KR100715505B1

KR100715505B1 - 세포 유래 세포외 기질 지지체의 제조방법

Info

Publication number: KR100715505B1
Application number: KR1020060002059A
Authority: KR
Inventors: 민병현; 박소라; 진쳉제; 박귀덕
Original assignee: 민병현
Priority date: 2006-01-07
Filing date: 2006-01-07
Publication date: 2007-05-08

Abstract

본 발명은 세포 유래 세포외 기질(ECM) 지지체의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 동물의 연골 유래 연골세포로부터 연골세포/세포외 기질(ECM) 막을 수득한 다음, 수득된 연골세포/ECM 막을 배양하여 지지체가 없는 펠릿(pellet)-타입 구조물을 수득하고, 상기 수득된 펠릿(pellet)-타입 구조물을 냉동건조하는 것을 특징으로 하는 세포 유래 세포외 기질(ECM) 지지체(scaffold)의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 세포 유래 세포외 기질 지지체는 지지체-프리 시스템에 의해 조직공학적으로 제작 및 배양된 연골로부터 제조된 다공성 지지체로 조직배양중 그크기가 줄어들지 않아 연골 재생에 유용하다.

세포외 기질(ECM) 지지체, 연골조직, 연골세포, 조직공학

Description

세포 유래 세포외 기질 지지체의 제조방법 {Method for Preparing a Cell―Derived Extracellular Matrix Scaffold}

도 1은 본 발명에 따른 최종형태의 세포외 기질(ECM) 지지체 (extracellular matrix scaffold) 사진으로, 눈금은 mm 단위를 나타내는 스케일 바(scale bar)이다.

도 2는 본 발명에 따른 세포외 기질(ECM) 지지체의 주변(A)과 중앙부위(B) 전자현미경(SEM) 이미지(×30)사진으로, 화살표는 과밀집 부위를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 세포외 기질(ECM) 지지체에 부착된 세포와 부착률에 대한 초기(initial) 세포접종 농도의 영향을 나타낸 것으로, 별표(*)는 통계학적 의미를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명에 따른 세포외 기질(ECM) 지지체에 0시간(A, C) 및 12시간(B, D) 후-접종(post-seeding)한 연골세포의 형태를 각각 ×200 및 ×1000로 확대한 SEM 사진이다. 여기서, 흰색 화살표는 배양시간에 따른 세포형태학적 변화를 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명에 따른 체외(in vitro) 배양된 연골세포를 접종한 세포외 기질(ECM) 지지체에서 형성된 새로운 연골조직(neocartilage)을 육안으로 관찰한 사 진으로, 눈금은 mm 단위를 나타내는 스케일 바이며, W는 주(week)를 나타낸 것이다.

도 6은 각각 1, 2 및 4주 동안 체외에서 배양하여 조직공학적으로 제조된 연골조직의 조직학적 검사결과를 각각 ×20 및 ×200로 관찰한 사진이다. 여기서, 검은 화살표는 배양시간에 따른 지지체 벽 두께의 변화를 나타낸 것이다.

도 7은 각각 1, 2 및 4주 동안 체외에서 배양하여 조직공학적으로 제조된 연골조직의 면역조직화학적 검사결과를 ×20 및 ×200로 관찰한 사진이다. 여기서 G는 1차 항체를 처리하지 않은 음성대조군, H는 1차 항체를 모두 처리한 양성대조군을 ×200로 관찰한 사진이다.

도 8은 제1, 2형 교원질(collagen)에 대한 웨스턴 블랏(Western blot)한 전기영동 사진이다.

본 발명은 세포 유래 세포외 기질(ECM) 지지체의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 동물의 연골 유래 연골세포로부터 연골세포/세포외 기질(ECM) 막을 수득한 다음, 수득된 연골세포/ECM 막을 원심분리한 후 배양하여 지지체가 없는 펠릿(pellet)-타입 구조물을 수득하고, 상기 수득된 펠릿(pellet)-타입 구조물을 냉동건조하는 것을 특징으로 하는 세포 유래 세포외 기질(ECM) 지지체(scaffold)의 제조방법에 관한 것이다.

관절 연골세포는 연골에서만 발견되는 특화된 중간엽 유래 세포이다. 연골은 연골세포에 의해 생성된 세포외 기질에 의존하는 물리적 성질을 가진 무혈관성 조직으로 연골 내 뼈가 발생하는 동안, 연골세포는 성숙되어 제10형 교원질의 발현의 개시에 의해 특징화되는 세포비대증을 초래한다 (Stephens, M., et al ., J. Cell Sci ., 103:1111, 1993).

1980년대 후반에 시작된 조직공학(tissue engineering) 기술은 손상되거나 역기능을 초래하는 조직을 대체하기 위해 생물학적으로 대용할 수 있는 조직을 만들기 위한 다양하면서도 혁신적인 접근방법이다. 조직공학적으로 만들어진 연골조직은 외상 또는 병리적 원인에 의해 발생한 자가-치유 능력이 제한된 연골을 치료하는데 매우 중요하다.

손상된 연골을 치료하기 위해 이용되는 자가 연골세포 이식(autologous chondrocytes implantation, ACI) 방법은 연골손상부위에서 초자 연골조직을 재생하기 위해 임상적으로 승인된 세포이식 치료방법이지만(Brittberg, M., et al ., New Eng. J. Med ., 331:889, 1994), 현재는 연골세포나 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell, MSC)에 대한 연구의 발전과 함께 여러 가지 지지체를 이용한 세포이식 및 체외에서(in vitro) 조직공학적 연골을 제조하는 진보된 방법들이 발전되고 있다 (Lee, C.R., et al ., Tissue Eng ., 6:555, 2000, Li, W.J., et al ., Biomaterials , 26:599, 2005).

3차원(3D) 배양 환경을 제공하는 지지체는 접종세포의 증식과 분화뿐만 아니 라 조직공학적으로 제조된 연골조직의 궁극적이 품질에 영향을 준다. 현재는 합성이나 천연재료로부터 유래한 다양한 물질들이 적절한 지지체로써 사용되고 있다. 이러한 지지체들은 스폰지, 겔, 섬유 및 미세구슬(microbead) 등의 여러 가지 형태로 사용되고 있는데 (Honda, M.J., et al ., J. Oral Maxillofac Surg ., 62:1510, 2004, Griogolo, B., et al ., Biomaterials , 22:2417, 2001, Chen, G., et al ., J. Biomed. Mater . Res . A, 67:1170, 2003, Kang, S.W., et al ., Tissue Eng., 11:438, 2005), 그중 가장 흔히 사용되는 것은 세포부착률을 향상시킬 수 있고, 부피에 대한 고율의 표면장력을 유지할 수 있는 다공성 구조이다. 하지만, 생체 내(in vivo) 및 체외(in vitro)에서 몇몇 응용성이 성공적으로 보고 되었음에도 불구하고, 고품질의 조직-공학적 연골을 제조할 수 없어 임상적으로 응용할 수 없는 문제점이 있었다. 따라서, 상기 문제점을 해결하기 위해 지지체를 구조적, 기능적 측면에서 개선할 필요성이 있었다.

이에, 본 발명자들은 구조적으로 복잡하나 천연 단백질과 3차원 구조에 여러 가지 고분자들이 잘 정렬된 혼합물인 세포외 기질(ECM)을 지지체로 사용하면 결국 초자 연골조직의 제조에 대한 연구를 발전시킬 수 있을 것으로 판단하였다.

종래 동종(allogenic), 또는 이종(xenogenic) 세포외 기질(ECM)은 살아있는 조직으로부터 얻어졌고, 세포를 제거(acellularized)하여 지지체로써 사용되었다. 현재까지 소장의 점막하층(SIS)과 방광(UBS), 인간 양막(HAM), 아킬레스건은 ECM 지지체의 주요한 내원이었으며, 일부는 전임상시험 동물 연구와 임상적 응용에서 사용되고 있다. 한 예로, HAM은 각막재생에 유용했으며, SIS는 요로(urinary tract), 경막(dura mater), 전방십장인대(anterior cruciate ligament) 및 혈관재건(vascular reconstruction)에 이용되고 있다.

연골세포에서 유래한 세포외 기질(ECM) 지지체는 기본적으로 연골조직 세포외 기질(ECM)의 주성분인 글리코산아미노글리칸(GAG) 및 교원질로 구성되어 있으며, 연골세포 물질대사에 중요한 미량원소를 포함하고 있다. 세포외 기질(ECM) 지지체는 연골세포의 세포 분화를 위한 천연 구조물을 제공하므로, 이러한 세포외 기질(ECM)로 고품질의 조직공학분야에 응용할 수 있는 지지체를 제조할 필요성이 있었다.

최근, 주입성 연골세포 이식물(대한민국 특허출원 10-2004-7017580), 생분해성 글리콜라이드/ε-카프로락톤 공중합체로부터 제조된 조직공학용 다공성 지지체(대한민국 등록특허 10-0408458), 창상 피복재 및 조직공학 구조체용 중화 키토산 스폰지 제조방법 및 이에 의해 제조된 중화 키토산 스폰지(대한민국 특허출원 10-2003-0023929), 자연적으로 분비되는 세포외 기질 조성물과 그 방법(대한민극 특허출원 10-1997-708695)에 대한 보고가 있었으나, 살아있는 조직 유래의 지지체는 세척용액(detergent solution)에서 세포용해(decellularization)를 하여야 하므로 제조과정이 복잡하고, 경도가 너무 높고, 다공성이 낮아 세포 부착률이 낮으며, 세포-접종된 지지체 및 생체 내(in vivo) 이식조직이 수축되어 조직손상부위에 부적당한 이식조직을 만들거나, 심지어 이식조직의 느슨함을 유발하여 숙주 조직으로부터 분리되기도 하는 문제점이 있었다.

이에 본 발명자들은, 체외(in vitro)에서 제조할 수 있고, 적절한 경도와 높은 다공성을 가지며, 조식 이식시에 이상 반응이 없고, 이식 후 연골조직의 수축을 일으키지 않으면서, 임상에 적용가능한 세포외 기질(ECM) 지지체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 체외에서 연골세포를 이용하여 조직공학적 연골을 제조한 후 세포를 제거하고 동결건조하는 방법으로 다공성 세포외 기질(ECM) 지지체를 제조하고, 상기 세포외 기질(ECM) 지지체가 이식 후에도 조직수축이 일어나지 않고, 세포분화를 장기간 유지시킬 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 체외(in vitro)에서 지지체-프리(scaffold-free) 시스템에서 조직공학적으로 세포외 기질(ECM) 지지체를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 다공성을 가지면서, 세포분화를 장기간 유지시킬 수 있고, 임상 및 연골조직공학 분야에 적용가능한 다공성 세포외 기질(ECM) 지지체를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제1구현예로, (a) 동물의 연골로부터 연골세포를 분리한 다음, 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 연골세포로부터 연골세포/세포외 기질(ECM) 막을 수득하는 단계; (c) 상기 수득된 연골세포/ECM 막을 배양하여 지지체가 없는 펠릿(pellet)-타입 구조물을 수득하는 단계; 및 (d) 상기 수득된 펠릿(pellet)-타입 구조물을 냉동건조하여 세포외 기질 지지체를 수득하는 단계를 포함하는 세포 유래 세포외 기질 지지체(ECM scaffold)의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 제2구현예로, (a) 동물의 연골로부터 연골세포를 분리한 다음, 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 연골세포로부터 연골세포/세포외 기질(ECM) 막을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수득된 연골세포/ECM 막을 폴딩시키거나, 여러개 중첩시켜 세포외 기질 지지체를 수득하는 단계를 포함하는 세포 유래 세포외 기질 지지체(ECM scaffold)의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 동물은 돼지인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 배양단계에서 세포외 기질 지지체의 강도를 높이고, 지지체의 구성성분과 구조가 천연연골과 유사하도록 하기 위하여, 성장인자를 추가적으로 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 성장인자로는 IGF(insulin-like growth factor), FGF(fibroblast growth factor), TGF(조직성장인자), BMP(골 형성 단백질), NGF(신경성장인자) 및 TNF-α로 구성된 군에서 선택되는 것을 사용할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 상기 배양단계에서 연골세포의 증식 및 ECM의 분비를 촉진시키기 위하여, 배양액을 초음파로 처리하거나, 배양액에 물리적 압력을 가하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 제조되는 ECM 지지체의 사이즈를 크게 하기 위하여, 2개 이상의 시험관에서 배양된 세포로부터 연골세포/세포외 기질 막을 얻은 다음, 이들 을 각각 혼합하여 원심분리 다음, 큰 배양접시(예: 150mm 배양접시)에서 배양할 수도 있다. 이렇게 제조되는 큰 사이즈의 ECM 지지체는 보다 높은 임상적용 가능성을 가지게 된다.

본 발명의 제1구현예에 있어서, 상기 (c) 단계는 연골세포/ECM 막을 쪼개서 모은 다음, 배양하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (d) 단계는 상기 펠릿(pellet)-타입 구조물을 -15~-25℃에서 얼리고 녹이는 절차를 3~5회 반복한 다음, 냉동건조하는 것을 특징으로 할 수 있으며, (e) 상기 수득된 세포외 기질 지지체(ECM scaffold)를 가공하여 디스크 모양의 세포외 기질 지지체를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 조직배양 중 그 크기가 줄어들지 않고, 10~1000㎛의 기공직경을 가지는 세포 유래 다공성 세포외 기질 지지체를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 세포외 기질 지지체에 연골 구성성분을 첨가 및 혼합하는 것을 특징으로 하는 자연상태와 유사하거나 기계적 강도가 우수한 세포외 기질 지지체의 제조방법을 제공한다. 상기 연골 구성성분은 교원질 또는 단백당인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 연골재생뿐만 아니라 뼈 혹은 뼈와 연골의 복합체를 재생하기 위해, 상기 세포외 기질 지지체에 생분해성 고분자를 부착시키는 것을 특징으로 하는 세포외 기질 복합지지체의 제조방법을 제공한다. 상기 생분해성 고분자는 교원질, PLGA(poly-lactic-co-glycolic acid), PLA(polylactate) 및 PHA(polyhydroxyalkanoate)로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에서는 연골세포가 고품질의 연골조직으로 성장하고 발전할 수 있도록 최적의 3차원적(3D) 환경을 제공할 수 있는, 연골세포 자가-생산된 세포외 기질(ECM)인 세포 유래 세포외 기질(ECM) 지지체를 제조하였다.

본 발명에 따른 ECM 지지체를 제조하기 위해, 돼지 연골을 분리하여 고밀도로 3~4일 단층 배양한 다음, 수득한 연골세포막을 원심분리하여 지지체-프리(scaffold-free) 펠릿-타입 연골 구조물(cartilage construscts)을 수득하고, 이를 3주 동안 체외(in vitro)에서 배양하였다. 상기 배양된 구조물들을 냉동건조한 후 연골-특이적 세포외 기질(ECM)을 함유하고 있는 지지체가 디스크 형상으로 되도록 생검법 펀치(biopsy punch)로 최대한도로 가공하여 신규한 세포외 기질(ECM) 지지체를 제조하였다.

상기 제조한 세포외 기질(ECM) 지지체의 표면 구조를 SEM으로 관찰한 결과 천연연골조직의 지지체에 비해, 본 발명에 따른 세포외 기질(ECM) 지지체의 조밀한 정도가 낮았으며, 다공성과 기공크기를 측정한 결과, 각각 평균(n=6) 90±10.4% 및 113±26㎛이었으며, 다공율은 89.1±8.3%이었고, 인장강도는 0.34±0.09 MPa이었다.

본 발명에 따른 세포외 기질(ECM) 지지체의 교원질 타입(type)을 SDS-PAGE로 분석하고, 글리코스아미노글리칸(GAG) 함량을 측정하여 천연 연골조직과 비교한 결과, 교원질 타입은 타입Ⅱ로 확인되었고, 전체 글리코스아미노글리칸(GAG) 및 교원질 함량은 각각 108.1±19.1 ㎍/㎎ 및 53.8±6.7 ㎍/㎎ (건조중량 당)로 천연 연골조직의 1/3 정도였다.

본 발명에 따른 세포외 기질(ECM) 지지체에 표현형이 유지된 토기 연골세포(P1, rabbit chondrocytes)를 동적으로(dynamic) 접종하여 SEM과 조직학적 이미지를 분석한 결과, 접종한 연골세포가 지지체 벽에 잘 부착되어 있는 모습을 관찰할 수 있었고, 세포 부착률은 58±6%이었다. 연골세포를 접종한 세포외 기질(ECM) 지지체를 체외(in vitro)에서 4주 동안 배양하면서, 각각 1, 2, 4주 때 형성된 조직의 외관관찰, 부피변화, 및 조직학적으로 관찰하여 연골조직의 형성정도를 관찰한 결과, 체외(in vitro)에서 배양 시간의 경과에 따라 점점 표면이 매끄러워진 흰색 연골모양의 조직을 관찰할 수 있었고, 강도는 강해지는 반면, 부피의 변화는 관찰되지 않아, 초기 조직크기에 대한 유의적인 수축은 일어나지 않음을 확인하였다.

또한, 사프라닌(Safranin) O 및 알시안 블루(Alcian blue) 염색법을 이용한 조직학적 분석결과, 황산화된 프로테글리칸(GAG)은 끊임없이 축적되어, 지지체 내부기공을 충전하였음을 확인하였고, 면역조직화학적 분석을 통해 기공지역에 있는 세포주위 지역에 형성된 제2형(typeⅡ) 교원질을 검출하였다. 새로운 연골조직으로부터 전체 단백질을 추출한 후 이뮤노블라팅(immunoblotting)을 수행한 결과, 주요 세포외 기질(ECM) 구성성분은 조직에 있는 제2형 교원질임을 확인하였다. 이는 연골세포의 표현형이 장기간 유지 및 누적되어 있음을 나타내는 것으로, 본 발명의 세포외 기질(ECM) 지지체 환경에서 세포분화가 장기간 유지될 수 있음을 확인하였다.

상기 결과로부터, 본 발명에 따른 신규한 세포외 기질(ECM) 지지체는 체외(in vitro)에서 천연적인 3차원적(3D) 환경을 제공하여 연골조직 형성이 우수하다는 것을 확인할 수 있었고, 임상에 응용이 가능할 뿐만 아니라 연골조직공학에도 응용이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

하기 실시예에서는 본 발명에 따른 방법으로 돼지 관절연골을 이용하여 ECM 지지체를 제조하는 방법에 관해서만 기술하고 있으나, 다른 동물의 연골을 이용해서 ECM 지지체를 제조하는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다.

특히 하기 실시예에서는 본 발명의 제1구현예에 따른 ECM 지지체의 제조방법에 대해서만 예시하고 있으나, 제1구현예에 의해 수득된 연골세포/ECM 막을 폴딩시키거나, 여러개 중첩시켜 ECM 지지체를 제조하는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다. 상기 폴딩은 연골세포/ECM 막을 접어서 일정 모양을 가지도록 하는 성형하는 과정을 의미한다. 상기 폴딩 또는 중첩에 의해 펠릿(pellet)-타입 연골세포/ECM 막 으로부터 보다 입체적인 구조의 지지체를 제조할 수 있다.

또한, 하기 실시예에서는 그 구체적인 예시가 없으나, 본 발명에 따른 세포외 기질 지지체에 교원질, 단백당과 같은 연골 구성성분을 첨가 및 혼합하여 자연상태와 유사하거나 기계적 강도가 우수한 세포외 기질 지지체를 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 아울러, 본 발명에 따른 세포외 기질 지지체에 교원질 또는 생분해성 고분자를 부착시켜 세포외 기질 복합지지체를 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다.

실시예 1: 연골세포(chondrocytes)의 분리

관절연골은 2~3주령된 돼지의 무릅관절로부터 분리하였다. 연골조각을 다른 조직으로부터 조심스럽게 분리한 다음, PBS(phosphated buffered saline)로 세척한 후, 37℃에서 1시간 30분 동안 0.05%(w/v) 프로나아제 (Boehringer Mannheim, 독일)로 처리하였다. 이를 PBS 버퍼로 두 번 세척한 후, 0.2%(w/v) 콜라게나제(Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ)를 새로 태어난 송아지 혈청 (NCS, Hyclone, Utah, USA) 5%가 첨가된 DMEM (Dulbecco's Modified Egle Medium, Gibco, Grand Island, NY)에서 12시간 동안 배양하였다. 연골조직이 완전히 소화되어 방출된 연골세포를 600×g에서 10분 동안 원심분리한 다음, 침전된 연골세포를 두 번 세척 후, 조직 배양접시(배양접시당 1.9×10⁵의 밀도에 100mm(dia.)×20mm(h))에 접 종하였다.

실시예 2: 연골조직 구조물과 체외(in vitro) 배양의 준비

실시예 1에서 분리한 연골세포(chondrocytes)를 10% NCS(new-born calf serum), 50units/mL 페니실린, 50㎍/mL 스트렙토마이신, 50㎍/mL L-아스코브산이 첨가된 DMEM을 가지는 단층(monolayer)으로 3~4일 동안 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고, 배양접시로부터 연골세포/ECM 막을 얻기 위해 0.05% 트립신-EDTA (Gibco)를 첨가하였다. 수득한 막을 와이드보어(widebore) 피펫을 사용하여 조심스럽게 분리한 후, 5% NCS가 첨가된 30mM DMEM이 채워진 50mL 삼각튜브(conical tube)에 각각 옮긴 다음, 각 튜브를 펠릿(pellet)-타입 구조물을 만들기 위해 600×g에서 20분간 원심분리한 후, 37℃에서 12시간 배양하였다. 상기 배양된 구조물들(constructs)을 6-웰 배양접시에 옮겨 3주동안 2차 배양하였다. 상기 배양과정에서, 5mL 배지를 1주일에 세 번씩 바꾸어 주었다. 그 결과, 상기 구조물들은 새로운 연골조직(neocartilage tissue)으로 성장하였다.

실시예 3: 세포외 기질(ECM) 지지체의 준비

상기 실시예 2에서 3주 배양하여 수득한 새로운 연골조직 구조물들을 PBS로 세척한 후, 3일 동안 -20℃에서 얼리고 녹이는 절차를 3번 반복한 다음, -56℃, 5m Torr에서 48시간 동안 냉동건조하였다. 생검법 펀치(biopsy punch, 6mm dia.)로 다공성 냉동-건조 시료를 디스크 모양의 중심과 링 모양 주위 두 부분으로 나누었다. 중심지역의 차원의 균일성(dimensional consistency)으로 인해, 디스크 모양의 세포외 기질(ECM) 지지체의 프리폼(preform)으로 선택하였다. 상기 프리폼된 물질을 추가적으로 가공하여, 표면층을 1mm 보다도 적게 제거한 다음, 최종형태의 세포외 기질(ECM) 지지체를 제조하였다 (도 1).

3주 배양한 새로운 연골(neocartilage) 구조물을 냉동-건조시키면, 적당한 경도를 가지는 스폰지 형태로 변하는데, 이는 냉동 건조된 시료(~ 8mm dia.)의 불규칙한 모양에 기인하는 것보다는 6mm 생검법 펀치(biopsy punch)를 사용하여 주변부로부터 중앙부위를 분리하였기 때문이며, 결과적으로 디스크-모양의 프리폼 세포외 기질(ECM) 지지체가 생성된다.

도 2는 세포외 기질(ECM) 지지체에서 주변(A)과 중앙부위(B)의 SEM 이미지(×30)사진으로, 냉동건조된 연골 구조물의 주변층은 세포 접종을 위한 다공성을 가지지 않는 부적절한 외형을 가짐을 확인할 수 있었다. SEM에 의해 분석된 프리폼 지지체의 주변층은, 도 2A에서 화살표로 나타낸 것과 같이, 과밀집되어 접종된 연골세포가 내부지역으로 통과하지 못하였다. 따라서, 다공성 ECM 지지체를 제작하기 위해, 주변층을 최소한도로 제거하여 전체지역에 걸쳐 높은 다공성 미세구조를 노출시켜야만 했다 (도 2B).

실시예 4: 총 글리코산아미노글리칸(GAG) 및 교원질 내용물의 생화학적 분석

상기 실시예 3에서 제조한 세포외 기질(ECM) 지지체의 GAG와 교원질 조성물을 측정하기 위해, 상기 세포외 기질(ECM) 지지체를 60℃ 파파인 용액(5mM L-시스 테인, 100mM Na₂HPO₄, 5mM EDTA, 파파인 타입 Ⅲ 125 ㎍/mL, pH 7.5)에서 24시간 동안 분해한 후, 12,000×g, 10분 동안 원심분리하였다.

원심분리한 상청액의 GAG양을 측정하기 위해 DMB 비색분석법(colorimetric assay, Heide, T.R. and Gernot, J., Histochem . Cell Biol ., 112:271, 1999)을 수행하였고, 전체 교원질양은 Heide tullberg-reinert method(Schmidt, C.E. and Baier, J.M., Biomaterials, 22:2215, 2000)를 사용하여 측정하였다.

분해된 상기 시료를 37℃, 96-웰 플래이트에서 건조한 후 교반기에서 1시간 동안 피크르산-포화 용액 (1.3%, Sigma, MO, USA)에 녹여진 1mg/mL 시리우스 레드(Sirius red) 염색용액 (pH3.5)과 반응시켰다. 각 웰에 있는 염색-시료 복합체를 0.01N HCl로 다섯 번 씻어내고, 0.1N NaOH에 용해시킨 다음, ELISA READER (BIO-TEK, Instruments, INC., 미국)를 사용하여 550nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 생화학적으로 분석된 전체 GAG 및 교원질 내용물은 각각 108.1±19.1㎍/㎎ (건조중량) 및 53.8±6.7㎍/㎎ (n=6)로 천연 연골조직의 1/3 정도였다.

실시예 5: 기계적 특성 측정

Universal Testing Machine (Model H5K-T, H.T.E, 영국)을 사용하여 상기 실시예 3에서 제조한 세포외 기질(ECM) 지지체의 기계적 인장강도를 측정하였다. 측정하기 전, 시료(n=6)를 균일한 직사각형으로 자른 후, 시료의 양끝자락을 그립으로 잡고, 1mm/min 속도로 잡아당겼다. 피크 부하는 브래이크(break)에서 부하-이동 커브로부터 얻은 후, 각각의 인장강도를 계산하였다. 대조군으로는 상업적 부직 망사(non-woven mesh) PGA 지지체(albany International, NY)를 사용하였다 (표 1).

기계적 특성

	본 발명에 따른 ECM 지지체 (n=6)	망사(mesh) PGA 지지체 (n=6)	P 값
인장강도 (Mpa)	0.34±0.09	0.52±0.07	0.018

표 1은 본 발명에 따른 ECM 지지체의 기계적 특성을 확인한 결과로, 시료를 단축(單軸)적으로 당겨 측정한 최대 인장강도는 평균적으로 0.34±0.09MPa (n=6)이었다. 비록 본 발명에 따른 세포외 기질(ECM) 지지체는 인장강도가 상업화된 PGA 지지체보다 낮았으나, 지속적인 경도를 가지므로 전체 제조공정 동안 손상되지 않는 상태로 남아있음을 확인할 수 있었다. 교차결합을 이용한 천연 지지체의 개선된 경도를 얻는 방법(Pieper, J.S., et al ., Biomaterials 21:581, 2000)을 이용할 경우, 본 발명 따른 세포외 기질(ECM) 지지체의 인장강도를 증가시킬 수 있다. 또한 본 발명에 따른 ECM 지지체에 교원질, 단백당 등의 연골 구성성분을 첨가 혼합하여 기계적 강도를 증가시킬 수도 있다.

실시예 6: 적정 접종 세포밀도 및 세포부착률의 결정

상기 실시예 3에서 제조한 세포외 기질(ECM) 지지체를 멸균된 70% 에탄올에 1시간 동안 담근 후 PBS로 씻어내고, 이를 세포 접종에 앞서 12시간 동안 DMEM에 담그어 놓았다. 표현형이 유지된 토기 연골세포(P1)를 뉴테이터(nutator)를 사용하여 1시간30분 동안 동적으로 세포외 기질(ECM) 지지체(n=5, 각 밀도)에 접종하기 위한 최적 접종 농도를 결정하기 위해, 1, 2, 3 및 4×10⁶ cells/mL의 4개의 다른 세포밀도를 사용하여 배지와 플래이트 벽에 있는 방출된 세포를 집계하여, 1시간 후-접종(post-seeding)에서 부착된 세포수 및 세포부착률을 확인하여 결정한 후, 적절한 세포 밀도를 접종한 세포외 기질(ECM) 지지체를 1, 2 및 4주 동안 배양하였다. 상기 실시예 2에서 언급한 것과 같은 배지를 사용하였고, 1주일에 배지를 세 번 바꾸어 주었다.

도 3은 세포외 기질(ECM) 지지체에 부착된 세포수와 세포부착률에 대한 초기(initial) 세포 접종 농도의 영향을 나타낸 것으로, 표현형이 유지된 토기 연골세포(passged rabbit chondrocyte, P1)를 동적으로 세포외 기질(ECM) 지지체에 1, 2, 3 및 4×10⁶ cells/mL의 네 가지 다른 세포 접종밀도로 접종 후, 한 시간 내에 부착된 세포수를 측정한 결과, 부착된 세포수는 접종밀도에 따라 증가하여 각각 0.7±0.2×10⁶, 1.4±0.3×10⁶, 1.7±0.2×10⁶및 1.7±0.3×10⁶cells/mL의 증체기까지 도달하였다 (도 3A). 접종농도 1×10⁶ cells/mL의 세포밀도를 제외하고는 측정된 대조군 사이에서 통계학적으로 유의적인 차이가 없었다.

또한, 세포부착률의 계산은 두 가지 요인인 비부착성 세포수 및 전체 접종된 세포수에 근거하여 계산하였다. 그 결과, Y도 3B에 나타난 바와 같이, 세포 접종 밀도가 증가할 때, 평균 세포부착률(%)은 각각 69±19%, 70±14%, 58±6% 및 43±8%로 접종밀도에 반비례하였다.

상기 결과로부터, 세포부착률은 도 3A에서 나타난 세포수의 최적범위와 초기 접종밀도가 일치하지 않음을 확인하였다. 세포 접종밀도와 세포부착률 사이의 상호관련성은 없는 것으로 판단되었다. 따라서 지지체에서 접종된 가능한 많은 세포가 유리하다고 판단되어, 비록 평균 세포접착률은 가장 높지 않았으나, 3×10⁶ cells/mL의 세포 접종밀도를 본 발명에서 사용하였다.

실시예 7: 세포외 기질(ECM) 지지체의 다공성과 기공크기

수은 침투 기공측정기(mercury intrusion porosimeter, Micromeritics Co., Model AutoPore Ⅱ 9220, 미국)를 사용하여 세포외 기질(ECM) 지지체의 다공성과 기공크기를 측정하였다. 지지체를 용기(chamber)에 넣고, 밀봉처리한 후 진공을 가한 다음, 수은을 채워 넣고, 용기 내의 압력을 0.5에서 500 psi로 프로그램된 수준까지 증가시켰다. 압력이 가해지면 수은이 기공 내로 침투하여 용기의 수은 높이가 감소하는데, 이 감소를 압력의 함수로써 측정하여 기공에 침투한 수은의 부피를 알 수 있었다.

그 결과, 최종형상 세포외 기질(ECM) 지지체의 평균 기공직경 및 다공성(porosity)은 각각 113±26㎛(77~147㎛ 범위) 및 90±10.4%(78~106%)(n=6)임을 확인하였다.

지지체의 높은 다공성은 세포접착에 대해 보다 큰 표면면적을 제공하기 때문에 매우 중요한 특성(O'Brien F.J., et al ., Biomaterials, 26:433, 2005)으로, 상기 결과로부터 본 발명에 의한 세포외 기질(ECM) 지지체는 평균 약 90% 이상의 다공성을 보유함으로써 조직공학적 응용에 유용하다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 8: 주사형 전자현미경 (scanning electron microscope, SEM) 분석

세포외 기질(ECM) 지지체 절단부의 미세구조를 분석하기 위해, 이중-스틱 탄소 테입을 가진 알루미늄 스텁(aluminum stub) 위에 시료를 올려놓은 후, 이를 스퍼터링 시스템(sputtering system, Sanyu Denshi, Tokyo, Japan)에 옮긴 다음, 시료 각각을 60% 금과 40% 팔라듐으로 2분 동안 20nm 두께로 코팅하였다.

또한, 실시예 6에서 지지체에 접종된 연골세포를 관찰하기 위해, 상기 연골세포를 0.1M PBS 버퍼에서 4℃, 2시간 동안 2.5% 글루타알데히드(glutaaldehyde)로 고정시켰다. 시간에 따른 형태학적 변화를 비교하기 위해, 대조군은 12시간 후-접종(post-seeding) 내에서 나중에 고정시켰다. 상기 고정된 세포를 70~100%의 일련의 알코올 농도로 탈수한 후, PBS로 2번 씻어낸 다음, 안전면도날(razor blade)을 이용하여 상기 시료를 반으로 자르고, 횡단면은 2분 동안 이온 코팅기인 스퍼터 코오터(sputter coater)로 코팅하여 SEM(JSM-6400Fs; JEOL, Tokyo, Japan) 분석을 수행하였다.

도 4는 세포외 기질(ECM) 지지체에 0시간(A, C) 및 12시간(B, D) 후-접종(post-seeding)한 연골세포를 각각 ×200 및 ×1000로 SEM 관찰한 사진으로, 연골세포가 0시간과 12시간에 지지체의 표면에 부착되어 있는 것을 확인하였다. 접종 초기일 때(0시간) 세포의 형태는, 도 4C에서 흰색 화살표로 나타난 바와 같이, 원형이었으나, 12시간 후에는, 도 4D에서 나타난 바와 같이, 타원형으로 변하였다. 상기 결과로부터, 12시간 후-접종된 연골세포는 납작한 형상으로 표면에 보다 안정하게 부착되어 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 9: 조직학적 분석

본 발명에 따른 세포외 기질(ECM) 지지체를 이용하여 배양한 새로운 연골조직을 체외(in vitro)에서 최소 24시간 동안 4% 포르말린으로 고정시킨 다음, 파라핀에 포매하여 4㎛ 두께로 절단한 후, 축적된 황산화된 프로테오글리칸 검출을 위해 횡단면을 사프라닌(Safranin) O와 알시아닌 블루(Alcian blue)로 염색하였다.

도 5는 체외(in vitro) 배양된 세포외 기질(ECM) 지지체를 기반으로 형성된 새로운 연골조직의 사진으로, 연골세포가 접종된 세포외 기질(ECM) 지지체를 0(initial), 1, 2 및 4주(W) 동안 체외(in vitro)에서 배양하였으나, 전체 배양기간 동안 유의할만한 새로운 연골조직의 실질적인 크기(size) 감소는 없었다 (도 5). 육안적 검사를 한 결과, 조직의 성숙은 시간에 따라 개선되었고, 4주 배양하였을 때는 매끄럽고 광택 나는 표면을 확인할 수 있었다.

도 6은 도 5와 같이 1, 2 및 4주 동안 배양된 조직공학적 연골조직의 조직학적 특징을 확인하기 위해 각각 ×20 및 ×200로 관찰한 사진으로, 도 6A-F는 사프라닌(Safranin) O, 도 6G-L은 알시안 블루(Alcian blue)로 염색하여 나타낸 사진이다. 검은 화살표로 나타낸 것처럼, 세포외 기질(ECM) 지지체 벽의 두께는 시간에 따라 점차 얇아지는데, 이는 주로 지지체의 생분해에 기인하는 것으로 판단되었다 (도 6B, D 및 F).

상기 결과로부터, 배양중에 세포외 기질(ECM) 지지체에서 연골조직의 세포외기질이 잘 형성되고 누적된다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 10: 면역조직화학적 분석

제2형(type-Ⅱ) 교원질의 면역조직화학적 분석을 위해, 상기 실시예 9에서 준비한 절단부위를 PBS 버퍼로 씻어내고, 3% H₂O₂로 5분간 처리한 다음, 조직 투과성을 높이기 위해 0.15% Triton X-100과 반응시켰다.

상기 준비한 시료를 1% bovine serum albumin(BSA)로 비특이적 결합을 차단하고, 절단부위 슬라이드(section slides)를 1:200으로 희석한 마우스 항토끼(mouse anti-rabbit) 제2형 교원질 단일클론항체 (monoclonal antibody, Chemicon, Temecula, CA)로 1시간 동안 처리한 다음, 1:200으로 희석된 비오틴이 부착된 이차항체 (biotinylated antibody, DAKO LSAB system, Carpinteria, CA)로 1시간 동안 처리한 다음, 이를 PBS로 씻어낸 후, 상기 절단부위 슬라이드를 30분 동안 상온에서 퍼옥시다제-융합된 스트렙타아비딘 용액(DAKO)으로 처리하였다. 상기 처리된 슬라이드를 Mayer's 헤마톡실린(hematoxylin, Sigma, St Louis, MO)으로 대비염색한 다음, 현미경 관찰(Nikon E600, Japan)을 위해 마운트 용액으로 고정시켰다. 세포 유래 세포외 기질(ECM) 지지체의 교원질과 본 발명에서 사용한 항체의 상호작용의 일치성을 관찰하기 위해, 이뮤노스테잉(immunostaing)을 1차 항체를 처리하지 않은 음성대조군과 1차 항체 및 2차 항체를 모두 처리한 양성 대조군과 같은, 단지 세포 유래 세포외 기질(ECM) 지지체만을 위해 수행하였다.

도 7은 각각 1, 2 및 4주 동안 배양한 새로운 연골조직을 면역조직화학적으로 분석하여 ×20 및 ×200로 관찰한 사진으로, 제2형 교원질이 풍부한 세포주변부와 기공부위가 검출되었다. 여기서 G는 1차 항체를 처리하지 않은 음성대조군, H는 1차 항체 및 2차 항체를 모두 처리한 양성대조군을 ×200로 관찰한 사진이다. 부가적으로, 1차 항체를 처리하지 않은 음성대조군(도 7G)과 1차 항체 및 2차 항체를 모두 처리한 양성대조군(도 7H) 사이에 유의적인 차이가 없어, 세포 유래 세포외 기질(ECM) 지지체로부터 추출된 단백질과 본 발명에서 사용한 항체단백질 사이에 상호작용이 있음을 확인하였다.

실시예 11: 웨스턴 블랏(Western blot) 분석

체외에서 연골세포를 접종한 세포외 기질(ECM) 지지체를 배양하는 동안, 상기 새로운 연골조직의 표현형 안전성(phenotypic stability)을 확인하기 위해 웨스턴 블랏을 사용하여 새로 형성된 연골조직에 있는 제2형 교원질을 확인하였다.

전체 단백질은 120mM NaCl, 0.5% Nonidet p-40(NP-40), 2㎍/mL 아프로티닌(aprotinin), 2㎍/mL 페스테틴(pestetin), 2㎍/mL 류페틴(leupetin) 및 100㎍/mL 페닐메틸설포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)를 포함하는 40mM Tris-HCl(pH 8.0)의 세포용해 버퍼를 사용하여 조직으로부터 추출하였다. BCA 방법(Shihabi, Z.K. and Dyer R.D., Ann . Clin . Lab . Sci ., 18(3):235, 1988)에 의해 측정된 단백질의 동일한 양을 8% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 로딩하여 분리하였다. 상기 분리한 단백질을 니트로셀룰로스 막 (nitrocellulose membrane, Millipore, Bedford, MA)에 옮긴 후, 1:1000으로 희석된 마우스 항토끼 제2형 교원질 단일클로날 항체(Chemicon, Temecula, CA)로 우선 처리한 다음, 0.5% Tween 20을 포함하는 TBS (Tris-buffered saline)로 세 번 씻어낸 후, 퍼옥시다제-표지된 양(sheep) 항마우스 IgG(Lockland, Gilbertsville, PA)를 2차 항체로 처리하였다.

상기 처리된 막은 ECL 키트(Amersham, NJ, USA)를 사용하여 시각화한 후, 제2형 교원질 단일클로날 항체의 상호 반응성을 평가하기 위해 전체 단백질을 세포외 기질(ECM) 지지체 자체로부터 추출하여 이뮤노블라팅(immunoblotting)을 수행하였다.

총 단백질을 SDS-PAGE에서 분리한 후, 연골조직의 연골세포 표현형(chondrocytic phenotype)을 제1 및 2형 교원질에 대해 각각 특유한 단일클로날항체 웨스턴 블랏(Western blot)을 사용하여 검출하였다 (도 8).

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 제2형 교원질은 측정한 시간마다 분명하게 검출되었으나, 제2형 교원질은 거의 검출되지 않았다. 그러나, 새로 형성된 연골조직 유래 총 단백질은 이전에 존재하던 단백질과 새롭게 합성된 단백질의 혼합물이었으므로, 항체(마우스 항토끼 제2형 교원질)의 상호반응성은 일치하였다.

상기 결과는 제2형 교원질이 새롭게 합성되었으나, 체외(in vitro) 배양 동안 접종된 토끼 연골세포에 의해 대부분 생산되어 완전히 검출될 수 없었음을 나타내는 것으로, 상기 웨스턴 블랏의 결과로부터, 세포외 기질(ECM) 지지체에서 표현형 유지된 연골세포(P1)는 전사-후 수준(post-translational level)에서 P1의 표현형 안전성(phenotypic stability)을 유지할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 12: 통계학적 분석

본 발명에 있어서, 상기 실시예들에 대한 통계학적 분석은 페어와이즈(pairwise) 비교를 위해 다중 비교와 스튜던트 t 테스트(two-tail)을 위한 평방편차의 일원분석(one-way analysis of variance, ANOVA)을 사용하여 수행하였다. 상기 통계적인 의미는 *p<0.05로써 부여되었다.

상기 실시예로부터, 본 발명에 따른 세포외 기질(ECM) 지지체가 4주 동안 체외(in vitro) 배양을 통해 연골세포의 표현형을 안정적으로 유지할 수 있어 연골세포 대사에 긍적적으로 영향을 미칠 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명에 따른 세포외 기질(ECM) 지지체는 연골-특이 세포외 기질들(ECMs) 및 연골세포 자체에 의해 만들어진 특유한 구조적 구조물의 특징을 보유하고 있어, 연골조직공학에서 새로운 지지체로써 유용하다는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명은 연골세포가 고품질의 연골조직으로 성장 및 발전할 수 있는 최적의 3차원(3D) 환경을 제공함으로써, 연골세포로부터 자가-생산된 세포외 기질(ECM) 지지체를 제조하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 세포 유래 세포외 기질(ECM) 지지체를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 의한 세포 유래 세포외 기질(ECM) 지지체는 다공성이면서도 세포접종 후 조직배양 중 그 크기가 줄어들지 않아 연골 손상 및 결손의 치료를 위한 연골이식용으로 유용하다.

Claims

다음 단계를 포함하는 세포 유래 세포외 기질 지지체(ECM scaffold)의 제조방법:

(a) 동물(단, 인간은 제외)의 연골로부터 연골세포를 분리한 다음, 배양하는 단계;

(b) 상기 배양된 연골세포로부터 연골세포/세포외 기질(ECM) 막을 수득하는 단계;

(c) 상기 수득된 연골세포/ECM 막을 배양하여 지지체가 없는 펠릿(pellet)-타입 구조물을 수득하는 단계; 및

(d) 상기 수득된 펠릿(pellet)-타입 구조물을 냉동건조하여 세포외 기질 지지체를 수득하는 단계.
다음 단계를 포함하는 세포 유래 세포외 기질 지지체(ECM scaffold)의 제조방법:

(a) 동물(단, 인간은 제외)의 연골로부터 연골세포를 분리한 다음, 배양하는 단계;

(b) 상기 배양된 연골세포로부터 연골세포/세포외 기질(ECM) 막을 수득하는 단계; 및

(c) 상기 수득된 연골세포/ECM 막을 폴딩시키거나, 여러개 중첩시켜 세포외 기질 지지체를 수득하는 단계.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 동물은 돼지인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배양단계에서 성장인자를 추가적으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 성장인자는 IGF(insulin-like growth factor), FGF(fibroblast growth factor), TGF(조직성장인자), BMP(골 형성 단백질), NGF(신경성장인자) 및 TNF-α로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배양단계에서 배양액을 초음파로 처리하거나, 배양액에 물리적 압력을 가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 연골세포/ECM 막을 쪼개서 모은 다음, 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, (d) 단계는 상기 펠릿(pellet)-타입 구조물을 -15~-25℃에서 얼리고 녹이는 절차를 3~5회 반복한 다음, 냉동건조하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, (e) 상기 수득된 세포외 기질 지지체(ECM scaffold)를 가공하여 디스크 모양의 세포외 기질 지지체를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항 또는 제2항의 방법에 의해 제작된 10~1000㎛의 기공직경을 가지는 세포 유래 다공성 세포외 기질 지지체.
제10항의 세포외 기질 지지체에 연골 구성성분을 첨가 및 혼합하는 것을 특징으로 하는 자연상태와 유사하거나 기계적 강도가 우수한 세포외 기질 지지체의 제조방법.
제11항에 있어서, 상기 연골 구성성분은 교원질 또는 단백당인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항의 세포외 기질 지지체에 생분해성 고분자를 부착시키는 것을 특징으로 하는 세포외 기질 복합지지체의 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 교원질, PLGA(poly-lactic-co-glycolic acid), PLA(polylactate) 및 PHA(polyhydroxyalkanoate)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.