 이용하였다.

우선, 도 24에 나타낸 바와 같이, 하이드로겔로 봉입하여 3차원 환경 조건 하에서 배양하는 경우, H3K4me3의 발현이 보다 증진되었으며, 세포외 기질을 포함하는 본 발명의 BEM 겔과 미세유체 장치를 함께 이용한 경우 (3Dμ BEM), 이러한 효과가 더욱 우수함을 확인할 수 있었다.

또한, 도 25 및 도 26에 나타낸 바와 같이, 3Dμ Col 군과 비교하여, 본 발명에 따른 뇌 조직 유래 세포외 기질을 함유하는 직접교차분화용 3차원 지지체에서 3차원 배양된 군 (3Dμ BEM)에서, NeuN, Tuj1, 및 MAP2 유전자의 발현이 현저하게 증가되었으며 (도 25 참조), Nestin, Tuj1, 및 MAP2 유전자의 발현을 정량화하여 비교한 결과, 3Dμ BEM 군의 발현량은 3Dμ Col 군에 비해 유의적으로 높게 관찰되었다 (도 26 참조). 또한, 상기 결과와 마찬가지로, 3Dμ BEM 군은 신경돌기의 평균 길이 및 Tuj1+ 세포 수에 있어 가장 길거나 다량 관찰되었으며 (도 27a 및 도 27b 참조), glutamate neurotransmitter에 대한 반응성도 우수하였다 (도 27c 참조). 이러한 결과로부터, 미세 유체 장치를 이용한 3차원 배양 하에서도, 세포외 기질 성분을 함유함으로써, 신경세포로의 직접교차분화가 촉진됨을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명에 따른 직접교차분화 시스템은 뇌 조직 유래 세포외 기질 성분을 함유하여 뇌 조직 특이적 환경을 제공할 뿐만 아니라, 이와 함께, 미세유체 장치를 이용하여 신경 세포 배양을 위한 미세 환경 조건을 제공함으로써, 직접교차분화 효율이 현저하게 향상됨을 알 수 있었다.

5-3. 유도신경세포의 치료효과 확인

우선, 본 발명에 따른 직접교차분화 시스템에 의한 유도신경세포를 수거하여 단일세포로 dissociation시킨 후, PLL-laminin으로 코팅된 2차원 기질 표면에 reseeding하고, 일주일을 배양하였으며, 이들에 대한 live/dead 분석을 실시하여 표현 형질의 변화를 관찰하였으며, 비교군으로는 세포외 기질 성분이 함유되지 않은 콜라겐겔로 봉입한 뒤, 상기와 같이 3차원 배양시킨 군 (3Dμ Col)을 이용하였다. 또한, Brain acute ischemic injury 마우스 모델의 striatum과 cortex 부위에 이식한 뒤, 유도신경세포의 이식여부 및 이에 따른 치료효과를 확인하고자 하였다, 구체적으로, 상기 질병이 유발된 마우스 모델에 이식하기 전, 세포를 DiI 형광 염색을 처리하여 이식된 유도신경세포의 tracking이 가능하도록 처리하였으며, 아울러, 이식 후 4주 기간에 걸쳐, Rotarod test를 실시하여 신경행동학적 분석을 실시하였다. 비교군으로는 BEM으로 코팅된 표면에서 2차원 배양시킨 군 (2D iN cells)을 이용하였다.

그 결과, 도 28에 나타낸 바와 같이, 3Dμ Col 군과 비교하여, 본 발명에 따른 뇌 조직 유래 세포외 기질을 함유하는 직접교차분화용 3차원 지지체에서 3차원 배양된 군 (3Dμ BEM)에서, 세포의 부착이 보다 용이하고, 신경돌기의 신장 (neurite extension)등과 같은 신경세포의 표형 형질이 잘 유지되고 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 도 29에 나타낸 바와 같이, 3Dμ BEM 군의 유도신경세포가 이식 부위에 다량 존재함을 알 수 있었으며 (도 29a), 상기의 세포가 이식된 마우스는 트레드밀에서 바닥으로 떨어지는데 소요되는 시간이 2Dμ BEM 군의 유도신경세포를 이식받은 경우보다 현저하게 증가되었음을 확인할 수 있었는바 (도 29b), 본 발명에 따른 직접교차분화된 유도신경세포를 이식함으로써, 뇌졸중 동물모델의 운동능력이 향상됨을 알 수 있었다.

5-4. 히알루론산을 이용한 직접교차분화 효율 증진 효과 확인

상기 실시예 3에서 제조된 직접교차분화용 3차원 지지체는 세포외 기질 용해물과 콜라겐 Ⅰ을 혼합하여 제조하였던 반면, 본 실시예에서는 콜라겐 Ⅰ이 아닌, 뇌 조직에 다량 존재하는 것으로 알려진 히알루론산을 10%의 세포외 기질 용해물 (40mg/ml)과 혼합하여, 직접교차분화용 3차원 지지체를 제조하였다 (HA-BEM). 상기와 동일한 방법으로 미세유체 장치와 함께 직접교차분화를 유도한 후, 면역염색 또는 qRT-PCR을 통해 Nestin, Tuj1, 및 MAP2의 발현 변화를 분석하였다. 비교군으로는 히알루론산 겔만을 이용한 군 (HA)을 이용하였다.

그 결과, 도 30에 나타낸 바와 같이, HA-BEM 군의 Tuj1, 및 MAP2 또는 Nestin 발현이 비교군에 비해 유의적으로 높게 관찰되었는바, 콜라겐 겔뿐만 아니라 히알루론산 겔 기반의 지지체를 이용한 경우에도 직접교차분화 효율이 증진됨을 알 수 있었다.

실시예 6. 직접교차분화용 배양용기를 이용한 간세포로의 직접교차분화

본 실시예에서는, 간 조직 유래 세포외 기질을 함유하는 직접교차분화용 배양용기를 이용하여 마우스의 섬유아세포에서 간세포로의 직접교차분화를 유도하였다. 구체적으로, 도 30에 나타낸 바와 같이, PMEF 배지 (DMEM, 10% FBS, 1% P/S)에 씨딩된 섬유아세포에 전기천공법 (day 0), 및 PBAE (poly(beta amino ester)) 고분자 나노파티클 기반 유전자 전달체 (day 2)를 이용하여 2회에 걸쳐 Hepatic lineage 관련 전사인자 (HNF1a, HNF4a, Foxa3)을 전달하였으며, 다음 날, 상기 PMEF 배지를 간 세포 유도용 배지(10% FBS, 0.1μM dexamethasone, 10 mM nicotamide, HCM SingleQuot Kit (Lonza), 20ng/mL hepatocyte growth factor (Peprotech) 및 20ng/mL epidermal growth factor (Peprotech)가 첨가된 DMEM/F12)로 교체하여 배양하였다.

이후, 본 발명에 따른 유도간세포 (LEM)와 전사인자가 전달되지 않은 군 (No transfection)의 차이를 광학현미경 또는 albumin 및 E-cadherin에 대한 면역염색을 통하여 확인하였다. 또한 간 조직 유래 세포외 기질의 농도 (0.02mg/ml (LEM 0.02), 0.1mg/ml (LEM 0.1))에 따른 albumin의 발현, 유도간세포 내 glycogen의 존재 여부를 확인하였으며, 비교군으로는 콜라겐 (0.02mg/ml)로 코팅한 군 (Col 0.02)를 이용하였다. 아울러, 간 특이적 마커 (HNF4A, AFP, ALB, CYP7A1)의 발현, 세포 당 albumin 및 urea의 분비량을 정량적으로 비교하였으며, 비교군으로는 primary hepatocyte를 이용하였다.

그 결과, 도 32 내지 도 34에 나타낸 바와 같이, 간세포로의 직접교차분화에 있어서, 전사인자의 전달은 필수적인 요소임을 확인할 수 있었고 (도 32 참조), Col 0.02 군 및 LEM 0.1 군에 비해, 간 조직 유래 세포외 기질이 0.02mg/ml 농도로 함유되어 있는 LEM 0.02 군의 유도간세포의 albumin 발현이 가장 우세하였으며 (도 33a 참조), 이를 Periodic Acid-Schiff (PAS)로 염색한 결과, 다량의 glycogen이 존재함을 알 수 있었다 (도 33b 참조). 또한 primary hepatocyte와 비교하여, 세포 당 albumin 및 urea의 함량이 증가됨을 알 수 있었는바 (도 34 참조), 본 발명에 따른 간 조직 유래 세포외 기질 성분을 함유함으로써, 유도간세포의 분화도 및 성숙도가 증가됨을 알 수 있었다.

실시예 7. 직접교차분화용 3차원 지지체를 이용한 간세포로의 직접교차분화

7-1. Bi-directional flow 및 HUVEC과의 공배양에 따른 효과

본 실시예에서는, 상기 실시예 3의 간 조직 유래 세포외 기질을 함유하는 하이드로겔, 즉, 직접교차분화용 3차원 지지체 (LEM) 및 미세유체 장치 (microfluidic device)를 이용하여 상기 실시예 5와 동일한 과정으로, 마우스의 섬유아세포에서 간 세포로의 직접교차분화를 유도하였다. 구체적으로, 상기 섬유아세포를 본 발명의 3차원 지지체 (LEM 겔)에 봉입 (encapsulation) 시킨 후, 미세유체 장치 내 Bi-directional flow를 주거나 (Flow) 주지 않은 조건 (No flow)에서 배양하였으며, 상기 Bi-directional flow는 Rocker를 이용하여 미세유체 장치내 유체의 흐름을 제공하였다. 또한, 이들 각각은 Human umbilical vein endothelial cell (HUVEC)과 공배양 (iHep : HUVEC= 6 : 4)하거나 (iHep+HUVEC) 하지 않는 조건 (iHEP)에서 배양하였다.

이후, 조건들의 변화에 따른 albumin의 발현 등을 면역 염색을 통하여 확인하였고, 세포 당 간 특이적 인자인 urea, albumin의 분비량 및 CYP3A4A의 활성도를 정량적으로 비교하였으며, CYP4A3A 활성과 관련된 inducer라고 알려진 Rifampicin, suppressor로 알려진 verapamil를 유도간세포에 첨가 한 경우, CYP4A3A 활성도 변화를 측정하였다. 아울러, 상기와 동일한 조건들의 변화 하에서, F-actin, vinculin, Caspase3, 및 E-cadherin 면역 염색을 실시하여, 상기 단백질의 발현을 비교하였다.

그 결과, 도 35에 나타낸 바와 같이, No flow 군은 대체적으로 albumin의 발현량이 적고, flow를 가한 군 중에서도 HUVEC과 공배양한 경우 (iHep+HUVEC), albumin의 발현이 높았으며, vasculature가 형성됨을 확인할 수 있었다. 또한, 도 36 및 도 37에 나타낸 바와 같이, 상기 결과와 마찬가지로, flow와 함께 HUVEC과 공배양한 경우, 유도간세포의 urea, albumin의 분비량 및 CYP3A4A의 활성이 가장 우수하였는바, 이를 통해 간세포의 기능이 증진됨을 알 수 있었으며 (도 36a, 36b, 및 36c 참고), 상기 유도 간 세포에 Rifampicin 또는 verapamil를 처리한 경우, CYP3A4A의 활성이 증가 또는 감소하였는바, 실제 간 세포와 매우 유사한 기능성을 지님을 알 수 있었다 (도 37a 및 37b 참고). 아울러, 도 38에 나타낸 바와 같이, Focal adhesion 관련 단백질인 F-actin, vinculin과 세포간 상호작용 관련 단백질인 E-cadherin의 발현을 관찰한 결과, flow와 함께 HUVEC과 공배양한 경우, 이들의 발현이 가장 우수하였는바, 직접교차분화를 위한 상호작용이 증진됨을 알 수 있었으며 (도 38a 및 도 38b 참조), 세포 사멸 관련 단백질인 Caspase-3의 발현의 경우에는, No flow 군에서 이들의 발현이 가장 다량 관찰되었는바, flow와 함께 HUVEC과 공배양함으로써, 직접교차분화 과정에서의 세포 사멸이 둔화됨을 알 수 있었다 (도 38c 참조).

7-2. 미세유체 장치 내 조건 등에 따른 직접교차분화 효율의 변화

본 실시예에서는, 도 20c에 나타낸 미세유체 장치 내 총 3개의 channel로 이루어지는 미세유체 장치를 이용하여, 마우스의 섬유아세포에서 간 세포로의 직접교차분화를 유도하였다. 구체적으로, channel 부분에 LEM 겔/콜라겐 겔로 봉입된 유도간세포만 분주한 군 (iHep), 중앙 channel 부분에 LEM 겔/콜라겐 겔로 봉입된 유도간세포 및 HUVEC을 함께 분주한 군 (iHep+EC), 중앙 channel 부분에 LEM 겔/콜라겐 겔로 봉입된 유도간세포를 분주하고, 바깥 두 채널에 봉입되지 않은 HUVEC을 분주한 군 (iHep/EC)을 이용한 뒤, 이들의 albumin 발현 등을 비교하였다.

그 결과, 도 39에 나타낸 바와 같이, 콜라겐 겔을 이용한 군에 비해, 본 발명에 따른 LEM 겔을 사용한 경우, albumin의 발현이 높게 관찰되었으며, 중앙 channel 부분에 LEM 겔로 봉입된 유도간세포 및 HUVEC을 함께 분주한 군 (iHep+EC)의 유도간세포에서, albumin의 발현 및 vasculature가 형성이 가장 우수함을 알 수 있었다.

실시예 8. 유도간세포를 이용한 독성 평가 등의 활용

본 실시예에서는, 상기 실시예 7의 과정으로 제조된, 유도간세포 및 HUVEC 세포로 이루어진 세포 덩어리를 이용하여, 약물에 대한 간 독성 평가 및 간 이식을 실시하였다. 구체적으로 간 독성이 있다고 알려진, Acetaminophen (10mM, 20mM) 또는 Alcohol (100mM, 200mM, 600mM)을 유도간세포 배양액에 첨가하여 배양한 뒤, 이로부터 2일 또는 3일 후, live/dead 분석을 실시하였다, 또한, 본 발명의 3차원 지지체 (LEM 겔)로 봉입하기 전, 세포를 DiI 형광 염색을 처리하여 이식된 유도간세포의 tracking이 가능하도록 처리한 후, 이를 간에 이식한 후, 이식 부위로의 생착 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 40에 나타낸 바와 같이, Acetaminophen (도 40a) 또는 Alcohol (도 40b)의 농도가 증가함에 따라, 사멸하는 유도간세포 (붉은색)의 수가 증가함을 확인할 수 있었는바, 이를 통해 본 시스템은 간 독성 평가에 응용될 수 있는 가능성을 보여주었다. 또한, 도 41에 나타낸 바와 같이, 이식된 유도간세포는 이식 부위에 다량 존재 및 생존하고 있었는바, 간 이식을 위한 기술로도 활용될 수 있음을 보여주었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (19)

1. 생체로부터 분리된 조직을 탈세포화(Decellularization) 처리하여 수득된 세포외 기질 용해물을 포함하는, 직접교차분화 촉진용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 조직은, 뇌 또는 간 조직인 것을 특징으로 하는, 직접교차분화 촉진용 조성물.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항의 조성물로 코팅된 표면을 포함하는, 직접교차분화용 배양용기.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 직접교차분화용 배양용기의 표면은, 세포외 기질 용해물을 0.005 내지 0.03mg/ml의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는, 직접교차분화용 배양용기.
   
7. 제1항의 조성물 및 하이드로겔을 포함하는, 직접교차분화용 3차원 지지체.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 직접교차분화용 3차원 지지체는 세포외 기질 용해물을 4 내지 16mg/ml의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는, 직접교차분화용 3차원 지지체.
   
9. 제7항에 있어서,
   상기 하이드로겔은 콜라겐, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 폴리에틸렌글라이콜, 키토산, 마트리젤, 코드로이틴 설페이트, 및 셀룰로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 직접교차분화용 3차원 지지체.
   
10. 생체로부터 분리된 조직을 탈세포화(Decellularization) 처리하여 수득된 세포외 기질 용해물로 코팅된 표면을 포함하는 직접교차분화용 배양용기에서, 전사인자가 도입된 체세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 신경 또는 간세포로의 직접교차분화방법.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 조직은, 뇌 또는 간 조직인 것을 특징으로 하는, 직접교차분화방법.
    
12. 제10항에 있어서,
    상기 직접교차분화용 배양용기의 표면은, 세포외 기질 용해물을 0.005 내지 0.03mg/ml의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는, 직접교차분화방법.
    
13. 제10항에 있어서,
    상기 체세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는, 직접교차분화방법.
    
14. 생체로부터 분리된 조직을 탈세포화(Decellularization) 처리하여 수득된 세포외 기질 용해물 및 하이드로겔을 포함하는, 직접교차분화용 3차원 지지체에서, 전사인자가 도입된 체세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 신경 또는 간세포로의 직접교차분화방법.
    
15. 제14항에 있어서,
    상기 조직은, 뇌 또는 간 조직인 것을 특징으로 하는, 신경 또는 간세포로의 직접교차분화방법.
    
16. 제14항에 있어서,
    상기 직접교차분화용 3차원 지지체는 세포외 기질 용해물을 4 내지 16mg/ml의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는, 직접교차분화방법.
    
17. 제14항에 있어서,
    상기 체세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는, 직접교차분화방법.
    
18. 제14항에 있어서,
    상기 배양하는 단계는 미세유체 장치 (Microfluidic device) 내에서 배양되는 것을 특징으로 하며,
    상기 미세유체 장치는 (a) 상기 직접교차분화용 3차원 지지체와 전사인자가 도입된 체세포가 로딩되는 배양채널; 및 (b) 상기 배양채널과 유체의 이동이 가능한 미세관으로 연결되어 있는 리저버를 포함하는 것인, 직접교차분화방법.
    
19. 삭제

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