KR102272781B1

KR102272781B1 - 세포외기질로 유도된 자가조립체 제조방법 및 이를 이용한 인공조직 제조

Info

Publication number: KR102272781B1
Application number: KR1020190119617A
Authority: KR
Inventors: 박도영; 윤희웅
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2019-09-27
Filing date: 2019-09-27
Publication date: 2021-07-05
Also published as: KR20210037242A; WO2021060776A1; US20220340867A1

Abstract

본 발명은 세포외기질로 유도된 자가조립체 제조방법 및 이를 이용한 인공조직 제조에 관한 것으로, (a) 조직 유래 세포외기질(ECM)을 탈세포 및 분말화하는 단계; 및 (b) 세포에 상기 탈세포화된 세포외기질 분말을 첨가하고 배양하여 세포-세포외기질 분말 자가조립체를 형성하는 단계; 를 포함하는 세포외기질로 유도된 자가조립체 제조방법으로 이루어져 상기 자가조립체는 세포외기질 조직과 유사한 특성을 갖고, 1cm 이상 크기의 3차원 인공조직 제조가 가능하여 세포치료제 및 인공조직 이식체로 유용하게 활용될 수 있는 효과가 있다.

Description

세포외기질로 유도된 자가조립체 제조방법 및 이를 이용한 인공조직 제조{Method for producing self-assembled engineered tissue induced by target tissue extracellular matrix and preparation of artificial tissue using the same}

본 발명은 세포외기질로 유도된 자가조립체 제조방법 및 이를 이용한 인공조직 제조에 관한 것이다.

최근, 질환이나 사고 등의 이유로 손상된 장기나 조직을 재생하기 위하여 조직공학이 주목되고 있다. 이러한 조직공학에서 장기나 조직의 형태적 재구축을 위해 세포 증식의 발판으로서, 천연재료 및 합성폴리머 등의 생체재료가 사용되고 있고, 이를 지지체 (scaffold)라고 한다.

목적하는 대상 조직의 세포 또는 줄기세포를 상기 지지체에 파종하고, 이를 생체 외의 적당한 환경하에서 배양하고, 요구되는 세포로 증식, 분화시킴으로써 인공적인 조직을 생산할 수 있다. 또는, 재생시키고자 하는 장기나 조직의 결손부에 세포가 파종된 지지체를 이식하고, 생체 내에서 대상 조직과 유사한 형질을 발현한 세포로 분화시킴으로써, 세포를 3차원적 구조로 증식시켜, 목적하는 장기를 재생시키는 방법이 많이 보고되어 있다.

그러나 지지체를 사용하여 바이오 인공장기를 구축해도 장기의 생리적인 기능을 충분히 발휘하지 못하거나 지지체의 유무에 상관없이 인공조직 그 자체의 구축이 어렵다는 문제점이 있어왔다. 특히, 세포를 파종하고 운반하는 담체로서 지지체는 합성물질로 제작된 것이 대부분이고, 아직도 이러한 합성 생체재료가 갖는 생체친화성 및 생체내 분해흡수 조절이 쉽지 않다는 점이 임상 응용에 제한점이 되고 있다. 그 밖에도, 세포 파종 시 균일하지 못한 세포분포, 이식 후 흡수부전에 의한 면역 반응도 해결되어야 할 문제점이라고 할 수 있다.

한편, 조직공학의 필수 조건이라고 여겨지던 지지체가 사용되지 않는 무지지체 공법 (scaffold-free engineering)의 이식용 조직의 개발이 다수 보고되고 있다. 일본 동경여자대학교 오카노교수 등이 1993년 발표한 세포시트공학(cell sheet engineering)은 배양세포들을 간단히 온도만 낮추어줌으로써 세포들이 서로 연결된 ‘시트 모양’ 조직으로 이용할 수 있다. 더불어, 선회 배양 (Rotating culture) 기술을 이용하여, 고밀도의 세포 현탁액을 배양하면, 세포들끼리 스페로이드(spheroid)를 형성하게 되어 구상조직을 (spherodal aggreate)를 형성한다. 이러한 현상은 섬유 아세포 및 연골세포 등에서 일어나는 것으로 보고되었다.

하지만, 현존하는 무지지체 조직공학 공법은 여러가지 한계점들이 있다. 첫째, 혈관분포가 없는 체외 환경에서는 얻어지는 조직의 크기에 한계가 있는데, 이것은 확산에 의존하는 영양분과 산소의 공급에 한계가 있기 때문이다. 일반적으로 확산에 의한 물질교환을 통하여 내부에 위치한 세포가 생존하기 위해서는 300㎛이하의 거리가 필요하다고 알려져있다. 따라서 통상적으로 체외 환경에서 직경 1cm 이상의 인공 조직 제작에 어려움이 있으며, 제작이 가능하더라도 내부 세포의 괴사나 비균질한 조직으로 제작되기 쉽다는 한계점이 있다. 둘째, 같은 크기의 이식물 기준에서 무지지체 공법은 지지체 공법에 비하여 많은 양의 세포를 필요로 한다. 근골격계 연골 세포를 기준으로 할 때 무지지체 공법은 지지체 공법에 비하여 최소 100 배 정도 적은 크기의 조직이 얻어지며 이에 따라 일정 크기에 도달하기 까지 그만큼 많은 세포가 요구된다. 셋째, 무지지체 조직공학 공법은 목표 조직의 제작에 있어 성장 인자 등 분화 유도를 위한 첨가제가 필요하며 이는 생산공정의 가격 증가 및 안정성의 문제를 야기할 수 있다.

따라서 조직공학에서 지지체를 필요로 하지 않으며, 별도의 분화 유도 첨가제 필요없이 1cm 이상의 인공 조직을 제조할 수 있는 공법에 대한 연구가 필요한 실정이다.

1. 대한민국 공개특허 제10-2017-0126913호(2017.11.20.공개)

본 발명의 목적은 별도의 지지체 및 분화 유도 첨가제의 필요 없이 인공조직을 제조할 수 있는 세포외기질로 유도된 자가조립체 제조방법을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 세포-세포외기질 분말 자가조립체, 인공조직 및 인공장기를 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 조직 유래 세포외기질(ECM)을 탈세포 및 분말화하는 단계; 및 (b) 세포에 상기 탈세포화된 세포외기질 분말을 첨가하고 배양하여 세포-세포외기질 분말 자가조립체를 형성하는 단계; 를 포함하는 세포외기질로 유도된 자가조립체 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 자가조립체 제조방법에 따라 형성된 세포-세포외기질 분말 자가조립체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 자가조립체 제조방법에 따라 형성된 생체외기질 유래 인공조직을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 자가조립체 제조방법에 따라 형성된 생체외기질 유래 인공장기를 제공한다.

본 발명은 세포외기질을 파우더로 제조하고, 이를 줄기세포에 첨가하여 배양함으로써 별도의 지지체 및 분화 유도 첨가제 필요 없이 세포외기질 기원 조직으로 자가조립이 가능하며, 균일한 세포분포를 갖는 고품질의 인공조직 또는 인공장기를 형성시킬 수 있는 효과가 있다.

또한, 줄기세포에 첨가하는 세포외기질 파우더 농도 조절만으로 1cm 이상 크기의 3차원 인공조직 제조가 가능하며, 세포외기질에서 기원된 인공조직을 제조할 수 있어 세포치료제 및 인공조직 이식체로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 세포-ECM 파우더 자가조립체 제조방법 및 이식체로써의 활용 전체 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 조직 기원 따른 ECM 파우더의 형태(A)와 입도 분포(B) 분석을 나타낸 도면이다.
도 3은 다양한 생체조직 ECM 유래 파우더의 탈세포화(A) 및 생화학적 특성에 차이가 있음(B~D)을 나타낸 도면이다.
도 4는 세포에 첨가된 ECM 파우더가 세포 친화적이며(A-B), 기원한 조직에 따라 생리활성에 차이가 있음(C-D)을 나타낸 도면이다.
도 5는 서로 다른 조직 ECM 파우더의 기원에 따라 줄기세포의 분화 유도 양상이 다름을 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 제조된 세포-ECM 파우더 자가조립체의 사이즈가 첨가된 ECM-파우더의 농도에 따라 조절 가능함을 나타낸 도면이다.
도 7은 제작된 세포-ECM 파우더 자가조립체의 육안 관찰 이미지(gross image)와 safranin-o 염색 이미지로써 첨가한 ECM 파우더의 기원에 따라 분화 정도에 차이가 있음을 나타낸 도면이다.
도 8은 세포와 ECM 파우더를 누드마우스 피하에 주입한 후 4주 경과된 결과이며, 자연적으로 인공적인 조직이 형성될 뿐만 아니라 ECM 파우더의 기원 조직에 따라 서로 기원 조직과 유사한 생화학적 특성으로 인공조직이 형성되었음을 나타낸 도면이다.

이하에서는 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명자들은 다양한 동물 조직 세포외기질 (Extracellular matrix: ECM) 유래 파우더를 제조하고, 이를 줄기세포에 첨가하여 배양함으로써 별도의 지지체 및 분화 유도 첨가제 필요 없이 자가조립형 세포-세포외기질 파우더 복합체 (Cell-ECM powder construct)를 형성할 수 있었으며, 상기 자가조립형 세포-세포외기질 파우더 복합체는 세포외기질 조직과 유사한 특성을 갖고, 1cm 이상 크기의 3차원 인공조직 제조가 가능하여 세포치료제 및 인공조직 이식체로 유용하게 활용될 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 (a) 조직 유래 세포외기질(ECM)을 탈세포 및 분말화하는 단계; 및

(b) 세포에 상기 탈세포화된 세포외기질 분말을 첨가하고 배양하여 세포-세포외기질 분말 자가조립체를 형성하는 단계; 를 포함하는 세포외기질로 유도된 자가조립체 제조방법을 제공한다.

상기 형성된 세포-세포외기질 분말 자가조립체에서 ECM-파우더는 세포를 끌어들이는 화학유인물질(chemoattractant)로써 작용할 수 있을 뿐만 아니라 세포와 강한 결합능력이 있으며, 증식과 분화를 촉진 시키는 능력이 있고, 세포외기질 조직의 종류에 따라서 분화 유도가 이루어지기 때문에 다양한 생체모방 구조를 만들 수도 있다. 따라서 세포외기질 분말은 세포의 부착 및 증식에 효과적이며, 특히 줄기세포의 특정세포로의 분화에 큰 영향을 미칠 수 있다.

상기 (a) 단계에서 조직 유래 세포외기질은 연골, 소장, 메니스커스(Meniscus), 인대 및 건 조직(tendinous tissue)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 인간을 포함한 모든 동물의 장기 및 조직을 이용하거나 정제된 ECM 물질을 사용할 수도 있다.

또한, 상기 (b) 단계에서 세포는 줄기세포로서, 자가 동종 또는 이종 줄기 세포일 수 있으며, 구체적으로 중간엽 줄기세포, 배아 줄기세포 및 역분화 줄기세포로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (a) 단계에서 연골 및 섬유-연골 조직 분말 제조 후 탈세포 과정을 수행하였으나, 조직의 분말화 전에 탈세포를 수행하고 분말화하는 것 역시 가능하다.

또한, 상기 (b) 단계에서 탈세포화된 세포외기질 분말은 0.1 내지 3mg/ml의 농도로 첨가할 수 있으며, 상기 분말은 배양하는 세포의 배양액이나 식염수에 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게 1 내지 2.5 mg/ml의 농도로 세포에 첨가되어 배양될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 (b) 단계에서 자가조립체는 생체 외(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 형성될 수 있으며, 체외에서 세포-ECM 자가조립체를 형성시켜 목적하는 조직에 이식하는 방법뿐만 아니라, ECM 파우더와 세포를 섞어준 후 바로 이식하여 자가조립체를 체내에서 형성할 수도 있다.

또한, 상기 (b) 단계에서 세포 증식 또는 세포 분화 유도에 의해 세포-세포외기질 분말 자가조립체를 형성할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 자가조립체 제조방법에 따라 형성된 세포-세포외기질 분말 자가조립체를 제공한다.

이때, 상기 세포-세포외기질 분말 자가조립체를 유효성분으로 세포 치료제로서 이용될 수 있으며, 상기 세포 치료제는 치료하고자 하는 부위에 주사기 등을 이용하여 직접 삽입되거나, 수술을 통해 삽입되거나, 또는 순환계를 통하여 삽입될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기와 같이 자가조립체를 체내에 삽입하는 것 뿐만 아니라 본원발명에 따른 ECM 파우더와 세포를 섞어준 후 바로 치료하고자 하는 부위에 이식하여 자가조립체를 체내에서 형성시킬 수 있다.

이때, 상기와 같이 치료하고자 하는 부위에 자가조립체 또는 ECM 파우더와 세포 혼합물 이식시 피이식 조직의 손상된 세포를 대체하여 조직의 손상을 치유하거나, 피이식 조직과 네트워크를 이루어 조직을 재건하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 세포 치료제가 적용될 수 있는 질환은 자가면역질환, 심혈관계 질환, 골질환, 및 신경질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명자들은 배양접시에 줄기세포를 접종한 후 ECM 파우더를 처치하였을 때 세포와 ECM 파우더 사이에 자발적인 융합이 일어나면서 하나의 덩어리가 되는 것을 발견하였다. 이러한 자가조립 현상은 연골, 섬유-연골 및 소장점막하 조직 등 다양한 조직의 ECM 유래 파우더에서 일어났으며, 제조된 줄기세포-ECM 파우더 자가조립체는 추가적인 생리활성인자 없이도 유래된 ECM 파우더의 생화학적 특성으로 분화가 유도되는 것을 확인하였다. 특히 세포-파우더 자가조립체의 크기는 첨가되는 ECM 파우더의 양에 따라 조절이 가능하였으며, 1cm 이상의 크기로 균질한 인공 조직 제작이 가능하였다. 이러한 세포-ECM 파우더 사이의 자가조립 현상과 분화 유도 특성에 기반하여 서로 다른 기원의 조직 유래 ECM 파우더와 중간엽 줄기세포를 누드마우스 피하에 주입하여 이식하였을 때, 인공조직이 형성됨을 확인할 수 있었다. 또한, 생성된 인공조직의 생화학적 분석을 진행하였을 때, 인공조직이 ECM 파우더가 기원된 조직의 특성으로 분화하였음을 확인할 수 있었다(도 1).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1> 탈세포화된 다양한 조직 유래 ECM 파우더의 제작

1. 돼지 연골(Cartilage) 조직 파우더의 탈세포

돼지 관절 연골은 수술용 블레이드를 사용하여 무릎 관절, 엉덩이 관절 및 팔꿈치 관절에서 수확했다. 수집된 연골 조직을 DW로 세척한 뒤 동결 건조기 (Bondiro, Ilshinlab, Daejeon, Korea)를 통하여 건조되었다. 이어서 동결건조된 조직(Lyophilized tissue)은 프리저 밀(freezer mill) (6870; SPEX, Metuchen, NJ, USA)을 통하여 미세 분말로 수득하였다. 이어서 조직 파우더를 저온 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 실온에서 12 시간 처리한 후, 실온에서 2 시간 동안 0.1% 소듐 도데실 설페이트를 포함하는 TBS 완충액(Tris-buffered saline containing 0.1% sodium dodecyl sulfate)으로 처리하여 탈세포를 수행하였다. 탈세포화된 연골 분말은 4 ℃에서 10 분 동안 10,000 RCF에서 원심 분리한 후 DW로 7 번 세척하여 세제를 제거하였다. 이후, 수집된 연골 조직 분말을 Dnase 완충액 (100 U/ml, Elpis Biotech, 대전, 한국)으로 4 ℃에서 12 시간 동안 처리하여 남은 유전 물질을 제거하였다. 최종 탈세포화된 연골 조직 분말은 10,000 RCF로 4 ℃에서 10 분간 원심 분리하고 DW로 7 회 더 세척하였다. 탈세포화된 연골 분말을 동결 건조시키고, freezer mill을 통하여 최종 분말 형태로 제조한 후 몰레큘러 시브(molecular sieve)를 이용하여 100 ㎛ 이하 사이즈의 파우더를 얻였다.

2. 돼지 섬유-연골(Meniscus) 조직 파우더의 탈세포

돼지 섬유-연골은 수술용 블레이드를 사용하여 무릎 관절에서 수확했다. 수집된 섬유-연골 조직을 DW로 세척한 뒤 동결 건조기 (Bondiro, Ilshinlab, Daejeon, Korea)를 통하여 건조되었다. 이어서 동결건조된 조직(Lyophilized tissue)은 프리저 밀(freezer mill) (6870; SPEX, Metuchen, NJ, USA)를 통하여 미세 분말로 수득하였다. 이어서 조직 파우더를 저온 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 실온에서 12 시간 처리한 후, 실온에서 2 시간 동안 0.1% 소듐 도데실 설페이트를 포함하는 TBS 완충액(Tris-buffered saline containing 0.1% sodium dodecyl sulfate)으로 처리하여 탈세포를 수행하였다. 탈세포화된 섬유-연골 분말은 4 ℃에서 10 분 동안 10,000 RCF에서 원심 분리한 후 DW로 7 번 세척하여 세제를 제거하였다. 수집된 연골 조직 분말을 Dnase 완충액 (100 U/ml, Elpis Biotech, 대전, 한국)으로 4 ℃에서 12 시간 동안 처리하여 남은 유전 물질을 제거하였다. 최종 탈세포화된 연골 조직 분말은 10,000 RCF로 4 ℃에서 10 분간 원심 분리하고 DW로 7 회 더 세척하였다. 탈세포화된 연골 분말을 동결 건조시키고, freezer mill을 통하여 최종 분말 형태로 제조한 후 몰레큘러 시브(molecular sieve)를 이용하여 100 ㎛ 이하 사이즈의 파우더를 얻었다.

3. 돼지 소장점막하조직 (SIS) 파우더의 탈세포

탈세포화된 소장 점막하 조직(SIS)의 제조는 소장조직으로부터 외부(tunica) 점막, 장막(tunica serosa) 및 근층(tunica muscularis)을 기계적으로 제거하고, tunica 점막하 층과 기저(basilar) 부분을 남겨 두었다. 탈세포 및 소독은 실온에서 2 시간 동안 300rpm에서 4 % 에탄올을 함유하는 0.1 % 아세트산으로 처리하여 수행하였다. 이어서 탈세포화된 SIS를 PBS로 7 회 세척하였다. 세척된 SIS는 동결 건조한 뒤 분쇄하여 freezer mill을 통하여 최종 분말 형태로 제조한 후 몰레큘러 시브(molecular sieve)를 이용하여 100 ㎛ 이하 사이즈의 파우더를 얻었다.

< 실시예 2> 탈세포화된 ECM 파우더의 물리적 형태 및 입도 분석

1. 탈세포화된 ECM 파우더의 형태 분석

주사전자현미경(scanning electron microscope)을 사용하여 동결 분쇄한 돼지 연골분말의 형태를 분석하였다. 상기 <실시예 1>에서 분쇄한 ECM 파우더를 에탄올로 탈수시킨 후, 건조하여 전자현미경 (JEOL, JSM-6380, Japan; 20KV)으로 파우더 크기 및 형태를 관찰하였다.

그 결과, 탈세포화된 세포외기질(ECM) 분말의 크기는 평균 약 10-200 ㎛ 임을 확인하였다(도 2A).

2. 탈세포화된 ECM 파우더의 입도 분포 분석

탈세포화된 ECM 파우더는 100 μg/ml의 농도로 DW에 혼탁하여 동적 광 산란 (dynamic light Scattering) 방법을 통하여 입도 분포를 측정하였다 (ELSZ-2000, Otsuka Electronics, Osaka, Japan).

그 결과, ECM 파우더 입도 분포는 약 10-200 ㎛ 로 측정되었으며, 연골 ECM 파우더는 약 55 ㎛, 섬유-연골 ECM 파우더는 약 90 ㎛, SIS ECM 파우더는 약 84 ㎛의 직경을 갖음을 확인하였다(도 2B).

< 실시예 3> 탈세포화된 ECM 파우더의 생화학적 특성 분석

1. 탈세포화된 조직 유래 ECM 파우더의 DNA 함량 분석

탈세포 공정을 거친 ECM 파우더의 탈세포 여부를 확인하기 위하여 picogreen assay(p11496, ThermoFisher Scientific, USA)를 통해 잔존하는 dsDNA의 양을 정량하였다.

통상적으로 체내 이식 시 허용되는 dsDNA의 양은 단위 조직 1 mg 당 50 ng 이하이므로, 연골, 섬유-연골, SIS ECM 모두에서 성공적으로 탈세포가 진행되었음을 확인하였다(도 3A).

2. 조직 유래 ECM 파우더의 성분 함량 분석

조직 기원에 따라 성분 함량의 차이를 분석하기 위하여 콜라겐, 황산화된 글리코사미노글리칸(sulfated glycosaminoglycan; sGAG) 및 엘라스틴(Elastin)의 함량 분석을 진행하였다.

콜라겐은 S1000(Biocolor, UK), sGAG는 B1000(Biocolor, UK), 엘라스틴은 F2000(Biocolor, UK)을 이용하여 측정되었다.

그 결과, 콜라겐의 경우 섬유-연골에서 가장 높은 비중을 차지하였으며(도 3B), sGAG는 연골에서 가장 높은 비중을 차지함(도 3C)을 확인하였다. 또한, Elastin의 경우 소장점막하 조직에서 유의적으로 높은 함량을 가지고 있음을 확인하였다(도 3D).

< 실시예 4> 탈세포화된 ECM 파우더의 세포특이적 특성 분석

1. 탈세포화된 ECM 파우더의 중간엽 줄기세포 세포친화성 분석

조직의 기원에 따른 세포 행동 영향에 차이를 평가하기 위하여 세포 증식, 생존 이동 부착에 관한 분석을 진행하였다. 각 조직의 ECM 파우더를 인간의 활막 유래 중간엽 줄기세포(hMSC)가 4x10⁶ cells로 파종된 직경 6 cm의 배양접시에 1 mg/ml의 농도로 첨가하여 1, 4, 7, 10, 14일 동안 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다.

hMSC의 증식을 WST assay를 통하여 분석하였으며, 결과적으로 아무것도 첨가하지 않은 대조군(control)에 비하여 ECM 파우더를 첨가했을 때 증식이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 4A). 또한, hMSC는 배양접시의 표면으로부터 ECM 파우더 입자 표면으로 이동하여 부착하는 양상을 보임으로써 ECM 파우더 표면에 더욱 친화성을 나타냄을 확인하였다. 세포와 ECM 파우더 간 부착은 배양 기간이 진행됨에 따라 더욱 촉진되어 세포와 ECM 파우더가 서로 융합되어 하나의 큰 입자를 만들었으며, 배양 14일 째에도 세포가 사멸하지 않고 잘 생존하여 있음을 LIVE DEAD assay를 통하여 확인하였다(도 4B).

2. 탈세포화된 ECM 파우더의 중간엽 줄기세포 이동능 분석

ECM 파우더가 생화학적으로 화주기성 (chemotaxis)을 갖고 세포의 이동을 촉진시킬 수 있는지를 평가하기 위하여 Boyden chamber assay를 진행하였다.

그 결과, hMSC의 경우에 섬유-연골 ECM 파우더에서 가장 많은 세포를 끌어들였으며, 이러한 수치는 10%의 FBS 가 포함된 세포배양 배지보다도 유의적으로 높았음을 확인하였다 (도 4C).

3. 탈세포화된 ECM 파우더의 중간엽 줄기세포 부착능 분석

각 조직 ECM 파우더의 기원에 따라 hMSC 와 ECM 표면 간 친화성의 차이를 관찰하기 위하여 세포 부착 평가를 진행하였다.

세포 부착 평가를 위하여 아가로즈 겔에 각 조직 ECM 파우더를 1mg/ml 의 농도로 섞어서 배양접시에 코팅하였다. 이어서 hMSC를 접종하고 2시간 후에 배양 접시를 PBS로 두번 세척하여 아가로즈에 부착된 세포를 Calcein AM 으로 염색하여 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 아무것도 섞지 않은 아가로즈를 대조군으로 하였을 때 ECM 파우더가 첨가된 표면에서 더 많은 hMSC가 부착되어 있음을 확인할 수 있었으며, 특히 섬유-연골 ECM 파우더에서 다른 그룹에 비하여 유의적으로 높은 수치로 부착이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 4D).

< 실시예 5> ECM 파우더의 체외 중간엽 줄기세포 분화 유도 분석

1. 조직 기원에 따른 ECM 파우더의 중간엽 줄기세포 분화 유도 분석

조직의 기원에 따라 ECM 파우더의 첨가가 hMSC의 분화에 어떤 영향을 미치는지를 평가하기 위하여 제 1형 및 제 2형 콜라겐, 아그레칸(aggrecan) 및 SOX-9의 발현을 RT-PCR을 통하여 분석하였다.

그 결과, 섬유-연골과 소장점막하 조직은 제 1형 콜라겐 유전자의 발현을 연골 ECM 파우더 첨가군에 비하여 유의적으로 증가시켰다. 또한, 연골 ECM 파우더의 첨가는 hMSC의 제 2형 콜라겐의 발현을 다른 그룹에 비하여 유의적으로 증가시켰으며, 다른 연골조직 마커인 aggrecan 과 SOX 9의 발현 또한 유의적으로 증가시키는 것을 확인하였다(도 5).

따라서 ECM 파우더는 기원한 조직의 특성에 따라 세포 분화가 유도됨을 확인하였다.

< 실시예 6> 체외에서의 세포-ECM 파우더 자가조립체 제작

1. 체외(in vitro) 세포-ECM 파우더 자가조립체 제작 및 이의 사이즈 조절 분석

세포-ECM 파우더 자가조립체 제작은 다음과 같은 과정으로 제작되었다.

직경 6cm 배양접시에 hMSC를 4x10⁶ cells로 접종한 후 3일간 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. 이후, 상기 <실시예 1>에 따라 제조된 ECM 파우더를 1 mg/ml 의 농도로 10%의 FBS 가 포함된 세포배양 배지 (alpha-MEM)에 현탁한 후, 이를 상기 세포 배양액에 넣어 37℃, 5% CO₂ 조건으로 1일간 배양하였다. 세포-ECM 파우더가 융합하기 시작하면 조심스럽게 세포 스크레이퍼(cell scraper)를 이용하여 세포-ECM 파우더 자가조립체를 떼어주고 5ml의 세포 배양배지가 포함된 50ml tube에 옮겨서 배양하였으며, 3 일에 한번 씩 세포 배양액을 교환해주었다.

결과적으로, 세포-ECM 파우더 자가조립체는 50ml 튜브에 배양하고 약 3일에서 일주일 정도 지나면 더욱 응축된 형태를 이루는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, ECM 파우더의 농도가 증가할수록 자가조립체의 크기가 증가하였으며, 2.5mg/ml의 농도로 ECM 파우더를 처리한 자가조립체의 경우에 직경이 1cm 까지 제작 가능함을 확인하였다(도 6).

2. 체외 세포-ECM 파우더 자가조립체의 육안 평가 및 조직학적 분석

육안적으로 1mg/ml의 농도의 ECM 파우더를 처리한 세포-ECM 파우더 자가조립체는 구형에 가까운 형태로 제작 가능함을 확인하였으며, 사프라닌-O(Safranin-O) 염색에 의한 조직학적 관찰 결과, 세포-ECM 파우더 자가조립체는 균질한 내부 분포를 이루는 것을 확인하였다. 또한, 조직학적 관찰에서 ECM 파우더에 세포가 균질하게 부착되어 있는 것을 관찰할 수 있었으며, ECM 파우더 기원 조직에 따라서 Safranin-O 염색 정도에 차이가 있음을 확인할 수 있었다(도 7).

< 실시예 7> 세포-ECM 파우더 자가조립체의 체내 인공조직 형성 분석

1. 체내(in vivo ) 세포-ECM 파우더 자가조립 조직의 육안 및 조직학적 분석

체내에서 세포-ECM 파우더 자가조립체의 형성능을 평가하기 위하여 1x10⁶cells 농도의 hMSC와 1mg/ml 농도의 ECM 파우더를 식염수에 현탁하여 100 ul씩 누드마우스 피하에 주입하였다. 피하 주입 4주 후, 누드마우스를 희생시켜 조직 형성 및 분화 정도를 평가하기 위하여 육안관찰과 H&E 염색, 사프라닌-O(Safranin-O) 염색, 콜라겐 I형(COL I) 및 콜라겐 II형(COL II)의 염색을 통해 조직학평가를 진행하였다.

그 결과, 세포-ECM 파우더 현탁액을 주입한 위치에 하나의 컴팩트하고 균질한 인공조직이 형성되었음을 육안적으로 관찰하였다. 또한, H&E 염색 결과 세포질이 균질하게 형성되었으며 세포의 분포 또한 균질하게 이루어져 있음을 확인하였다. 더불어 ECM 파우더의 기원 조직과 유사한 Safranin-O 염색 양상과 콜라겐의 타입의 발현양상이 인공조직에서도 관찰됨을 확인하였다(도 8A).

2. 체내 세포-ECM 파우더 자가조립 조직의 성분 분석

ECM 파우더의 기원에 따라 체내에서 형성된 인공조직의 성분 함량 분석을 평가하기 위하여 콜라겐과 sGAG 함량을 정량 평가하였다.

그 결과, 상기 <실시예 3>의 도 3B, 3C에서와 같이, 콜라겐의 함량은 섬유-연골에서 다른 그룹에 비하여 유의적으로 높게 측정되었으며, sGAG의 경우 연골조직에서 유의적으로 높은 정량 값을 보이는 것을 확인하였다(도 8B).

따라서 ECM-파우더는 세포를 끌어들이는 화학유인물질(chemoattractant)로써 작용할 수 있을 뿐만 아니라 세포와 강한 결합능력이 있으며, 증식과 분화를 촉진시키는 능력이 있음을 확인하였다. 이러한 결과로 인하여 세포와 ECM 파우더 사이에 융합작용이 일어나며 결국에 하나의 자가조립체로 제조되어 ECM 유래 인공조직이 형성될 수 있는 것으로 판단된다.

Claims

(a) 조직 유래 세포외기질(ECM)인 연골 또는 메니스커스(Meniscus)를 탈세포 및 분말화하는 단계; 및
(b) 중간엽 줄기세포에 상기 탈세포화된 세포외기질 분말을 1 내지 3mg/ml의 농도로 첨가하고 배양하여 생체 외(in vitro)에서 세포-세포외기질 분말 자가조립체를 형성하는 단계; 를 포함하는 세포외기질로 유도된 자가조립체 제조방법.
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제 1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 세포 증식 또는 세포 분화 유도에 의해 세포-세포외기질 분말 자가조립체를 형성하는 것을 특징으로 하는 세포외기질로 유도된 자가조립체 제조방법.
제 1항 또는 제 7항 중 어느 한 항의 방법에 따라 형성된 세포-세포외기질 분말 자가조립체.
제 1항 또는 제 7항 중 어느 한 항의 방법에 따라 형성된 세포외기질 유래 인공조직.
제 1항 또는 제 7항 중 어느 한 항의 방법에 따라 형성된 세포외기질 유래 인공장기.