KR100917422B1 - 늑골 연골로부터 분리된 연골세포를 함유하는 인공 연골 및그의 제조 방법 - Google Patents

늑골 연골로부터 분리된 연골세포를 함유하는 인공 연골 및그의 제조 방법

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Abstract

본 발명은 늑골 연골세포를 계대 배양하여 얻은 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 함유하는 인공 연골 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

늑골 연골로부터 분리된 연골세포를 함유하는 인공 연골 및 그의 제조 방법{Artificial cartilage containing chondrocytes obtained from costal cartilage and preparation process thereof}
본 발명은 늑골 연골로부터 분리된 연골세포를 함유하는 인공 연골 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
관절 연골의 손상은 수백만 명의 사람들이 겪고 있는 매우 보편적인 문제이다. 관절 연골 조직은 무혈관성이고 줄기세포(stem cell)가 없으므로 성인의 연골 재생능력은 제한적이다. 연골 하 뼈에까지 미치는 결함은 섬유 또는 섬유 연골성 조직형성을 유발하며, 수복된 조직은 유리질 연골(hyaline cartilage)과는 생화학적, 생물기계적으로 상이하여 미성숙 퇴화를 겪게 된다.
관절 연골 결함을 수복하기 위한 다양한 임상적 방법들이 개발되어 왔으나, 성공은 매우 제한적이었다. 미세 골절 및 드릴 관절성형술은 관절 하 뼈를 관입하고 골수 내 다기능 줄기세포를 자극하여 결함을 섬유조직 또는 섬유 연골로 수복시킨다. 그러나 이들 방법은 형성된 섬유 연골이 정상 유리질 연골이 갖는 적절한 생화학적, 생물기계적 성질을 결여하고 있고, 넓은 부위의 결함이나 골관절염 관절, 노인에서는 그 효과가 입증되지 않았다는 문제점이 있다. 골연화성 또는 연골 플러그 이식은 작은 크기의 결함을 위해서는 간단하고 효과적이나, 조직을 저체중 부위에서 고체중 부위로 이동시키는 경우 이식 부위에서 비생리학적 부하에 의한 해로운 압축이 야기될 수 있다. 골막 및 연골막 이식편의 이식은 연골을 형성할 수 있는 새로운 세포군집을 도입한다는 잠재적인 이점을 갖지만, 유리질-양(hyaline-like) 수복 조직은 연골 내 골화를 통해 석회화하는 경향이 있다는 문제점이 있다.
나아가 연골세포, 간엽줄기세포(MSCs), 골막 세포 및 연골막 세포를 사용하는 방법들이 시도되어 왔다. MSCs, 골막 세포 및 연골막 세포와 같은 연골형성 선조세포들은 골연골 결함을 수복하기 위한 잠재적인 세포원으로 점점 큰 인기를 얻고 있다. 그러나, 관절 연골세포를 형성하는 선조세포의 능력은 제한되어 있으므로 환자의 나이가 임상 결과와 직접적으로 연관되어 있고, 수복된 유리질양 조직이 석회화하는 경향이 있는 것으로 보고되어 있다.
자가 관절 연골세포 이식(Autologous Articular Chondrocyte Transplantation; ACT)이 작은 부위의 관절 연골 결함에 적용된 바 있으나, 단지 일부 환자에게서만 제한적인 성공을 거두었을 뿐이다. 관절 연골은 효소분해에 의해 성숙 관절 연골로부터 쉽게 분리할 수 있으나, 수확과 이식을 위해 관절을 침습해야하고 매우 고가인 2 단계 과정을 필요로 한다. 따라서 ACT는 2개 이상의 작은 병변, 크기가 10 ㎠ 초과인 병변, 류마티스 또는 면역-관련 관절 환자나 나이에 따른 관절 연골의 퇴화로 인해 나이 든 환자에게는 적용할 수 없다는 단점이 있다.
더욱이, 관절 연골은 1 내지 2 부피%만의 연골세포를 포함하므로, 인간 관절 연골 1 ㎎ 당 약 2,000 개의 세포가 배양을 위해 분리될 수 있고, 정상 인간 무릎 관절에서 발견되는 것과 유사한 세포밀도로 이식한다면 평균 3 ㎠ 결함에 ACT 방법을 적용하기 위해서는 9×106 세포를 필요로 하게 된다. 또한 현실적으로는 Ⅳ 등급의 연골연화증 병변을 갖는 40세 이하 환자 26%가 다중 병변을 가지므로 더 많은 세포가 ACT를 위해 필요할 수 있다. 따라서, 정상 인간 관절 연골에서 나타나는 것과 유사한 세포밀도로 결함 용적을 적당하게 채우기 위해서는 많은 수의 세포가 필요하다.
또한 세포 확장(cell expansion)을 위한 연속 단일층 배양 중, 연골세포는 연골 특이적 프로테오글리칸(proteoglycan)과 타입 Ⅱ 콜라겐의 생산이 중단되고 타입 Ⅰ 콜라겐을 발현하도록 스위치되며, 낮은 수준의 프로테오글리칸을 생산하는 경향이 있다. 이러한 탈분화는 시험관 내에서의 세포 확장을 제한하고 ACT 적용의 주된 문제점이기도 하였다.
한편, 늑골 연골은 포유류 신체에서 가장 거대한 영구적 연골로서, 관절 연골, 외이, 및 기관(trachea)의 재형성에서 자가 이식을 위한 또다른 공여원으로 제안되어 왔으며, 늑골 골연골 접합부가 지간관절 및 측두하악관절과 같은 작은 관절의 골연골 결합을 수복하는데 사용되고 있다. 늑골 연골은 공여 조직으로서 관절 연골 보다 몇몇 장점을 갖는다. 80세 이상의 환자에서도 늑골 연골에서 활성 연골세포를 갖는 유리질 연골이 검출되며 60세 이하의 환자에서는 유의한 양의 늑골 연골을 얻을 수 있다. 또한, 늑골 연골은 양이 많고 수확 중 외과적 과정이 용이하여 공여 부위에 상처를 덜 준다. 따라서 만약 늑골 연골이 관절 연골의 유리질 연골과 동일한 표현형을 갖는다면, 이 조직이 류마티스성 관절염, 골관절염 및 관절의 연골 결함과 같은 다양한 관절 연골 장애를 치료하기 위한 연골세포 이식의 가장 유용한 출처로 여겨진다.
그럼에도 불구하고, 지금까지는 늑골 연골 자체를 관절 연골부에 이식하는, 자가 조직이식만이 행해져 왔으며, 늑골로부터 연골세포를 분리해내어 관절 연골을 조직공학적으로 재생하는데 이용하려는 시도는 없었다.
나아가, 연골세포나 연골형성 세포만을 이식하는 것은 토끼 모델에서 성공적인 것으로 나타났으나, 결함에 연골세포를 고정시키고, 이식 세포를 생존시키기가 어려워, 그 치유율이 제한되어 왔다. 외과적 과정과 관련된 어려움을 극복하고 관절강으로 세포가 넘치지 않게 하면서 결함 내에 연골세포를 유지하는 방법을 개발하기 위하여, 세포를 접종하는 지지체(scaffold)로서의 다른 생체재료 담체에 대한 연구가 필요했다. 이상적인 지지체는 생체적합성, 생체흡수성이거나 리모델링되어야 하고, 새로운 조직성장을 용이하게 하는 프레임워크를 제공하여야 한다. 또한 관절 연골 기능과 양립가능한 재료적, 기계적 성질을 나타내어야 한다. 콜라겐-기제 생체재료, 콜라겐 타입 Ⅰ 및 Ⅱ, 콜라겐/글리코스아미노글리칸(GAG) 복합체와 같은 천연 생체재료와, 폴리글리콜산(PGA) 및 폴리락트산(PLLA), 또는 이들의 생분해성 및 비생분해성 컴포지트 혼합물, PLGA(폴리 D,L-락틱-co-글리콜산)와 같은 합성 생체재료와 같은 다양한 물질이 관절 수복을 위한 가능한 세포-담체 재료로 소개된 바 있다. 타입 Ⅱ 콜라겐과 GAG와 같은 연골-특이적 세포외 기질(extracellular matrix; ECM) 성분이 연골 표현형의 발현을 조절하고 시험관 내 및 생체 내 모두에서 연골형성을 뒷받침하는데 결정적인 역할을 하는 것으로 나타났다.
한편, 키토산(chitosan)은 키틴의 알칼리 탈아세틸화된 산물로서, 탈아세틸화 정도와 분자량이 다른 폴리-D-글루코스아민의 훼밀리이다. 많은 연구자들이 세포외 기질에서 발견되는 GAG와의 구조적 유사성으로 인해 키토산이 결합조직의 수복을 위한 구조적 생체재료로 고려될 수 있음을 제시하였다. 키토산과 그 분해산물의 일부는 연골의 영양보급을 위해 필요한 콘드로이틴, 콘드로이틴-황산, 더마탄-황산, 케라탄-황산 및 히알루론산(HA)과 같은 활액성분의 합성에 관여할 수 있다. 연골 조직공학을 위해 특히 중요한 것은 키토산이 다가양이온성이고 그 구조가 관절 연골의 ECM의 중요한 분자인 히알루론산과 유사하다는 것이다. 유리질 연골의 조직공학에서 키토산-기제 매트릭스의 사용이 최근 검토되었다. Lahiji 등(2000)의 연구에 따르면 키토산 필름 상에서 배양된 연골세포는 분화된 표현형을 유지하고 콜라겐 타입 Ⅱ와 황산화 프로테오글리칸과 같은 연골 특이적 ECM 단백질을 발현하는 것으로 나타났다. 신생연골형성을 강화하기 위한 키토산의 사용에 관한 연구에서도 키토산 필름 상에서 증식시킨 경우 키토산이 연골세포 표현형을 유지시키고 연골 특이적 ECM 성분 생합성을 촉진하는 결과를 얻었으며, 키토산은 또한 골선조세포의 분화를 강화하고 뼈 형성을 증진시키는 것으로 나타났다.
또한 히알루론산(HA)은 조직 수화, ECM에서 PG 조직화 및 세포 분화와 같은 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을 하며, 건강한 관절 연골의 성분이기도 하다. Patti 등(2001)에 따르면 HA가 인간 연골세포의 시험관 내 기질 부착능력과 증식활성을 증진시키고 초기 관절염에서 임상적 기능을 향상시키는 것으로 나타났다.
한편, FGF(Fibroblast Growth Factor)는 결합조직세포와 MSC에 대한 강력한 마이토겐이며(J. Cell Biol. 100, 477-485 (1985)), 확장기간 동안의 두꺼운 F-액틴 구조 형성을 저해하여 관절 연골세포의 연골세포성 잠재력(chondrogenic potential)을 유지시켜주고(Exp. Cell Res. 253, 681-688 (1999)), 많은 유사분열에 걸쳐 MSC의 다계통 분화를 유지시키는 것으로 알려져 있다(Bioch. Biophy. Res. Com. 288, 413-419 (2001)).
본 발명자들은 먼저 늑골 연골로부터 분리된 연골세포를 조직공학적 인공연골을 위한 세포원으로 사용할 수 있는지 여부를 연구하였다. 나아가, 연골세포를 계대 배양하는 경우 탈분화되어 연골세포의 표현형을 잃게 되는 문제점을 해결하기 위한 방안을 연구하였다. 한편, 늑골 연골세포가 접종된 키토산-기제 지지체를 관절 연골 재생에서 이용할 수 있는지 여부를 평가하기 위하여, 지속적인 연구를 수행하였다.
이러한 연구의 결과, 늑골 연골로부터의 연골세포가 연골 수복을 위한 공여 세포원으로 관절 연골 보다 우수할 뿐 아니라, 계대 배양시 탈분화된 연골세포가 간엽줄기세포의 성질을 나타내므로, 분화 유도 배지에서 배양할 경우 얻고자 하는 분화세포로 재분화시켜 인공 연골뿐만 아니라 세포 치료제로서 이용할 수 있음을 확인하였다. 또한, 연골세포가 로딩된 키토산-기제 지지체를 관절 결함에 이식하면 효과적인 관절 재생효과를 얻을 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 늑골 연골세포를 계대 배양하여 얻은 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 함유하는 인공 연골 및 그의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
첫째, 본 발명은 늑골 연골세포를 계대 배양하여 얻은 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 함유하는 인공 연골에 관한 것이다. 상기 늑골 연골세포는 MSCGM(간엽줄기세포성장배지), 특히 FGF(섬유아세포성장인자) 함유 MSCGM에서 계대 배양시 세포확장력이 우수하며 연골로의 분화가 잘 이루어진다.
둘째, 본 발명은 늑골 연골세포를 계대 배양하여 얻은 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 연골세포 분화 유도 배지에서 배양하여 재분화시킨 연골세포를 함유하는 인공 연골에 관한 것이다. 한 구체예에서, 상기 간엽줄기세포성 탈분화 세포는 연골세포 분화 유도 배지에서 펠렛 배양된다.
셋째, 본 발명은 상기 연골세포가 키토산-기제 지지체(chitosan-based scaffold) 상에 로딩된 인공연골에 관한 것이다. 상기 키토산-기제 지지체는 바람직하게는 키토산 스폰지, TGF-β(Transforming Growth Factor-β) 함유 키토산 스폰지, 히알루론산 코팅된 키토산 스폰지, 황산콘드로이틴 코팅된 키토산 스폰지, 또는 상기 키토산과 콜라겐의 혼합 스폰지이고, 보다 바람직하게는 히알루론산 코팅된 키토산 또는 히알루론산 코팅된 키토산-콜라겐 혼합 스폰지이다.
넷째, 본 발명은 늑골 연골세포를 계대 배양하여 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 얻는 단계를 포함하는 인공연골의 제조 방법에 관한 것이다. 한 구체예에서, 상기 늑골 연골세포는 MSCGM 또는 FGF 함유 MSCGM 배지에서 계대 배양된다. 한 구체예에서, 늑골 연골세포를 계대 배양하여 얻은 간엽줄기세포성 탈분화 세포는 연골세포 분화 유도 배지에서 배양하여 재분화되며, 바람직하게는 연골세포 분화 유도 배지에서 펠렛 배양된다. 또다른 구체예에서, 상기 방법은 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 키토산-기제 지지체 상에 로딩하는 단계를 포함한다.
다섯째, 본 발명은 늑골 연골세포를 계대 배양하여 얻은 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 함유하는 세포 치료제에 관한 것이다. 한 구체예에서, 상기 세포 치료제는 상기 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 연골세포 분화 유도 배지에서 배양하여 재분화시킨 연골세포를 함유한다. 다른 구체예에서, 상기 세포 치료제는 상기 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 골 분화 유도 배지에서 배양하여 얻은 골세포를 함유한다. 또 다른 구체예에서, 상기 세포 치료제는 상기 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 지방 세포 분화 유도 배지에서 배양하여 얻은 지방세포를 함유한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
관절 연골 수복을 위한 자가 연골세포 이식에서의 주된 기술적 제한은 무릎 관절의 체중 부하가 없는 공여 연골의 증식능력이 낮으며, 시험관 내 세포확장 동안 연골세포의 탈분화에 따른 연골 결함을 커버하기 위한 적절한 수의 연골세포를 얻는 것이 어렵다는 점에 있다. 또한 ACT의 적용은 환자 나이와 공여 부위의 선택이 좁다는 점에 의해 제한된다.
이에, 본 발명에서는 생존 중 더 오랜 증식 능력을 유지하고, 인간 체내에서 더 큰 공여 조직을 갖고 있는 늑골 연골이 자가 연골세포 이식을 위한 공여 세포원으로서 이용될 수 있는지에 대해 평가하였다. 먼저, 세포 수율, 세포 확장률 및 탈분화에 기초하여 늑골 연골로부터 분리된 연골세포가 조직공학적 관절 연골을 위한 공여 세포원으로 적절한지 여부를 평가하였다. 구체적으로, 본 발명에서는 늑골 연골로부터의 연골세포의 최초 수율과 단일층 배양에서의 세포 확장률을 관절 연골의 것들과 비교하였다. 또한, 시험관 내 세포배양에서 탈분화도를 세포 형태 및 타입 Ⅱ 콜라겐 발현에 의해 평가하였다.
그 결과, 늑골 연골은 관절 연골 보다 2.6배 높은 세포 수율을 나타내었다. 시험관 내 세포배양 동안, 늑골 연골세포(CC)는 관절 연골세포(AC) 보다 신속하게 증식하고 4계대까지 약 3배 많은 세포 확장을 나타내었다. 연속 배양 동안, AC와 CC는 점차 그들의 연골세포성 표현형을 상실하고, 섬유아세포-양 세포로 변화하며, 타입 Ⅱ 콜라겐의 발현이 감소되었다. CC는 AC 보다 더 빨리 그들의 표현형을 상실하였다. 동일한 계대 수 비교 시, CC는 AC 보다 빨리 탈분화하였다.
시험관 내 세포확장의 계대에 따라 탈분화 및 증식 프로파일을 갖는 동일한 토끼로부터의 AC와 CC의 조사로 나타낸 일차배양 결과는 늑골 연골을 골관절염 수복을 위한 잠재적인 공여 세포원으로 사용할 수 있음을 암시하였다.
계속된 연구에서 본 발명자들은 늑골 연골세포를 계대배양하여 탈분화시키면, 이 탈분화 세포가 간엽줄기세포의 성질을 나타내는 것을 확인하였다. 간엽줄기세포는 연골 형성 선조세포로서 골연골 결함을 수복하는 잠재적 세포원으로서 의미를 갖는다. 따라서, 본 발명에서는 늑골 연골세포 기원의 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 연골 형성 선조세포로서 이용하여 골연골 결함 수복을 위해 이용할 수 있음을 밝혔다.
본 발명의 간엽줄기세포성 탈분화 세포는 연골 세포 뿐만 아니라, 골세포 및 지방세포로도 분화가능하였다. 따라서, 본 발명에 있어서 '간엽줄기세포성 탈분화 세포'는 계대배양을 통해 탈분화되어 간엽줄기세포와 같이 연골세포, 골세포, 지방세포 등으로 분화될 수 있는 잠재력을 갖는 세포, 즉 다분화능을 갖는 세포를 말한다.
뒤이은 연구에서, 본 발명자들은 늑골 연골세포를 MSCGM, 특히, FGF를 함유한 MSCGM에서 계대배양시 세포확장률이 뛰어나고, 연골세포로의 분화가 우수함을 밝혔다. DMEM을 포함한 일반적인 세포 배양 배지에서도 FGF를 추가하면 동일한 결과를 얻을 수 있을 것으로 예상되었다.
나아가, 본 발명에서는 연골세포를 접종하는 지지체(scaffold)로서 키토산-기제 지지체, 특히 스폰지 형태의 히알루론산-코팅된 키토산 지지체를 사용하고, 동물 모델을 설계하여 체중-부하 위치에서의 전층(full-thickness) 관절 연골 결합의 수복에서 배양된 자가 늑골 연골세포와 HA-코팅된 키토산 컴포지트 지지체의 역할을 평가하였다. 연골 수복 평가에서 토끼 무릎 모델이 널리 사용되어 왔고, 토끼 슬개골 홈의 전층 3 ㎜-직경 연골 결함의 치유는 4 내지 6 월령 토끼에서 6 내지 8 주내에 일어나는 것으로 보고되어 있으므로, 이 기간이 치유된 연골의 대부분의 퇴화성 실패를 밝히는데 분명히 필요하다고 판단하였다. 이와 같이 설계된 동물 모델 실험 결과(4 ㎜ 직경의 골연골 결함), 본 발명에 따른 자가 늑골 연골세포-키토산 기제 지지체는 체중-부하 위치에서 전층 관절 연골 결함을 매우 효과적으로 수복할 수 있는 것으로 확인되었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이에 의해 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 늑골 연골세포의 관절 연골 재생을 위한 공여 세포원으로서의 사용가능성 유무 평가
재료 및 방법
연골세포의 분리
관절 및 늑골 연골을 3 내지 4 월령 뉴질랜드 화이트 래빗(NWR)으로부터 얻고, 칭량하였다. 이식용 늑골 연골 수확을 위해서, 동물을 자일라진 하이드로클로라이드(체중 ㎏ 당 2 ㎎, Rompun, Bayer, 한국)와 케타민 하이드로클로라이드(체중 ㎏ 당 6-10 ㎎, ketalar, Yuhan Co., 한국)의 혼합물을 근육 내 주사하여 마취시켰다. 가슴 부위의 피부를 면도하고, 알콜로 세척하여, 포비돈-요오다인 용액으로 준비하였다. 우측 흉곽의 뒷면을 횡절개하여, 9번째 또는 10번째 늑골 연골을 노출시켰다. 주변조직을 제거한 후, 늑골 연골을 칭량하였다. 이들 연골을 1-2 ㎣ 조각으로 썰어 D-PBS(Dulbecco's phosphate buffered saline; Jeil Biotech services Inc., 대구, 한국)로 3회 헹궜다. 헹군 후, 썰은 연골을 콜라게나제 D(2 ㎎/㎖, Roche Diagnostic GmbH, 독일), 히알루로니다제(1 ㎎/㎖, Roche), 및 DNase(0.75 ㎎/㎖, Roche)를 함유하는 효소 칵테일 용액으로 37 ℃, 5% CO2 하에서 밤새 분해시켰다. 그 후 용액을 53 ㎛ 나일론 메쉬로 여과시키고 분리된 세포를 10% 우태아혈청(FBS; Hyclone technologies, USA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신/펀지존 칵테일(Gibco Life technologies, USA)을 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium; Gibco)로 2회 세척하고, 생존 세포를 트립판 블루 배제에 기초하여 헤마토사이토미터 상에서 계수하였다. 세포를 5×105 세포/100 ㎜ 직경 배양디쉬의 세포밀도로 플레이팅하고, 배양배지를 격일로 교환하고 매 배지 교환 시 신선한 50 ㎍/㎖ L-아스코르브산(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 첨가하였다. 컨플루언스에 있는 1차 세포를 4 계대까지 하부배양하였다.
MTT 어세이
MTT 어세이를 위해, 각 계대의 AC와 CC를 6-웰 배양 플레이트의 웰 당 1×105 세포의 세포밀도로 접종하고 5 일간 배양하였다. 세포 증식을 MTT 어세이(Mosman T. Rapid colormetric assay for cellular growth and survival, application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods 1983; 65: 55-63)에 기초하여 결정하였다. 광학밀도(O.D.)로부터 세포 수를 검정하기 위하여, 표준 곡선을 1 내지 8×105 세포 범위에서 측정하고 O.D.를 세포 수로 변환시켰다.
타입 Ⅱ 콜라겐의 면역형광 염색
면역형광 염색을 위해, 각 계대로부터의 세포를 커버슬립 상에 플레이팅하고 2 일간 배양하여, 3.7% 포르말린으로 10 분간 고정시키고 PBS 중의 0.2% 트리톤 X-100으로 투과화하였다. 투과화된 세포를 20% 정상 염소 혈청으로 인큐베이션하여 비특이적 반응을 차단하고 모노클로날 항-타입 Ⅱ 콜라겐 항체(Chemicon international Inc., Temecula, USA)를 1차 항체로 사용하고 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 표지된 염소 항-마우스 IgG 컨쥬게이트를 2차 항체로 사용하여 핵 염색을 위해 커버 슬립을 5 분간 4',6-디아미노-2-페닐인돌(DAPI; 1 g/㎖; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)로 인큐베이션하였다. 세포를 형광 현미경(Olympus Optical Co., 일본) 하에서 관찰하였다.
통계
각각의 실험에서 변수들이 유의적으로 상이한지 여부(p<0.05)를 결정하기 위하여 통계학적 분석을 언패어드 t 테스트에 의해 수행하였다.
결과
관절 연골 및 늑골 연골로부터 분리된 연골세포의 세포 수율 및 확장률의 비교
성인에서 자가적 연골세포 이식을 위한 적당한 공여 부위를 찾기 위하여, 관절 연골 또는 늑골 연골로부터 분리된 연골세포의 세포 수율을 비교하였다(표 1).
관절 연골 및 늑골 연골로부터 분리된 연골세포의 최초 세포수율 비교
1 2 3 평균(세포/㎎)±S.D.
AC 6,000 7,000 13,400 8,800±3,278a
CC 20,000 26,600 22,100 22,900±2,753
a: 세 개의 독립된 세포분리물로부터의 평균±S.D. 통계학적 분석을 스튜던트 t-테스트(p<0.05)에 의해 실시하였다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 관절 연골로부터 분리된 연골세포는 8,800±3,278 세포/㎎인 반면, 늑골 연골로부터 분리된 연골세포는 22,900±2,753 세포/㎎이었다. 늑골 연골로부터 분리된 연골세포의 최초 세포수율은 관절 연골의 것 보다 약 2.6배 높았다. 따라서, 늑골 연골이 최초 세포 수율 면에서 관절 연골 보다 자가 연골세포 이식을 위해 더 좋은 공여 부위로 인정될 수 있었다.
관절 연골 및 늑골 연골로부터 분리된 연골세포의 시험관 내 확장능력을 비교하기 위하여, 각 계대로부터의 세포를 6-웰 플레이트의 웰 당 1×105 세포의 밀도로 플레이팅하고, MTT 어세이를 접종 후 5 일째에 수행하였다(도 1). CC가 AC 보다 더 빨리 증식하였다. P0 계대에서, CC의 증식율은 AC의 것 보다 약 2배였다. 계대 2에서, AC의 증식률은 CC의 것과 유사하였으나 P3에서 증식률이 P2 보다 느려졌다.
관절 연골 및 늑골 연골로부터 분리된 연골세포의 확장률을 측정하기 위하여, 컨플루언스에 도달하는 시간과 컨플루언스에 있는 총 세포 수를 동일한 수의 세포를 접종한 후 비교하였다(표 2).
컨플루언스에 도달하는 시간과 컨플루언스에 있는 총 확장률 비교
P0에서 P2 P0에서 P4
시간(일) 확장률(배) 시간(일) 확장률(배)
AC 20±7a 22±8.4 37±7.3 106±22
CC 13±3 54±14.5 29±3.4 310±70
a: 세 개의 독립된 실험으로부터의 평균±S.D.
표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 증식률에 있어서 시험관 내 확장을 위해 CC가 AC에 비해 우수한 것으로 보인다.
시험관 내 확장 중 늑골 연골세포와 관절 연골세포의 표현형 변화
시험관 내 확장 중, 연골세포는 빈번하게 둥근 형태와 타입 Ⅱ 콜라겐 및 GAG 발현과 같은 생체 내 특성을 상실한다. AC와 CC의 각 계대에서 형태 변화와 타입 Ⅱ 콜라겐 발현을 조사하였다(도 2). 계대 2부터, 일부 세포는 계대 0에서 관찰되는 원래의 둥근 형태를 잃기 시작하여 섬유아세포성 스핀들 형태로 변화하였다(도 2A). 계대 4에서, 대부분의 CC는 실제로 형태가 섬유아세포성 표현형으로 변화되었다. 그러나, 이 형태학적 변화는 CC 보다 AC에서 훨씬 느렸다. 따라서 AC는 CC보다 시험관 내에서 더 느리게 확장하고 시험관 내 세포배양 동안 그들의 형태 또한 CC 보다 느리게 변화하였다.
섬유아세포성 형태 변화가 타입 Ⅱ 콜라겐 발현의 상실을 동반하는지 여부를 추가로 조사하기 위하여, 항-타입 Ⅱ 콜라겐 항체로 면역형광 염색을 수행하였다(도 2B). 계대 0에서, 늑골 연골 및 관절 연골로부터 유래된 1차 연골세포의 99%가 타입 Ⅱ 콜라겐을 발현하였다. 계대 2에서, 타입 Ⅱ 콜라겐 발현 연골세포는 급격히 감소하였고, 이는 CC에서 더욱 두드러졌다. 계대 4에서, 대부분의 CC는 타입 Ⅱ 콜라겐을 발현하지 않았지만 일부 AC는 여전히 타입 콜라겐 발현을 유지하였다.
타입 Ⅱ 콜라겐 발현 세포의 수를 DAPI 양성 연골세포 중에서 계수하였다(표 3).
상이한 세포계대의 타입 Ⅱ 콜라겐 발현 세포 수(%)
AC(%) CC(%)
P0 98.6±1.1a 97.2±2.4
P1 53.5±7.8 37.6±5.4
P2 23.6±4.6 10.0±3.3
P3 14.3±3.0 5.1±0.7
P4 10.4±2.8 1.0±0.4
a: 평균±S.D.
표 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 시험관 내에서 확장하는 동안, 연골세포는 점차 둥근 형태와 타입 Ⅱ 콜라겐 발현능력과 같은 그들의 원래 표현형을 상실하고 이는 CC에서 더 가속화되었다.
실시예 2: 완전히 탈분화한 늑골 연골세포의 중배엽 줄기세포성 확인
재료 및 방법
연골세포의 분리
늑골 연골을 4 내지 5 월령 뉴질랜드 화이트 래빗(NWR)으로부터 얻었다.　 가슴 부위의 피부를 면도하고, 알콜로 세척하여, 포비돈-요오다인 용액으로 준비하였다.　 우측 흉곽의 뒷면을 횡절개하여, 9번째 또는 10번째 늑골 연골을 노출시켰다.　 주변조직을 제거한 후, 늑골 연골을 칭량하였다.　 이들 연골을 1-2 ㎣ 조각으로 썰어 D-PBS(Dulbecco's phosphate buffered saline; Jeil Biotech services Inc., 대구, 한국)로 3회 헹궜다.　 헹군 후, 썰은 연골을 콜라게나제 D(2 ㎎/㎖, Roche Diagnostic GmbH, 독일), 히알루로니다제(1 ㎎/㎖, Roche), 및 DNase(0.75 ㎎/㎖, Roche)를 함유하는 효소 칵테일 용액으로 37 ℃, 5% CO2 하에서 밤새 분해시켰다.　 그 후 용액을 53 ㎛ 나일론 메쉬로 여과시키고 분리된 세포를 10% 우태아혈청(FBS; Hyclone technologies, USA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신/펀지존 칵테일(Gibco Life technologies, USA)을 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium; Gibco)로 2회 세척하고, 생존 세포를 트립판 블루 배제에 기초하여 헤마토사이토미터 상에서 계수하였다.　 세포를 5×105 세포/100 ㎜ 직경 배양디쉬의 세포밀도로 플레이팅하고, 배양배지를 격일로 교환하고 매 배지 교환 시 신선한 50 ㎍/㎖ L-아스코르브산(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 첨가하였다.　 컨플루언스에 있는 1차 세포를 7 계대까지 하부배양하였다.
타입 I, Ⅱ 콜라겐과 평활근 액틴 ( SMA ) 항체의 발현
제 7계대의 늑골 연골세포를 커버슬립 상에 플레이팅하고 2 일간 배양하여, 3.7% 포르말린으로 10 분간 고정시키고 PBS 중의 0.2% 트리톤 X-100으로 투과화하였다.　 항-타입 I 콜라겐 항체(polyclonal anti-goat antibody: southern), 항-타입 Ⅱ 콜라겐 항체(monoclonal anti-mouse antibody: Chemicon international Inc., Temecula, USA) 또는 항 평활근 액틴 항체(SMA, monoclonalanti-mouse antibody: DAKO)을 4 ℃에서 밤새 표본에 적용시키고, 2차 항체 인큐베이션 후 1 시간 동안 스트렙타비딘-퍼옥시다제로 인큐베이션하여 PBS 중 0.1% 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB; Chromogen, DAKO Corp., Carpinteria, CA, USA)로 5 분간 전개하였다.　 패스트 레드 염료(Vector Lab., Burlingame, CA, USA)를 반대염색을 위해 사용하였다.
결과
늑골 연골세포의 탈분화와 MSC 성질 발현 확인
도 3a에서 볼 수 있는 바와 같이 제7계대의 늑골 연골세포는 원래의 둥근 모양에서 섬유아세포 같은 길쭉한 모양을 띠고 있다. 이는 늑골 연골세포가 완전히 탈분화되었음을 보여준다. 도3b은 탈분화된 연골세포의 타입 I, Ⅱ 콜라겐과 평활근 액틴 (SMA) 항체의 발현을 보여준다. 모든 세포에서 타입 I 콜라겐이 발현되고 있으나, 타입 II 콜라겐은 전혀 발현되고 있지 않음을 알 수 있다. 중간엽 줄기 세포의 특징 중 하나인 평활근 액틴(SMA)의 발현도 많은 세포에서 관찰되었다(도 3c). 상기와 같이 타입 I 콜라겐와 SMA의 발현으로써, 계대배양시킨 늑골 연골세포가 간엽줄기세포의 성질을 나타내고 있음을 확인할 수 있다.
실시예 3: 배양조건( DMEM + 10% FBSs , MSCGM 또는 FGF 함유 MSCGM )에 따른 늑골 연골세포의 확장과 연골로의 분화 평가
재료 및 방법
연골세포의 분리 및 배양
상기와 같은 방법으로 연골세포를 분리한 후 생존 세포를 트립판 블루 배제에 기초하여 헤마토사이토미터 상에서 계수하여　연골세포를 5×105 세포/100 ㎜ 직경 페트리디쉬의 세포밀도로 플레이팅하고, 각각 10% FBS가 포함된 DMEM (DMEM-FBS), MSCGM(Cambrex Bio Science Walkersville, Inc., MD, USA), 또는 1 ng/ml의 Fibroblast Growth Factor (FGF, R&D System Inc., MN, USA)를 첨가한 MSCGM (MSCGM-FGF)에서 배양하였다.
배지에 따른 세포 증식률
세포가 디쉬에 가득 차게 되면 Trypsin-EDTA (Gibco)로 디쉬에서 세포를 떼어내 생존 세포를 트립판 블루 배제에 기초하여 헤마토사이토미터 상에서 계수하여 증식률을 평가하고, 다시 5×105 세포/100 ㎜ 직경 페트리디쉬의 세포밀도로 플레이팅하여 같은 배지로 계대배양 하였다.
타입 I 및 II 콜라겐과 평활근 액틴 ( SMA ) 항체의 발현
각각의 계대별로 DMEM-FBS, MSCGM, 또는 MSCGM-FGF에서 배양된 늑골 연골세포를 커버슬립 상에 플레이팅하고 2 일간 배양하여, 3.7% 포르말린으로 10 분간 고정시키고 PBS 중의 0.2% 트리톤 X-100으로 투과화하였다.　 투과화된 세포를 20% 정상 염소 혈청으로 인큐베이션하여 비특이적 반응을 차단하고 항 평활근 액틴(SMA, monoclonal anti-mouse antibody: DAKO) 항체를 1차 항체로 사용하고 4 ℃에서 밤새 표본에 적용시키고, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 표지된 IgG 컨쥬게이트를 2차 항체로 사용하였고, 핵 염색을 위해 커버 슬립을 5 분간 4',6-디아미노-2-페닐인돌(DAPI; 1 g/㎖; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)로 인큐베이션하였다.　 세포를 형광 현미경(Olympus Optical Co., 일본) 하에서 관찰하였다.
DMEM-FBS, MSCGM, 또는 MSCGM-FGF에서 배양된 늑골 연골세포를 각 계대별로 배양접시 밑면을 PBS로 2회 세척하고 세포 용해 완충액 (Biolabs; 20mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1mM Na2EDTA, 1mM EGTA, 1% Triton, 2.5mM sodium pyrophosphate, 1mM Na3VO4, 1mM beta-glycerophosphate, 1ug/ml leupeptin)와 단백질 분해효소작용을 억제하기 위하여 2mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)를 첨가하여 세포를 용해시킨 후 원심분리하여 상등액을 취하여 콜라겐 분리를 위해 사용하였다. 단백질을 10% SDS-PAGE에 걸어서 막에 전달시킨 후에 항-타입 I 콜라겐 항체 및 항-타입 II 콜라겐 항체(polyclonal anti-goat antibody: southern)로 웨스턴 블로팅 하였다.
연골세포로의 분화 유도
DMEM-FBS, MSCGM, 또는 MSCGM-FGF에서 p7 또는 p8 까지 확장시킨 늑골 연골세포를 pellet 으로 만들어 연골분화 배지하에서 3주간 연골로 분화 유도 후 Safranin-O 염색을 통하여 연골로의 분화 정도를 알아보았다.
결과
배지에 따른 세포 증식률
세포가 디쉬에 가득 차게 되면 Trypsin-EDTA (Gibco)로 디쉬에서 세포를 떼어내 생존 세포를 트립판 블루 배제에 기초하여 헤마토사이토미터 상에서 계수하여 증식률을 평가하였다.
도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 제7계대에 도달하는데 MSCGM-FGF에서는 약 30일 걸리고 약 107배로 확장하였고, MSCGM 에서는 약 38일이 소요되고 약 105배로 확장하였다. 하지만 DMEM-FBS 에서는 약 한 달이 지나면 확장이 거의 되지 않는 포물선의 그래프 모양을 나타내어 제 7계대 도달시에도 약 103 배 정도로 밖에 확장되지 못하였다.
늑골 연골세포를 배양하는데 있어서 일반적으로 사용하는 10% FBS가 포함된 DMEM 보다는 중배엽유래줄기세포의 성장배지인 MSCGM에서 늑골 연골세포의 확장도가 우수함을 알 수 있었다. 뿐만 아니라 MSCGM에 FGF를 첨가하여 늑골 연골세포를 배양하였을 경우에는 현저하게 우수한 확장력을 보였다. DMEM에 FGF를 첨가하여 늑골 연골세포를 배양할 경우에도 동일한 결과를 얻을 수 있을 것으로 예상되었다.
타입 I 콜라겐과 항 SMA 항체의 발현
DMEM-FBS, MSCGM, 또는 MSCGM-FGF에서 배양된 늑골 연골세포에 대해 MSC의 마커로서 타입 I & II 콜라겐과 항 SMA 항체의 발현 정도를 조사했다.
도 5a에서 볼 수 있는 바와 같이, 타입 II 콜라겐은 계대가 증가함에 따라 발현이 감소하였는데 그 발현 감소량은 MSCGM-FGF, MSCGM, 그리고 DMEM-FBS 에서 배양된 늑골 연골세포 순으로 빠르게 감소하였다.
SMA는 MSCGM과 DMEM-FBS에서 확장한 늑골 연골세포에서는 SMA을 발현하는 세포가 약 90% 정도로 많은 세포에서 발현을 보였는데, MSCGM-FGF에서 배양한 늑골 연골세포에서는 전 계대에 걸쳐 상당히 적은 세포에서만 발현되었다.
도 5b에서 볼 수 있는 바와 같이, 타입 I 콜라겐 발현을 살펴보면, DMEM-FBS와 MSCGM에서 배양된 늑골 연골세포는 계대가 증가함에 따라 발현이 증가하여 제 7계대의 세포는 대부분이 타입 I 콜라겐을 발현하는데 반해 MSCGM-FGF에서 확장된 세포는 약 60-70%의 세포만이 타입 I 콜라겐의 발현을 보였다.
GAG의 발현
도 6에서 알 수 있는 바와 같이, DMEM-FBS에서 확장시킨 늑골 연골세포는 펠렛의 외곽을 중심으로 GAG 발현을 보였고 고배율 사진을 보면 외곽의 대부분의 세포가 연골세포의 형태를 보임을 알 수 있었다. MSCGM에서 확장된 늑골 연골세포는 3주간의 연골분화 후에도 극히 펠렛 표면의 일부에서만 낮은 GAG 발현을 보였고 적은 수의 연골 모양의 세포를 볼 수 있었다. 반면에 MSCGM-FGF에서 확장된 세포는 3주간의 연골 분화 후 펠렛의 대부분에서 강한 GAG 발현을 볼 수 있었고 연골세포의 형태를 보이고 있었다.
늑골 연골세포를 분리하여 확장시킬 때 선택하는 배양배지로서 MSCGM에 1ng/ml의 FGF를 첨가하여 사용함으로써 확장효과와 함께 약 2.0 x 107 배로 세포를 확장 후에도 연골분화능력을 유지할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4: 완전 탈분화한 늑골 연골세포의 재분화
재료 및 방법
연골세포의 분리
실시예 2의 7계대까지 배양된 탈분화세포를 이용하였다.
완전 탈분화한 늑골 연골세포의 연골세포로의 분화
상기 완전 탈분화된 늑골 연골세포를 연골세포로 재분화 시키기 위해 세포를 1 x 106 cells 씩 15ml 튜브에 분주하여 펠렛 배양을 실시 하였다. 배지를 연골 분화배지 (High glucose DMEM, 1% ITS+3 (Sigma), 100nM dexamethasone (Sigma), 50 ㎍/ml vit C (Sigma), 40 ㎍/ml praline (Sigma), 10 ng/ml TGFβ3 (R&D system, Inc., MN, USA)로 교환하고 대조군으로는 기본 배지 (DMEM-HG, 10% FBS)를 채워줬다. 일주일에 2회 배지를 교환하고 제 2, 3주째 관찰하였다.
연골세포로의 분화를 확인하기 위하여 제 2 및 3주에, 3-D 구조물을 3.7% 인산-완충 포르말린으로 고정화하고 파라핀 표본을 만들어 5㎛로 박절하였다. 얇은 단편을 탈파라핀화하고 글루코사미노글리칸(GAG) 분포 관찰을 위해 사프라닌-O(Sigma) 및 패스트 그린(Sigma)으로 염색하였다.　
완전 탈분화한 늑골 연골세포의 골세포로의 분화
골세포로의 분화를 위해서 제7계대의 늑골 연골세포를 2 x 104 cells/cm2 밀도로 6 웰 및 24 웰에 접종하고 골분화유도배지 (DMEM, 10% FBS, 100 nM dexamethasone (Sigma), 10mM β-glycerol phosphate (Sigma), 50 ㎍/ml vit C (Sigma))로 배양하였다. 일주일에 2회 배지를 교환하고 제 2, 3주째 관찰하였다. 대조군으로는 기본 배지 (DMEM, 10% FBS)를 사용하였다.
골세포로의 분화를 확인하기 위하여 분화 초기 마커인 알칼라인 포스파타제 염색을 실시하였다. 알칼라인 포스파타제 측정 키트 (SIGMA-ALDRICH, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 조직화학적으로 발현 정도를 살펴보았다. 또한 골세포의 성숙 시 분비되는 미네랄 성분을 염색하는 Alizarin Red S(SIGMA-ALDRICH)로 세포를 염색하여 골세포로의 분화 정도를 살펴보았다.
완전 탈분화한 늑골 연골세포의 지방세포로의 분화
지방세포로의 분화를 위해서 제7계대의 늑골 연골세포를 2 x 104 cells/cm2 밀도로 6 웰 및 24 웰에 접종하고 지방세포 분화유도배지 (High glucose DMEM (Gibco), 10% FBS, 10 mg/ml insulin (Sigma), 100nM dexamethasone (Sigma), 0.2 mM indomethacin (Wako Pure Chemical Industries, Japan), 500 μM 3-isobutyl-1-metylxanthin (Wako))에서 3일 배양하고 지방분화유지배지 (High glucose DMEM, 10% FBS, 10 mg/ml insulin)에서 1일간 배양을 반복하였다. 대조군으로는 기본 배지 (DMEM-HG, 10% FBS)으로 배양하였고 제 2, 3주째 관찰하였다.
지방세포로의 분화를 확인하기 위해 세포의 지방구에 특이적으로 염색되는 Oil Red O 염색을 실시하였다.
결과
연골세포로의 분화
도 7a는 제7 계대 늑골 연골세포의 연골세포로의 분화 유도 제 3주째의 육안적 사진을 보여준다. 세포들은 서로 펠렛을 형성하였고 대조군(기본 배지:DMEM-HG, 10% FBS)에 비해 연골 유도군에서 펠렛의 크기가 더 커진 것을 알 수 있었다.
도 7b는 Safranin O 로 GAG 염색를 염색한 결과를 나타낸다. 분화유도 3주 째 펠렛의 외곽부에서 GAG 발현을 확인할 수 있었다. 세포의 모양도 연골세포의 형태를 보임을 알 수 있다. 대조군은 GAG을 발현하지 않으며, 연골세포의 형태도 보이지 않고 있다.
골세포로의 분화
골세포로의 분화를 확인하기 위하여 알칼라인 포스파타제 활성을 관찰하였다. 도 8a은 알칼라인 포스파타제 측정 키트 (SIGMA-ALDRICH, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 알칼라인 포스파타제을 측정한 사진을 보여준다. 이는 골분화 초기 마커인 알칼라인 포스파타제 활성이 분화 2주째 강하게 발현하며, 3주째 다소 감소되는 양상 나타냄을 보여준다. 기본 배지로 배양된 대조군의 세포들은 알칼라인 포스타제 활성을 나타내지 않음을 알 수 있다.
또한, 골분화 마커인 알리자린 레드 시약(Alizarine red staining)으로 미네랄 염색한 결과 도 8b와 같은 결과를 나타냈다. 분화 2주째 발현하지 않고 3주째 부분적으로 염색되어, 골세포로의 성숙 분화가 이루어졌음을 알 수 있다.
지방세포로의 분화
세포의 지방구에 특이적으로 염색되는 Oil Red O 염색을 실시하여 지방세포로의 분화를 확인하였다. 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, 세포내에 Oil red O로 염색되는 지방구가 다수 출현하여 지방세포로의 분화가 이루어졌음을 알 수 있다.
실시예 5: 늑골 연골세포-키토산 기제 지지체의 관절 연골 결함 수복효과 평가
재료 및 방법
실시예 5의 과정은 도 10의 개략도와 같다. 도 10은 늑골 연골세포를 분리하고, 2계대까지 배양하여, 탈분화된 세포를 키토산 기제 지지체에 접종하고 배양한 후 관절 연골 결함에 지지체를 이식하여 연골 결함을 수복시키는 과정을 보여준다.
연골세포의 분리
상기 실시예 1과 동일한 과정을 거친 후, 컨플루언스에 있는 일차 세포를 계대 2까지 하부배양하였다.
스폰지 -형태 지지체의 제조
COl-GAG 스폰지:
다공성 콜라겐 매트릭스(Integra　, Integra Lifesciences Co., USA)는 제어된 다공성과 정해진 분해율을 갖도록 제조된 가교결합된 소 건(tendon) 콜라겐과 GAG(콘드로이틴-6-황산) 섬유의 다공성 매트릭스로 되어 있다. 지지체를 4 ㎜ 생검 펀치(S.F.M., 독일)로 제조하고 실리콘 층을 미세 겸자로 제거하였다.
CS 스폰지:
키토산(Korea chitosan Co., 한국, 1.5% w/v)을 0.1% 아세트산 수용액에 녹였다. 충분히 교반하여 완전히 용해시킨 후, 이 용액을 0.4 ㎛ 막 필터(Millipore Co., USA)로 여과하고 주형에 나누었다. 주조된 젤을 -80 ℃에서 24 시간 방치한 후 24 시간 동안 동결건조기에서 동결건조시켰다. 지지체로부터 남은 산은 알콜과 증류수로 씻어내고 무수아세트산을 가하여 아세틸화하였다. 지지체로부터 부산물인 산을 알콜과 증류수로 씻어내고 동결건조하였다. 키토산 지지체의 두께는 약 2 ㎜였다. 키토산 지지체의 미세 구조와 구멍 크기를 주사전자현미경(SEM; 도 8)에 의해 얻었다. 직경 4 ㎜의 지지체를 4 ㎜ 생검 펀치로 만들었다. 세포 배양 실험 전에, 지지체를 자외선에 30 분간 노출시켜 멸균하고 배양 배지로 10 분간 함침시켰다. 제조된 지지체는 즉시 사용하였다.
HA-CS 스폰지:
4 ㎜ 직경의 키토산 지지체를 제조하고 50% 에탄올에 함침시켰다. 에탄올 함침된 지지체를 PBS 중 0.1% 히알루론산(HA: Sigma, USA)에 재함침시킨 후, HA를 에탄올과 교환하였다. 지지체는 -80 ℃에서 24 시간 동안 위치시킨 후 동결건조기에서 24 시간 동결건조시켰다. 세포 배양 실험 전에, 지지체를 자외선에 30 분간 노출시켜 배양 배지로 10 분간 함침시켰다. 제조된 지지체는 즉시 사용하였다.
지지체 상으로의 연골세포 접종 및 배양
COl-GAG, CS 및 HA-CS 스폰지(4 ㎜ 직경×2 ㎜ 두께)에 20 ㎕ 부피의 제2 계대 2×106 연골세포를 접종하여, 37 ℃, 5% CO2에서 2 시간 동안 6-웰 플레이트에 위치시켰다. 이어서, 6 ㎖의 배양 배지를 각 웰에 가하고 세포를 4 주간 배양하였다. 배지를 매주 교환하고 전체 배양 기간 중 72 시간 마다 신선한 L-아스코르브산을 배지에 가하였다. 배지 스프와 세포-지지체 구조물을 2, 7, 14 및 28 일에 얻고, 2 일에는 구조물만을 얻었다.
MTT 어세이 , 블라이스캔 어세이 , 세포-지지체 구조물의 조직학적 및 면역조직화학적 염색, 및 프로콜라겐 타입 Ⅰ C-펩티드(PIP) ELISA 어세이
MTT 어세이
각각의 지지체 내에서의 세포 증식을 MTT 어세이(Mosman T. Rapid colormetric assay for cellular growth and survival, application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods 1983; 65: 55-63)에 기초하여 결정하였다.
프로콜라겐 타입 Ⅰ C-펩티드(PIP) ELISA 어세이
새로 합성된 콜라겐으로부터의 프로-C-펩티드의 정량적 측정을 위해, 프로-콜라겐 타입 Ⅰ C-펩티드(PIP) EIA 키트(Takara Bio, Inc., 일본)를 사용하였다. 배양배지는 증류수(DW)로 1:100으로 희석하고 나머지 과정은 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 흡광도를 마이크로플레이트 리더(Bio Rad Lab., Richimond, CA, USA)로 450 ㎚에서 측정하였다. 방출된 펩티드량을 0-640 ng PIP/㎖ 범위에서 표준곡선으로 검정하였다.
블라이스캔 어세이
GAG 함량을 1,9-디메틸메틸렌블루 어세이(Blyscan　 글리코사미노글리칸 어세이, Biocolor, UK)를 이용하여 정량적으로 결정하였다. 배양배지 300 ㎕를 제조자의 지시에 따라 분석하고 상어 황산콘드로이틴(Sigma Chemical Corp. St Louis, USA) 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 1 및 2 ㎍으로 측정된 표준곡선으로 검정하였다.
통계
각각의 실험에서 변수들이 유의적으로 상이한지 여부(p<0.05)를 결정하기 위하여 통계학적 분석을 언패어드 t 데스트에 의해 수행하였다.
동물 케어
24 마리의 뉴질랜드 화이트 래빗(최초 체중 2.2 내지 2.5 ㎏, 약 4 내지 5 월령)을 사용하였다. 일반적으로 세로 골격 성장이 4 월령 이후에는 일어나지 않으므로 동물들을 젊은 성체로 간주하였다(Masoud 등, 1986). 동물을 실험 1 내지 2 주전에 받아 일정한 명암 주기(7:00 AM - 7:00 PM 명기) 하에 22±2 ℃의 일정한 온도와 50±7%의 수분에서 유지하였다. 동물에게 수돗물과 음식(표준 실험실 식이(펠렛 형, Purina Co., 한국)을 자유롭게 제공하고 운동장에서 자유롭게 움직이도록 하였다. 동물을 동물 케어를 위해 승인된 국가 가이드라인에 따라 수용, 감시, 핸들링하였다.
외과적 과정
래빗을 상기 실시예 1과 같이 마취시켰다. 자일라진과 케타민의 혼합물을 정맥 내 주사하여 추가로 마취시켰다. 수술 전에 동물에게 항생제(세파졸린, 종근당, 서울, 한국)를 1회 근육 내 투여하였다.
무릎 부위의 피부를 면도하고, 알콜로 세척하고 포비돈-요오다인 용액으로 준비하였다. 외과적 접근법은 Shapiro 등에 의해 기재된 것과 유사하였다. 슬개골 내측을 절개한 후, 슬개골을 외측으로 탈골시켜 대퇴골의 슬개골 홈을 노출시켰다. 직경 4 ㎜의 결함을 슬개골-대퇴골 관절의 체중-부하 영역에 저속 드릴을 사용하여 만들었다. 이 영역은 토끼에서 간헐적으로 체중이 부하되며 슬개골과 접촉한다. 원추형의 전층 결함을 관절 연골의 표면으로부터 컴팩트한 연골하 뼈를 통해 원위 대퇴골의 조혈 공간 내의 해면골로 연장시켰다. 결함의 깊이는 약 2.0 내지 2.5 ㎜였다. 드릴링 후, 결함을 냉 식염수(NaCl 0.9%w/v)로 강하게 세척하여 떨어진 단편들을 제거하였다. 피브린 점착 시스템(Tisseel　 키트, Baxter AG, 오스트리아) 1 방울을 결함에 적용하여 결함에 이식된 구조물을 고정하였다. 즉시 지지체를 결함 내로 삽입하였다. 대조 결함에는, 피브린 접착제만을 사용하였다(도 10). 슬개골을 다시 원위치시키고 관절 캡슐과 피부를 봉합하였다. 어떠한 고정도 적용하지 않고 토끼를 마취로부터 회복된 직후 필드에서 자유롭게 움직이게 하였다. 5 일간 하루에 2회 세파졸린을 근육 내 주사하였다. 동물의 무릎을 세 그룹으로 분리하였다: (1) 무처리 결함(대조); (2) HA-CS 단독 처리(S); 또는 (3) 늑골 연골세포-적재 HA-CS(S-세포) 처리. 이식 6 주 및 12 주후, 토끼를 깊은 마취 하에 MgSO4를 주사하여 안락사시켰다.
수복 조직의 조직학적 평가
동물을 희생시킨 후, 그들의 무릎을 전반적인 형태(색깔, 강도, 윤곽 및 평탄도), 결함 수복 및 주위 연골의 출현에 대해 조사하였다. 이식 표본을 절개하고, 사진촬영한 후 실온에서 1 주간 3.7% 완충화된 포르말린으로 고정하였다. 그 후 샘플을 헹구어 과량의 고정화제를 제거하고 Calci-Clear Rapid(National Diagnostics, USA)를 사용하여 1 주간 석회질을 제거하였다. 에탄올과 자일렌을 그레이딩하여 탈수하고 파라핀으로 포매하였다. 조직학적 연구를 위해 6 ㎛ 두께의 단편을 마이크로톰으로 잘라내었다. 단편을 상세한 형태학적 연구를 위해 헤마톡실린과 에오신(H & E)으로, GAG 분포를 측정하기 위해 사프라닌 O와 패스트 그린으로 염색하였다.
연골 결함의 평가
단편들을 Pineda 등(1992)와 Wakitani 등(1994)의 것에서 변형시킨 조직학적 그레이딩 스케일을 이용하여 두 연구자에 의해 블라인드 방식으로 평가하였다. 그레이딩 스케일은 총 0 내지 14 점 범위를 갖는 총 5 카테고리로 구성되었다(표 4).
연골 결함에 대한 조직학적 그레이딩 스케일
카테고리 점수
세포 형태 유리질 연골 대부분 유리질 연골 대부분 섬유 연골 대부분 비연골 비연골만 매트릭스 염색( 이염색성 ) 정상(숙주의 인접 연골) 약간 감소 유의하게 감소 이염색성 없음 표면 규칙성 평탄함(>3/4a) 중간(1/2<3/4a) 불규칙(1/4<1/2a) 매우 불규칙(<1/4a) 연골 두께 0>2/3b 1/3>2/3b <1/3b 공여체의 숙주 인접 연골과의 통합 양 가장자리 모두 통합 한쪽 가장자리 통함 양 가장자리 모두 통합되지 않음 0123401230123012012
최대 합계 14
a. 연골 결함 전체 면적에 비한 수복 연골의 총 평탄 면적
b. 주위 연골에 비한 수복 연골의 평균 두께
통계학적 분석
통계학적 유의성을 t-테스트를 이용하여 평가하였다. 유의수준은 p<0.05로 하였다.
결과
스폰지 형태 지지체에서 배양된 늑골 연골세포
세 개의 다른 지지체(콜라겐-GAG 스폰지(COL-GAG), 키토산 스폰지(CS), 및 HA-코팅된 스폰지(CA-HA))에서의 연골세포의 증식률을 MTT 어세이를 이용하여 1, 2 및 4 주 배양에서 비교하였다(도 11).
도 11의 값은 이들 지지체 내부의 세포 증식을 나타낸다. CS와 CS-HA의 OD 값은 배양 시간에 따라 점차 증가하고 두 지지체 간에 주목할만한 차이가 없었다. 유사한 경향이 COL-GAG에서 발견되나, 처음에 낮은 수준으로 출발하였다. 28 일 배양에서, OD 값은 7 일 배양의 것과 비교하여 COL-GAG, CS 및 CS-HA에서 각각 1.30, 1.43 및 1.40배로 증가하였다.
컴포지트 지지체의 콜라겐의 신생합성을 측정하기 위하여, 프로콜라겐 타입 Ⅰ C-펩티드(PIP)를 ELISA 어세이에 의해 측정하였다(도 12a). 7 일 배양에서, CS와 CS-HA의 콜라겐 합성은 COL-GAG의 것 보다 많았으며, 유의한 차이가 있었다. 그러나, 2 주에는 CS의 콜라겐 합성이 COL-GAG와 CS-HA에서 보다 훨씬 강하였다(CS>CS-HA>COL-GAG). 7 일 배양과 비교하여, 14 일 배양에서 콜라겐 합성은 유의하게 감소하였다. 4 주간의 배양기간 중, CS에서 배양배지로의 콜라겐 분비가 점차 감소하고, 반대로 COL-GAG 및 CS-HA에서 콜라겐 방출이 1 주와 2 주 사이에 유의하게 감소한 후, 2 주와 4 주 사이에 증가하였다.
블라이스캔 어세이로 1 주 동안 늑골 연골세포-접종된 세 개의 다른 지지체로부터 배양 상등액으로 방출된 GAG의 양을 측정하였다(도 12b). 첫째 주 배양에서, 키토산 지지체는 모두 COL-GAG 보다 많은 GAG를 분비하였다. 14 일에, 방출된 GAG 양은 세 지지체에서 유사하였으나, 28 일 배양에서 COL-GAG에서 방출된 GAG 양은 CS와 CS-HA 보다 매우 적었다.
토끼 늑골 연골세포를 콜라겐-GAG 스폰지(COL-GAG), 키토산 스폰지(CS) 및 키토산-히알루론산 스폰지(CS-HA)로 접종하고 28 일 동안 배양하는 동안, 배양 기간 내내 CS와 CS-HA가 COL-GAG 보다 크기가 더 컸다.
H & E 염색을 이용하여 세 표본을 조직학적으로 검사하여 형태학적 특징을 밝혀내었다(도 13). 도 13에서 S는 표면, C는 중앙을 나타내며, 스케일 바는 50㎛를 나타내고, 흑색 화살표는 섬유 조직, 백색 화살표는 사멸 세포, 흑색 화살표 헤드는 둥근 모양의 세포를, 백색 화살표의 헤드는 스핀들 모양의 세포를 나타내다. 2 일 연골세포 배양에서, 접종된 세포는 주로 키토산 지지체 특히 COL-GAG의 표면 영역에 존재하였다. 2 일에 원형 세포와 스핀들형 세포가 혼합되어 있고 어떠한 세포도 열공을 갖지 않았다. CS와 CS-HA의 중심에 있는 세포들은 응집하였지만, COL-GAG에서는 2-일 표본에서 중심에 세포가 드물고 분산되어 있었다.
7 일 배양에서, 지지체의 주변부에서 세포 수 증가가 확연하고 새로운 세포주변 매트릭스가 대부분의 세포를 둘러쌌다. CS와 CS-HA 지지체의 중심과 주변부에서, 대다수의 접종 세포들이 구형의 형태를 유지하고 열공을 가지며 풍부한 매트릭스를 합성하였다. 그러나, COL-GAG에서 주변 세포는 원형이지만, 열공을 갖지 않으며 중심 세포는 스핀들형의 형태로 응집하지 않았다.
14 일 배양에서, 두 키토산-기제 지지체의 중심과 주변의 대부분 세포들이 여전히 구형의 형태를 유지하며, 열공을 갖고, 더 풍분한 세포외 매트릭스를 합성하였다. COL-GAG에서, 주변 세포는 구형 형태이고, 열공을 가지며, 풍분한 세포외 매트릭스를 합성하지만, 중심 세포는 여전히 스핀들형이고, 작은 열공을 가지며, 소량의 ECM을 합성하였다.
실험 말기(28 일)에, 키토산-기제 지지체들의 표면은 얇은 섬유 조직으로 덮였다. 중심과 주변의 세포가 작아지고, 여전히 큰 열공을 가지고 있었다. COL-GAG에서, 주변 세포는 세포성이 감소되고 매우 작은 원형 형태를 가지며, 열공을 가지지 않았다. 중심 세포는 14 일과 유사하였다.
사프라닌 O-패스트 그린(S/O) 염색에 의해 GAG의 연골 ECM을 조직학적 염색한 결과 배양 기간에 걸쳐 지지체의 중심에서 더 많은 GAG가 CS와 CS-HA 지지체에서 검출되는 것으로 밝혀졌다(도 14). 도 14에서 백색 화살표 헤드는 사프라닌-O로 염색된 프레임을, 흑색 화살표는 섬유성 조직을, 백색 화살표는 패스트 그린으로 염색된 세포를 나타내며, 스케일 바는 100㎛을 나타낸다. 키토산-기제 지지체들에서, 중심 세포는 2 일 배양 표본부터 S/O로 염색되었다. 그러나 COL-GAG에서, 중심 세포는 S/O로 염색되지 않았다. GAG의 축적량은 세 타입의 지지체에서 배양시간이 증가함에 따라 증가하였다. 28 일 배양에서, 지지체의 표면이 때때로 패스트 그린으로 염색되었다.
연골세포가 없는 CS 및 CS-HA 지지체에서 GAG가 조직학적으로 검출되지 않았으나, 콜라겐 지지체에서는 황산콘드로이틴과 컨쥬게이트되어 사프라닌 O로 양성 염색되었다.
타입 Ⅰ 및 Ⅱ 콜라겐의 면역염색
키토산 지지체들에서, 콜라겐 타입 Ⅰ은 1 및 2-주 표본에서 검출되지 않았다. 반대로, 항-타입 Ⅱ 콜라겐 항체가 1 내지 2 주 배양기간 중 키토산 지지체에서 강한 양성이었다. 4 주에, 지지체의 표면과 중심의 세포 응집체의 일부 영역이 항-타입 Ⅰ 콜라겐 항체 양성이었다. 그러나 4-주 표본에서 항-타입 Ⅱ 콜라겐 항체는 여전히 양성이나 약해졌다.
콜라겐 스폰지에서, 타입 Ⅰ 콜라겐이 1, 2 및 4-주 표본 모두에서 검출되었다. 항-타입 Ⅱ 콜라겐 항체는 1 주에 표면에서만 2 주에는 주변의 매트릭스와 중심의 소수 세포에서만 양성이었다. 4-주 표본에서 항-타입 Ⅱ 콜라겐 항체는 매우 약한 양성이었다(도 15 및 16). 도 15에서, 흑색 화살표는 섬유상 조직을, 흑색 화살표 헤드는 타입 I 콜라겐이 발현된 세포를, 백색 화살표는 COL-GAG 프레임을 나타내며, 도 15 및 16의 스케일 바는 100㎛을 나타낸다.
상기 조직학적 관찰 결과 탈분화된 연골세포를 세 가지 타입의 스폰지-형태의 지지체(키토산, HA-코팅된 키토산 및 콜라겐-GAG 스폰지)로 접종하고, 키토산 스폰지에서 1 내지 2 주 동안 형태, GAG 합성, 및 타입 Ⅱ 콜라겐 발현에 있어서 재분화하는 것으로 나타났다. 그러나 COL-GAG에서는, 내부 세포 접종이 좋지 않았고 따라서 중심 세포의 재분화가 좋지 않았다. 매우 늦게, 4 주에 세포들은 합성된 ECM 활성을 상실하였다(열공이 작아졌다).
생체 내 결과
본 연구는 체중-부하 동물 모델에서 전층 관절 연골 결함의 수복에서 배양된 늑골 연골세포-키토산 컴포지트의 역할을 평가하기 위하여 설계되었다.
제2 계대 CC를 HA-CS 지지체로 접종하고 지지체를 2 주간 배양하였다. 소상성 연골 결함을 토끼의 대퇴골 융기의 슬개골 홈에 외과적으로 만들었다. 동물을 안락사하고 무릎 관절을 6 주와 12 주에 수확하였다. 표본을 육안적, 조직학적, 면역조직화학적으로 분석하였다.
임상적 검사
어느 실험동물에서도 수술후 합병증은 발생하지 않았다. 연구 중 관절 유출 및 불구의 징후는 없었다.
전체 외관
전반적인 관찰 결과 어느 관절에서도 활막 유출이나 활막염의 징후는 발견되지 않았다. 활막 조직의 조직학을 수행하지는 않았으나, 염증 반응의 전반적인 징후는 없었다. 전반적으로, 모든 관절의 활막액은 양, 점도, 색깔 면에서 정상이었다.
도 17 및 18에서 Control 은 대조군을, S는 HA-CS 이식된 결함을, S-CELL은 늑골 연골세포가 접종된 HA-CS 이식된 결함을 나타낸다.
빈(대조) 결함
6 주에, 대조군에서 결함은 부드러운 표면을 나타내었다. 수복 조직과 인접한 연골 사이에 공간이나 불연속성이 관찰되었다. 결함의 가장자리를 식별할 수 있었다. 수복 조직은 인접한 정상 연골과 비교하여 더 희고 다소 불투명하였다(도 17). 12 주에, 대조군의 수복 조직은 희고 불투명한 외관을 가지므로 정상 인접 연골로부터 쉽게 구별되었다. 결함은 부드러운 백색 수복 조직으로 완전히 채워졌다(도 17).
HA-CS 이식된 결함
6 주에, 전반적 관찰 하에서, 일부 결함은 수복 조직으로 완전히 채워지지 않았고, 일부 영역에서 연골하 뼈가 노출되어 있었다. 결함에 있는 수복 조직의 표면은 주위 정상 연골 보다 더 불규칙적이고 수복 조직의 가장자리가 부드럽지 않았다. 수복 조직은 백색에서 분홍색 외관으로 반투명하였다(도 17). 12 주에, 수복 조직은 여전히 식별가능하나 외관과 질감 면에서 유리질이었다. 또한 결함은 인접 정상 연골의 수준으로 채워졌다. 그들의 일부는 6-주 표본의 것 보다 더 부드러웠다. 일부 경우(1/8) 수복 조직은 연골이 아니라 뼈로 채워졌다(도 17).
늑골 연골세포-접종 HA-CS 이식된 결함
6 주에, 모든 결함은 수복 조직으로 채워지고, 결함의 가장자리는 주위 정상 연골과 식별가능하였다. 수복 조직의 표면과 가장자리는 거칠고 불규칙적이었다. 수복 조직은 외관과 질감에서 유리질이었다(도 17). 12 주에, 전반적 관찰 하에 수복 모든 그룹에서 수복 조직이 주위 정상 연골 수준으로 형성되었다. 수복 조직의 표면과 가장자리는 6-주 표본 보다 더 부드러웠다. 수복 조직은 여전히 주변 정상 연골과 식별 가능하였다. 수복 연골의 가장자리는 정상 연골과 좀 더 부드럽게 통합되어 있었다(도 17).
6 주에, CS로 이식된 결함의 전반적 외관은 세포-적재 CS의 것과 유사하였다: 모두 일차적으로 백색이고 다소 불규칙적이었다. 12 주까지, 대조 결함은 일반적으로 표면이 융기되고 불규칙적인 CS 이식된 결함 보다 확연히 부드러웠다. 대조 결함의 표면은 백색인 반면, 이식 결함의 표면은 분홍색이었다. 세포-적재 이식 결함에서 수복 연골의 색깔과 질감은 정상 인접 연골의 것들과 유사하였다.
형태
대조 결함
6 주에, 이식편 접합부에서 섬유 연골 조직형성에 근접한 부가가 나타났다. 결함은 수복조직과 인접 관절 연골 사이에 일측 또는 양측에서 공간이나 연속성 결여를 나타내었다. 이 발견은 주변 관절 연골과 수복 조직의 통합 감소를 가리키는 것이다. 수복 연골과 인접 정상 연골 사이의 경계는 종종 피브릴 연속성을 나타내었다. 수복 조직의 표면은 3-5 층의 평평한 세포로 구성되고 피브릴화되었다. 수복 조직은 섬유 조직과 과세포성분(hypercellular) 섬유 연골의 혼합물로 구성되었다. 일부 결함은 섬유 및 섬유 연골 수복 연골에서 갈라진 틈을 나타내었다. 수복 조직은 연골하 뼈를 양호하게 회복하였다(도 18). 도 18은 흑색 스케일 바는 100㎛, 백색 스케일 바는 400㎛를 나타낸다.
12 주에, 일부 연골 결함은 수복 조직과 인접 정상 연골 사이에 공간이나 연속성의 결여를 나타내었다. 수복 조직의 표면은 부드럽고 잘 피브릴화되어 있었다. 결함은 연골세포와 매트릭스로 채워져 있다. 그러나 섬유아세포가 표면층에서 우세할 뿐만 아니라, 대부분의 표면은 섬유성 매트릭스로 구성되어 있다. 수복 조직은 정교한 ECM 유사 섬유성 연골을 가지며, 원형의 상대적으로 성숙한 연골세포양 세포를 갖는다. 따라서 수술 후 12 주에 대조군의 수복 조직은 대부분 섬유성 조직과 섬유 연골 조직으로 구성되었다(도 18).
HA-CS 지지체 이식된 결함
6 주에, 수복 조직은 인접 정상 연골과 잘 통합되어 있었다. 현미경적으로 수복 조직은 과세포성분이다. 수복 조직은 대부분 비후성 연골세포이고 키토산 스폰지로 처리된 골연골 결함에서 평평한 피상 세포이다. 수복 조직의 기저층은 불규칙적인 ECM을 갖고 미성숙 실질세포를 닮은 스핀들형 세포를 갖는다. 수복 조직은 유리질 및 섬유 연골이었다. 결함의 표면에 있는 소수의 세포층은 작고 평평하며, ECM은 H & E로 에오신친화성 염색되었다. 섬유 조직은 거의 보편적으로 수복 조직의 표면에서 발견되었다. 수복 조직의 중간층은 유리질 연골을 닮은 ECM을 갖고 원형의 큰 핵, 상대적으로 미성숙한 연골세포양 세포가 있었다(도 18). 그러나 빈번하지는 않지만 수복 연골에 수직 틈이 발견되기도 하였다.
12 주에, 수복 조직과 인접 정상 연골은 잘 통합되어 있었다. 수복 조직은 12 주에 키토산 스폰지로 처리된 골연골 결함에서 대부분 미성숙 연골세포와 평평해진 피상 세포를 갖는다. 길어진 섬유아세포가 표면과 평행하여 배열되어 있었다. 결함은 고밀도 미성숙 연골세포와 유리질 매트릭스로 채워져 있었다. 수복 연골의 기저에는 비후성 연골세포가 있고 연골하 뼈로 잘 회복되어 있었다. 때때로 일부 결함은 연골성 조직이 아닌 얇은 섬유 조직으로 덮인 뼈 조직으로 채워져 있다(도 18).
늑골 연골세포-적재 HA-CS 지지체 이식된 결함
6 주 표본에서, 수복 조직에 있는 연골세포가 인접 정상 연골 보다 더 많은 수였으며, 그들은 컬럼으로 조직화되어 있었다. 표면에는 피브릴화의 증거가 없었다. 수복 연골은 정상적으로 주변 정상 연골과 뼈 부분과의 통합을 보여주었다. 어떠한 결함도 수복 연골에서 갈라진 틈을 갖지 않았다(도 18). 뼈 소주(trabecules)가 이식편의 깊은 부위에서 나타났고, 둘러싼 작은 잔여 연골세포 섬이 해면골에서 관찰되었다.
12 주에, 세포-적재 CS-HA로 처리된 결함은 세포와 매트릭스로 완전 채워졌다. 수복 조직은 정상적으로 연골하 뼈와 인접한 정상 연골과 통합되었다. 어떠한 결함도 수복 연골에서 갈라진 틈을 갖지 않았다. 수복 조직에는 하나의 열공 내에 하나 또는 여러 개의 연골세포가 있으며 같은 기원의(isogenous) 그룹으로 구성되어 있고 컬럼으로 조직화되어 있었다. 수복 조직은 풍분한 세포 외 매트릭스, 질서있게 배열된 연골세포를 가지며, 약간 거친 표면이 나타나지만 어떠한 결함도 표면 피브릴화를 나타내지 않았다. 표면에 있는 2 내지 4 층의 연골세포는 작고 평평한 형태이고, 열공이 있다. 수복 조직의 기저에 있는 연골세포는 크고 원형 세포이며 비후화되어 있고, 표면의 것 보다 수가 많다. 수복 연골은 대부분 유리질 연골이다. 이들 결함에 형성된 유리질 연골의 두께는 인접 정상 연골의 것들 보다 더 얇았다(도 18).
GAG 분포 - 사프라닌 O 염색
대조 결함
6 주에, 대조 결함에서 사프라닌 O로 염색되는 수복 조직 부위는 단지 수복 조직의 기저에 있는 일부 부위였다. 다른 수복 조직은 사프라닌 O로 염색되지 않았고, 더욱이 수복 조직의 표면은 반대 염색 색깔인 패스트 그린으로 염색되었다. 대조 단편에서 보통 내지 심각한 변색성 염색의 상실이 명백하였다(도 19). 12 주에, 수복 조직의 표면은 여전히 패스트 그린으로 염색되었다. 단지 한 경우에만 수복 조직이 사프라닌 O로 염색되었고, 나머지는 사프라닌 O에 대해 음성이었다(도 19).
HA-CS 지지체 이식된 결함
6 주에, 비후성 연골세포로 충진된 부위가 사프라닌 O 양성 염색이었고 주위 정상 연골에 인접한 부위는 약하게 염색되었다. 사프라닌 O-패스트 그린 염색은 결함 기저부의 비후성 연골세포 부위에서 대부분 확연히 나타났다(도 19). 12 주에, 수복 조직의 기저부와 주위 정상 연골의 인접부가 6 주 보다 더 강하게 사프라닌 O로 염색되었다(도 19).
늑골 연골세포-적재 HA-CS 지지체 이식된 결함
6 주에, 모든 수복 조직이 사프라닌 O로 염색되었으나 주위 정상 연골에 비해 다소 감소되었고 수복 조직의 기저부가 사프라닌 O에 대해 강한 양성이었다. 수복 연골의 염색 강도는 정상 인접 연골의 것과 비교하여 약하게 또는 중간 정도 감소하였다(도 19). 12 주에, 수복 조직은 중심 일부 부위를 제외하고는 주위 정상 연골 수준으로 사프라닌 O로 염색되었다. 대부분의 수복 연골은 유리질양으로 보였고 결함은 반경 영역에서 수직 컬럼의 연골세포를 나타내었다(도 19).
타입 Ⅰ, Ⅱ 콜라겐에 대한 면역염색
대조 결함
6 주에, 수복 조직의 상부 절반과 정상 연골의 인접부가 항-타입 Ⅰ 콜라겐 양성이었다. 석회화된 연골을 제외한 다른 부분은 항-타입 Ⅱ 콜라겐 양성이었다(도 20). 12 주에, 수복 조직의 전체 부위의 세포는 항-타입 Ⅰ 콜라겐 양성이었다(도 20).
HA-CS 지지체 이식된 결함
6 주에, 수복 조직의 가장자리와 상부는 항-타입 Ⅰ 콜라겐 양성이었다. 비후성 부분 또한 항-타입 Ⅰ 콜라겐 양성이었다(도 20). 12 주에, 수복 조직의 표면은 항-타입 Ⅰ 콜라겐 양성이고 나머지는 항-타입 Ⅱ 콜라겐 양성이었다(도 20).
늑골 연골세포-적재 HA-CS 지지체 이식된 결함
6 주에, 수복 조직 표면의 작은 부분이 항-타입 Ⅰ 콜라겐 양성이었다. 항-타입 Ⅱ 콜라겐 발현은 인접 정상 연골에 비해 수복 조직에서 감소되었다(도 20). 12 주에, 표면의 작은 부분에서 항-타입 Ⅰ 콜라겐이 약한 양성 발현이었다. 수복 조직은 정상 연골과 유사한 항-타입 Ⅱ 콜라겐 발현을 나타내었다(도 20).
조직학적 그레이딩 스케일 결과(평균 점수)를 표 5에 나타내었다.
대조 지지체 지지체 + 세포
6 주 12 주 6 주 12 주 6 주 12 주
세포 형태 1.67±0.58a 2.5±0.84 2.25±0.96 2.5±1.2 1.75±0.96 1±0.71
매트릭스 염색 2±0 2.5±0.84 2.5±0.58 2.13±0.83 2±0.82 0.8±0.45
표면 불규칙성 0.33±0.58 1.17±0.75 0.5±1 1±0.76 0.75±0.5 0.4±.055
연골 두께 0±0 0.5±0.84 1.25±0.96 1.25±0.89 0.75±0.96 0.8±0.45
숙주 인접연골과의 통합 1±0 0.67±0.52 0±0 0.13±0.35 0±0 0.2±0.45
합계 5±1 7.33±2.4 6.5±3.11 7±2.62 5.25±2.99 3.2±1.79
a S.D.로 표시
실시예 6: 간엽줄기세포성 탈분화세포 -키토산 기제 지지체의 관절 연골 결함 수복효과 평가
재료 및 방법
연골세포의 분리 및 배양
실시예 1에서와 같이 늑연골에서 늑연골 세포를 효소처리를 통해 분리한 후 5×105 세포/100 ㎜ 직경 페트리디쉬의 세포밀도로 접종을 하고, 실시예 3에서와 같이 1 ng/ml의 FGF를 첨가한 MSCGM에서 계대 8까지 하부배양하여 간엽줄기세포성 탈분화세포를 얻었다.
간엽줄기세포성 탈분화세포 -키토산 지지체의 제조 및 배양
실시예 5에서와 같이 키토산 스폰지를 제조하고 히알루논산으로 코팅하였다. 직경 5 ㎜의 HA-CS 스폰지에 제8 계대 2×106 간엽줄기세포성 탈분화세포를 접종하여 지지체-간엽줄기세포성 탈분화세포를 제조한 후, 실시예 4에서와 같은 TGF-beta가 포함된 연골분화배지에서 2주간 연골로 분화를 유도하였다. 연골로 분화정도를 확인하기 위해 사프라닌-O 염색을 실시하였다.
관절 연골 손상 수복의 효과
래빗을 상기 실시예 1과 같이 마취시키고, 수술 전에 동물에게 항생제를 투여하였다. 양측 대퇴골의 슬개골 홈에 직경 5 ㎜, 깊이는 약 2.0 내지 2.5 ㎜결함을 만들고, 실시예 2와 같이 연골로 분화된 간엽줄기세포성 탈분화세포-지지체를 이식하였다.
결과
연골세포로의 재분화
도 21은 늑골연골을 계대배양하여 얻은 간엽줄기세포성 탈분화세포를 키토산 스폰지에 로딩하여 연골분화 유도 배지에서 재분화시킨 연골세포를 함유하는 인공연골의 육안적 사진이다.
도 22는 상기 연골분화 유도 배지에서 재분화시킨 연골세포를 사프라닌 O로 GAG 염색한 결과를 나타낸다. 연골로의 분화 유도 2주 후 스폰지내의 간엽줄기세포성 탈분화세포가 연골세포로 재분화된 것을 알 수 있었다.
관절 연골 손상의 수복
도 23은 간엽줄기세포성 탈분화세포-키토산 기제 지지체를 토끼의 관절 연골 결함에 이식 후 6주 후의 육안적 사진이다. 수복된 조직은 연접 정상조직과 매끈하게 이어졌고, 수복조직은 외관과 질감에서 유리질 연골의 모습을 나타내었다.
본 발명을 통해, 늑골 연골이 관절 연골에 비해 더 높은 세포 수율과 세포 확장률을 제공하여 연골 수복을 위한 세포원으로서 관절 연골보다 우수함을 밝혔다. 또한, ACT 적용에 있어서 연골세포의 계대배양시 연골세포로서의 성격을 잃는 탈분화 속도가 상당히 빠른 것이 단점이었는데, 이 연구의 결과 늑골 연골로부터 얻은 늑골 연골세포를 계대 배양시 탈분화된 연골세포가 간엽줄기세포의 성질을 나타내어, 늑골 연골세포가 완전히 탈분화된 이후에도 분화 유도 배지에서 재배양할 경우 연골세포 뿐만 아니라 골세포, 지방세포 등의 얻고자 하는 분화된 세포로 적절한 환경 조성 하에서 분화시킬 수 있음을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명은 늑골 연골세포를 계대 배양하여 얻은 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 함유하는 인공 연골 및 세포 치료제를 제공한다.
또한, 자가 늑골 연골세포가 로딩된 키토산-기제 지지체를 관절 결함에 이식하면 체중-부하 위치에서 전층 관절 연골 결함을 매우 효과적으로 수복할 수 있음을 밝혔다. 따라서, 본 발명은 또한 키토산 지지체 상에 로딩된 연공 연골을 제공한다.
도 1은 관절 연골(AC) 및 늑골 연골(CC)로부터 분리된 연골세포의 시험관 내 확장능력을 비교한 그래프이다.
도 2는 AC과 CC의 각 계대에서의 형태 변화와 타입 II 콜라겐의 발현을 보여주는 사진이다.
도 3a는 제7계대의 늑골 연골세포의 모습을, 도 3b 및 도 3c는 타입 I, II 콜라겐과 평활근 액틴 항체의 발현을 보여주는 사진이다.
도 4은 DMEM-FBS, MSCGM 및 MSCGM-FGF에서의 세포확장률을 보여주는 그래프이다.
도 5a 내지 도 5b는 DMEM-FBS, MSCGM 및 MSCGM-FGF에서 배양된 세포의 타입 I 콜라겐, 타입 II 콜라겐 및 SMA 에 대한 항체 발현도를 각각 보여준다.
도 6은 DMEM-FBS, MSCGM 및 MSCGM-FGF에서 배양된 세포의 연골세포로의 분화를 확인하기 위해 사프라닌 O로 GAG 염색을 한 결과를 나타낸다.
도 7a는 제7계대 늑골 연골세포를 펠렛으로 만들어 연골분화배지에서 연골로 분화유도한 결과를 보여준다.
도 7b는 연골세포로의 분화를 확인하기 위해 사프라닌 O로 GAG 염색을 한 결과를 나타낸다.
도 8a은 골세포로의 분화 유도한 세포에서의 골분화 초기 마커인 알칼라인 포스파타제의 발현을 보여주는 사진이고, 도 8b는 골분화 마커인 Alizarine red 염색 결과를 보여주는 사진이다.
도 9는 지방세포로 분화 유도한 세포를 Oil red O로 지방구를 염색한 결과를 나타낸다.
도 10은 늑골 연골세포-키토산 기제 지지체의 관절 연골 결합 수복을 위한 과정을 개략적으로 보여준다.
도 11은 Col-GAG, CS, CS-HA에서의 연골세포의 증식률을 MTT 어세이를 이용하여 비교한 그래프이다.
도 12a 및 12b는 PIP 및 GAG의 양을 측정한 결과를 보여준다.
도 13은 H& E 염색을 통해 세포의 형태학적 특징을 보여준다.
도 14는 사프라닌 O 및 패스트 그린 염색을 통해 GAG의 축적을 보여준다.
도 15 및 도 16은 각각 타입 I 콜라겐 및 타입 II 콜라겐에 대한 면역염색의 결과를 보여준다.
도 17은 관절 연골 결함의 수복된 조직의 전체 외관을 육안적으로 보여주는 사진이다.
도 18은 관절 연골 결함의 수복된 조직을 광학 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 19는 관절 연골 결함의 수복된 조직에서의 GAG 분포를 사프라닌 O로 염색하여 관찰한 결과를 보여준다.
도 20은 관절 연골 결함의 수복된 조직에서의 타입 I 및 II 콜라겐에 대한 면역 염색 결과를 보여준다.
도 21은 간엽줄기세포성 탈분화세포-키토산 기제 지지체를 연골분화 유도 배지에서 재분화시킨 연골세포를 함유하는 인공연골의 육안적 사진이다.
도 22는 연골분화 유도 배지에서 재분화시킨 연골세포를 사프라닌 O로 GAG 염색한 결과를 나타낸다.
도 23은 간엽줄기세포성 탈분화세포-키토산 기제 지지체를 토끼 관절 연골 결함에 이식 후 6주 후의 육안적 사진이다.

Claims (15)

  1. 늑골 연골세포를 간엽줄기세포성장배지(MSCGM), 또는 FGF(섬유아세포성장인자) 함유 간엽줄기세포성장배지(MSCGM)에서 계대 배양하여 얻은 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 함유하는 인공 연골.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 늑골 연골세포를 계대 배양하여 얻은 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 연골세포 분화 유도 배지에서 배양하여 재분화시킨 연골세포를 함유하는 인공 연골.
  4. 제3항에 있어서, 늑골 연골세포를 계대 배양하여 얻은 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 연골세포 분화 유도 배지에서 펠렛 배양하여 재분화시킨 연골세포를 함유하는 인공 연골.
  5. 제3항에 있어서, 연골세포가 키토산-기제 지지체(chitosan-based scaffold) 상에 로딩된 인공연골.
  6. 제5항에 있어서, 키토산-기제 지지체가 키토산 스폰지, TGF-β(Transforming Growth Factor-β) 함유 키토산 스폰지, 히알루론산 코팅된 키토산 스폰지, 황산콘드로이틴 코팅된 키토산 스폰지, 또는 상기 키토산과 콜라겐의 혼합 스폰지인 인공연골.
  7. 늑골 연골세포를 간엽줄기세포성장배지(MSCGM), 또는 FGF(섬유아세포성장인자) 함유 간엽줄기세포성장배지(MSCGM)에서 계대 배양하여 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 얻는 단계를 포함하는 인공연골의 제조 방법.
  8. 삭제
  9. 제7항에 있어서, 늑골 연골세포를 계대 배양하여 얻은 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 연골세포 분화 유도 배지에서 배양하여 재분화시키는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 연골세포 분화 유도 배지에서 펠렛 배양하여 재분화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 키토산-기제 지지체 상에 로딩하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 늑골 연골세포를 간엽줄기세포성장배지(MSCGM), 또는 FGF(섬유아세포성장인자) 함유 간엽줄기세포성장배지(MSCGM)에서 계대 배양하여 얻은 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 함유하는 세포 치료제.
  13. 제12항에 있어서, 상기 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 연골세포 분화 유도 배지에서 배양하여 재분화시킨 연골세포를 함유하는 세포 치료제.
  14. 제12항에 있어서, 상기 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 골 분화 유도 배지에서 배양하여 얻은 골세포를 함유하는 세포 치료제.
  15. 제12항에 있어서, 상기 간엽줄기세포성 탈분화 세포를 지방 세포 분화 유도 배지에서 배양하여 얻은 지방세포를 함유하는 세포 치료제.
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