WO2004003130A1

WO2004003130A1 - キトサンと酸性生体高分子とのハイブリッド繊維および動物細胞培養基材

Info

Publication number: WO2004003130A1
Application number: PCT/JP2003/008080
Authority: WO
Inventors: Tokifumi Majima; Norimasa Iwasaki; Tadanao Funakoshi; Akio Minami; Shin-Ichiro Nishimura; Seiichi Tokura; Kazuo Harada; Sachiko Nonaka; Nobuhiko Maekawa
Original assignee: Chemical Biology Institute
Priority date: 2002-06-28
Filing date: 2003-06-26
Publication date: 2004-01-08
Also published as: US20060134158A1; EP1533366A1; JPWO2004003130A1; JP3774466B2

Abstract

本発明は、動物細胞、例えば軟骨細胞または線維芽細胞の培養に適した３次元基材を提供する。該３次元基材は、繊維内部がキトサンまたはその塩よりなり、繊維表面がキトサンと生体吸収性の酸性生体高分子との複合体で被覆されているキトサン／酸性生体高分子ハイブリッド繊維であって、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を添加したＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）培地中に、室温で２週間置いても形態を保持する繊維より製造される。

Description

明細書キトサンと酸性生体高分子とのハイプリッド繊維および動物細胞培養基材技術分野

本発明は、キトサン Z酸性生体高分子ハイブリッド繊維、および該ハイブリツド繊維の製造方法に関する。本発明はさらに、該ハイプリッド繊維よりなる動物細胞培養用 3次元基材、並びに該基材を用いる動物細胞培養方法にも関する。背景技術

高齢化社会を迎え、関節症患者は人口の 1 %にも達しようとしている。これらの疾患者の大部分は軟骨組織が損傷を受けたり壌死することによって起こる変形性関節症や慢性リゥマチによるものと言われている。軟骨は自己再生能が極めて低いことから、外科的治療が必要な場合には人工関節置換術が施されている。しかし、この方法では装着物からの金属イオンの溶出による炎症や骨接合部との緩み、耐久性等に大きな課題があり、医療用具としての寿命は 1 0年程度とされていることから、人工関節手術は根治的な治療法にはなっていない。

また事故やスポーツによる靭帯（特に膝の関節を固定している膝前十字靭帯）や腱の損傷の治療では、自己の正常な靭帯あるいは腱の一部を移植する再建術が行われているが、この治療法では移植に使用した正常部位の筋力が半分程度に低下してしまい、運動機能に支障を生じることが大きな問題となっている。人工の合成繊锥から成る人工靭帯を移植する手術も従来から検討されてきたが、細胞が付着しないために人工物が時間の経過とともに擦り切れてしまうという問題があり、現在は殆ど使用されていない状況にある。

そこで、近年、自己再生能の低い組織を対象に、正常部位の自己組織を一度体外に取り出し、培養して増殖'分化させた後、再ぴ体内に移植して目的組織の再生を図ろうとする再生医療の研究が盛んに行われている。細胞はある物質の表面に接着することによって増殖 ·分化が起こること力ら、再生医療の発展には培養細胞が接着するための足場となる良好な人工基材（以下、基材と呼ぶ）の開発が不可欠とされている。

一般に、組織再生用の基材に求められる条件として、 ①炎症反応が見られず、生体親和性に優れていること、 ②生体吸収性であること、 ③細胞の接着性がよいこと、 ④細胞の活性を維持できること、 ⑤細胞の増殖 '分化による組織再生が可能な 3次元構造を有することが挙げられる。さらに、股関節部位の軟骨には 2 O M p a程度までの圧縮応力がかかり、靭帯や腱には大きい引張り応力がかかる。このことから、軟骨組織再生用または靭帯や腱の再生用基材には上記 5つの条件以外に、 ⑥体内で組織が再生されるまでの形状の安定性が確保されること、およぴ⑦機械的強度を有することの 2つの条件も満たす基材の開発が必要と考えられる。

再生医療の観点から線維芽細胞や平滑筋細胞、内皮細胞等の間質細胞を生体吸収性材料（ポリグリコール酸、綿、腸線縫合糸、セノレロース、ゼラチン、コラーゲン、ポリヒドロキシアルカノエート) または非生体吸収性材料 (ポリアミド化合物、ポリエステノレ化合物、ポリスチレン化合物、ポリプロピレン化合物、ポリアタリレート化合物、ポリビュル化合物、ポリカーボネート化合物、ポリテトラフルォロエチレン化合物、二トロセルロース化合物) から成る 3次元支持体 (フレームワーク）に埋め込んで培養し、間質細胞と間質細胞が自然に分泌する結合組織タンパク質によつて架橋される 3次元構造物を包んだ生間質組織を調製し、この構造物を移植または埋め込む方法も報告されている（特表平 11-506611号公報）。

また、天然の高分子を用いて靭帯や腱を再構築するための線維芽細胞培養用基材として、コラ一ゲンのスポンジゃファィバー（Dunn, M. G. et al., J. Biomed. Mater. Res., 29， 1363-1371 (1995)) 、コラーゲンにグリコサミノグリカンを結合させたスポンジ状の構造物 (Torres, D. S" et al., Biomaterials, 21, 1607- 1619 (2000)) 、ポリ乳酸のファイバーの表面にコラーゲンを結合させた構造物 (Ide, A" et al., Mater. Sci. Eng., C17, 95-99 (2001) ) 、コラ一ゲンフアイバ一にノルジヒドログアヤレチン酸を架橋した構造物 (Koob, T. J., et al., J. Biomed. Mater. Res., 56, 40-48 (2001)) 等を用いて、線維芽細胞の増殖性ゃ靭帯組織の再生検討が報告されている。しかし、このようなコラーゲンを使用する方法ではコラーゲン基材が生体と同種的なものであることから、これに伴う抗原性や感染が深刻な問題となる可能性が高い。また、コラーゲンゲルやコラーゲンを用いた基材は変位を受けて元に戻ることが困難であり、生体吸収性の合成ポリマーのような変位に対する弾力性に欠いていることも靭帯や腱の再生基材としては大きな問題となる。

これまでの生体吸収性の軟骨細胞培養基材として、ポリグリコール酸ゃポリ乳酸等の合成高分子を用いたフアイバーゃスポンジが検討されてきた（特公平 6 - 6 1 5 5号公報、特表平 8— 5 1 1 6 7 9号公報、 Ito, K. et al., Mat. Res. Soc. Proc, 252, 359-365 (1992), Freed, L. E. et al" J. Biol. Mater. Res" 27, 11-23 (1993)等）。上記合成高分子材料は体内での加水分解物が生体内の代謝中間体と同一であるため毒性がなく、高重合体が得られるため機械的強度を有し、成形が容易であるなどの長所がある。しカゝし、これらの生体吸収性合成高分子は細胞の接着性に欠けるために、.材料表面に生体の細胞接着性因子である R G D (アルギニン—グリシンーァスパラギン酸のトリペプチド) や、ゼラチン、コラーゲン等の生体高分子を固定化する方法によって細胞の接着性を向上させることが検討されてきた（Yamaoka, T. et al.， J. Biol. Macromol., 25， 265-271, (1999)等）。しかし、この様な化学的固定方法は操作が繁雑であり、また、固定化処理に使用した薬品の残存等も懸念される。

一方、天然高分子を用いた軟骨細胞培養用基材としては、コラーゲンのゲルやスポンジ状基材（特開平 6— 2 2 7 4 4、特表平 9一 5 1 0 6 3 9、特開 2 0 0 1 - 2 2 4 6 7 8 , Fujisato, T. et al" Biomaterials, 17, 155-162 (1996)等) 、キチンゃキトサンのスポンジ状基材が検討されてきた (Park, Y. J. et al.,

Biomaterials, 21, 153-159 (2000)等)。これらの基材は形状安定性および機械的強度に問題がある。また、コラーゲンは原材料費が高価であるとともに、抗原性や B S E等の感染も懸念される。

酸性（ァ-オン系）高分子と塩基性（カチオン系）高分子の複合体から成る培養基材が報告されている（特開平 6— 3 3 5 3 8 2号公報、特開平 6— 2 7 7 0 3 8号公報）力この方法では両者の溶液を混合し、乾燥させただけの板状や薄膜状構造物であり、それ自体が繊維等から成る多孔性の 3次元構造物ではない。また、上記溶液を適当な材料（ガラスや金属、プラスチック等）の表面に塗布や噴霧する方法も記載されているが、基材全体が生体吸収性のものではないために、生体での吸収性が要求される軟骨組織再生用の培養基材には適用できない。

生体吸収性の酸性高分子と塩基性高分子のハイプリッド繊維を作製する方法が報告されている（特開 2002— 291461) 。しかし、この »維の作製方法では酸性高分子であるアルギン酸等を主原料とし、これに極少量の塩基性高分子であるキトサン等を付与するものであるため、例えばアルギン酸を主材料とした繊維は親水性のために培養液中で膨潤し、形状が不安定である。また、酢酸に溶解したキトサンを塩化カルシウム中で紡糸し、ヒアルロン酸溶液中に浸漬した後、巻き取とつて、乾燥させただけのシート状繊維の周辺にキトサン溶液（酢酸に溶解したもの）を塗布して重ね合せた後、乾燥させたものを 3次元の培養基材として用いた報告もなされている（岩崎ら、第 75回日本整形外科学会学術集会、 2 002. 5. 16-19 (岡山）；山根ら、第 16回日本整形外科学会基礎学術集会、 2001. 10. 18 (広島）、第 20回日本運動器移植-再生医学研究会、 2001. 10. 27 (京都） ) 。しかし、これらの繊維はキトサンが酢酸塩を形成したまま繊維ィ匕されているため、培養溶液中で維維が少しずつ膨潤したり溶け出し培養中での基材形状の安定性が悪く基材内部での軟骨細胞の増殖性も低下するという問題があつた。発明が解決しようとする技術的課題

本発明は組織再生用培養基材に要求される上記条件をすベて満たした動物細胞培養用基材を提供することを目的とする。即ち、本発明は、

1) 動物細胞の培養において細胞の播種が容易であり、播種時、及び増殖した動物細胞が培養基材に容易に吸着 ·接着する。

2 ) 軟骨細胞または線維芽細胞等の動物細胞が基材の表面および内部で増殖し、コラーゲンなど細胞外マトリッタスが分泌され結合組織を形成する。

3) 形成された結合組織が占め得る 3次元的空間を有する。

4) 移植後組織が再生するまで十分な機械的強度を有する。

5) 生体適合性および生体吸収性を有し、組織再生後は究極的には消滅する、動物細胞培養用基材を提供することを目的とする。発明の開示

本発明は、繊維内部がキトサンまたはその塩よりなり、繊維表面がキトサンと生体吸収性の酸性生体高分子との複合体で被覆されているキトサン /酸性生体高分子ハイブリッド繊維であって、 1 0 %FBS (ゥシ胎仔血清）を添加した DMEM (Dulbecco s Modified Eagles Medium) 培地中に、室温で 2週間置いても形態を保持する繊锥に関する。「形態を保持する」とは、溶解、または膨潤せずもとの形態を失わないことを言う。

本発明はまた、以下の工程：

1 ) キトサンを酸の水溶液に溶解しキトサンの塩の水溶液を調製する；

2 ) キトサンの塩の水溶液を、アル力リ土類金属の塩を凝固剤として用いて湿式紡糸して ¾锥を形成させる；

3 ) その繊維を生体吸収性の酸性生体高分子の溶液に浸漬して、繊維表面でキトサンと酸性生体高分子を反応させてキトサン/酸性生体高分子ハイプリッド繊維を形成させる；

4 ) 場合によりハイプリッド繊維を延伸する；、

5 ) ハイブリッド »を塩基、 2塩基酸以上の無機酸の若しくはその塩、または 3塩基酸以上の有機酸もしくはその塩の水溶液で処理する；

を含む上記維維の製造方法にも関する。

本発明はまた、以下の工程：

2 ) キトサンの塩の水溶液を、塩基、 2塩基酸以上の無機酸もしくはその塩、または 3塩基酸以上の有機酸もしくはその塩を凝固剤として用いて湿式紡糸して纖锥を形成させる；

3 ) 形成された繊維を生体吸収性の酸性生体高分子の溶液に浸漬して、維锥表面でキトサンと酸性生体高分子を反応させてキトサン Z酸性生体高分子ハイブリッド!^锥を形成させる；

4 ) 場合によりハイプリッド繊锥を延伸する；ことを含む上記 »锥の製造方法にも関する。

本発明はさらに、該繊锥よりなる動物細胞培養用 3次元基材にも関する。動物細胞としては、限定されるものではないが軟骨細胞、線維芽細胞、神経細胞、これらの細胞に分化する未分化細胞を含む。

本発明は、該 3次元基材を培養基材として用いて、動物細胞を生体外で培養することを含む動物細胞の培養方法にも関する。

本発明は、上記培養によって得られる、培養基材に増殖した動物細胞が結合した移植用基材にも関する。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の 3次元基材を用いて培養した軟骨細胞の、培養 2 1日目の光学顕微鏡写真を示す模写図である。

図 2は、同じく軟骨細胞培養 2 1 0目のァノレシァンブルー 'サフラエン染色の結果を示す写真の模写図である。

図 3は、培養 1日目、 7日目、 1 4日目、および 2 1日目の 3次元基材あたりの、軟骨細胞のタンパク質量および酸性ムコ多糖量を示すグラフである。

図 4は、ゥサギの膝関節部位に欠損部を作製し、ここに予め 2週間ゥサギ軟骨細胞を培養した 3次元基材を移植し、移植後 8週目に欠損部を開腹しサフラニン 0染色による組織観察を行った結果を示す写真の模写図である。

図 5は、培養 1日目、 7 0目、 1 4日目、および 2 8日目の 3次元基材あたりの、線維芽細胞の D NA量を示すグラフである。

図 6は、 3次元基材で 2 8 S間培養した線維芽細胞を、抗マウス抗体を用いた streptavidin- biotin法による I型コラーゲンの免疫組織染色の結果を示す写真の模写図である。

図 7は 3次元基材で 2 8日間培養した線維芽細胞の走査型電子顕微鏡写真を示す模写図である。

明を実施するための最良の形鶴

本発明者は、繊維内部がキトサンまたはその塩よりなり、 I；維表面がキトサンと生体吸収性の酸性生体高分子との複合体で被覆されているキトサン酸性生体高分子ハイブリッド繊維であって、 1 0 %FBS (ゥシ胎仔血清）を添加した DMEM (Dulbecco s Modified Eagles Medium) 培地中に、室温で 2週間置いても形態を保持する繊锥を製造する 2つの方法を考案した。

第一の方法では、先ず塩基性高分子であるキトサンを酸の水溶液に溶解してキトサンの塩の水溶液を調製する。この場合用いる酸としては無機酸または有機酸のいずれでもよい。無機酸の好ましい例は、塩酸、硝酸等の 1塩基酸であり、有機酸の好ましい例はギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、ァスコルビン酸等である。キトサン塩の水溶液を湿式紡糸して繊維を調製する。湿式紡糸とは適当な溶剤に溶解した紡糸原液をノズルを通して脱溶媒和力の大きな凝固浴中に押出して凝固させる方法である。

凝固剤としては、カルシウム、マグネシウム、バリウム等のアルカリ土類金属の水溶性の塩、例えばハロゲン塩を用いる。特に好ましいのは塩化カルシウムである。アルカリ土類金属塩を水、水 Zアルコールの混合溶媒に溶解して用いる。アル力リ土類金属塩の濃度は、 1 0 %から飽和濃度まで、好ましくは 4 0〜 6 0 %である。

上記キトサン塩の水溶液をノズルから凝固剤を含む凝固浴中に押し出して、キトサンを凝固させ繊維を形成させる。形成した鶸锥はアルコール等の水と相溶性の溶媒 Z水の混合溶媒に浸漬し過剰の凝固剤を除去する。

本明細書で用いる「酸性生体高分子」とは、カルボキシル基、硫酸基、スルホン酸基、リン酸基等の酸性の基を有する天然に由来する高分子、またはその塩をいう。好ましい態様では生体高分子は多糖類である。天然に存在する生体高分子をいずれかの物理的、化学的、あるいは酵素的手段により低分子量ィ匕したもの、あるいは上記酸性基またはその塩を生じさせたものも「酸性生体高分子」に含む。カルボキシル基を有する酸性生体高分子の例としては、ダルコン酸、ダルク口ン酸、ィズロン酸、 D—マンヌロン酸、ガラタツロン酸、グルロン酸、シアル酸グルタミン酸を含むポリマー、例えばヒアル口ン酸、アルギン酸、へパリン、ポリグルタミン酸等が挙げられる。

硫酸基を有する酸性生体高分子の例としてはコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、へパリン、へパラン硫酸、ケラタン硫酸等が挙げられる。リン酸基を有する酸性生体高分子の例としては D NA、 R NA等が挙げられる。複合体の製造においてこれらの酸性生体高分子の 2種以上を用いてよい。酸性生体高分子の好ましい例はヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸である。

キトサンと酸性生体高分子との複合体とは正の電荷を有するキトサンと負の電荷を有する酸性生体高分子との間の静電的相互作用により形成される複合体をいう。複合体の生成には酸性生体高分子とキトサンを適当な媒体、例えば水中で接触させればよい。キトサンノ酸性生体高分子複合体を生成させる場合、両者の水溶液を混合する必要は必ずしも無く、固体のキトサンに酸性生体高分子の溶液を接触させればよいことを見出した。

酸性生体高分子を水または水/アルコールの混合溶媒等に溶解した溶液を調製する。酸性生体高分子の濃度は 0 . 0 1〜 1 0 %、好ましくは 0 . 0 5〜 1 %とする。上記キトサン繊維を酸性生体高分子の溶液に浸漬すると、聽表面で塩基性高分子であるキトサンと酸性生体高分子の複合体が形成される。この |¾锥は内部がキトサン塩で表面がキトサンと酸性生体高分子の複合体で被覆されたハイプリッド繊維である。該条纖は場合により延伸してもよい。複合体の生成反応は延伸後に行ってもよい。

このようにして生成した »锥を、無機塩基、 2塩基酸以上の無機酸若しくはその塩、 3塩基酸以上の有機酸もしくはその塩の水溶液または水 Z水と相溶性有機溶媒混合物溶液で後処理する。この後処理を行わないと培養基材として用いた場合に培養液中で繊維が徐々に溶解し、基材の形態の安定性が保てない。無機塩基の例としては N a OH, K O Hなどのアル力リ金属水酸化物を含む。 2塩基酸以上の無機酸の例は硫酸、リン酸等であり、その塩の例は、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリゥム等及びこれらに対応する力リゥム塩、アンモニゥム塩を含む。 3塩基酸以上の有機酸の例はクェン酸、ェチレンジァミン四酢酸、 1， 1 , 2—トリカルポキシエタン、 1 , 1， 2—トリカルポキシ一 2—メチルェタン、 1， 1 , 3—トリカルボキシプロパン、 1 , 2 , 3 一トリカルボキシプロパン、 1， 1 , 2， 2ーテトラカルボキシェタン、 1 , 2， 2 , 3—テトラカルポキシプロパン等を含む。これら後処理剤の濃度は 0 . 1〜 1 0 %、好ましくはアル力リ金属水酸化物等の無機塩基は 0 . 2〜 1 %、無機酸および有機酸は 1〜3 %である。処理後、十分水で洗浄して、次にメタノール等に浸漬して脱水し、乾燥する。

第 2の製造方法では凝固剤として無機塩基、 2塩基酸以上の無機酸若しくはその塩、 3塩基酸以上の有機酸もしくはその塩を用いること、及び後処理を行わない点が第 1の方法と異なる。すなわち、キトサンを酸の水溶液に溶解しキトサンの塩の水溶液を調製し；キトサンの塩の水溶液を、塩基、 2塩基酸以上の無機酸もしくはその塩、または 3塩基酸以上の有機酸もしくはその塩を凝固剤として用いて湿式紡糸して繊維を形成させる。形成した繊維はアルコール等の水と相溶性の溶媒 Z水の混合溶媒に浸漬し、過剰の凝固剤を除去する；その繊維を生体吸収 'I生の酸性生体高分子の溶液に浸漬して、锥表面でキトサンと酸性生体高分子を反応させてキトサン Z酸性生体高分子ハイプリッド »を形成させ、場合によりハイブリッド繊維を延伸することにより製造する。凝固剤としての無機塩基、 2 塩基酸以上の無機酸若しくはその塩、 3塩基酸以上の有機酸もしくはその塩の例は第 1の製造方法の後処理剤として挙げたのと同様である。凝固剤の濃度は 0 .

5〜 3 0 %とする。キトサン濃度、キトサンを溶解するに必要な酸の種類および濃度、酸性生体高分子の溶液の濃度は第 1の製造方法と同様でよい。

このようにして製造される、繊锥内部がキトサンまたはその塩よりなり、表面がキトサンと酸性生体高分子の複合体で被覆されたキトサン Zg矣性生体高分子ハイブリッド繊維は、相当の強度を有し、軟骨細胞や線維芽細胞等の動物細胞がよく付着するとともに、生体吸収性であり、生体適合性を有する。

動物細胞の移植用基材として用いるために、基材はその内部に細胞が増殖し、細胞から分泌されたマトリックスを保持しうる空間を有し、力が加わつた場合の形態安定性および強度を有する 3次元基材とすることが必要である。上記要件を満たす 3次元基材は、本発明の方法で製造したハイプリッド繊維から製造する織物、編物、または組み紐より製造できる。織物、編物、または組み紐は従来公知の方法により製造できる。織物、編物または組み紐は必要に応じ折り重ね、または積み重ねて、厚みを生じさせる。折り重ね、積み重ねた織物、編物または組み紐は本発明の繊維を用いて固定して一体ィ匕する。また折り重ね、積み重ねた織物、編物または組み紐はその内部に該 ¾锥をこれら以外の形態で含んでいてもよレ、。

3次元基材の形状は損傷部に応じて変化させる。

従って本宪明の 3次元基材は培養基材として以下のような好ましい性質を有する。

1 ) 軟骨細胞または線維芽細胞等の動物細胞の培養において細胞の播種が容易であり、播種時、及び増殖した軟骨細胞または線維芽細胞等の動物細胞が培養基材に吸着 ·接着する。

3 ) 形成された結合組織が占め得る 3次元的空間を有する。

5 ) 移植後組織が再生するまで十分な機械的強度を有する。

4 ) 生体適合性および生体吸収性を有し、組織再生後は究極的には消滅する。上記の 3次元培養基材を用いる動物細胞の培養は通常の動物細胞培養法（例えば、 Klagsburn, M., "harge Scale Preparation of Chondrocytes", Methods in Enzymol., 58:560(1979) を参照）に準じて行う。先ず、予め、該培養基材をォ

—トクレーブで加熱滅菌するか、ガス殺菌等を行い形状■特性が壌れないように殺菌処理を施し、殺菌した培地に添加する。次に、動物細胞を培養基材上にできるだけ 3次元的に均一に播いて培養する。培養に使用する細胞としてはゥサギ、ゥシ、ゥマ、ィヌ、ネコ、ヒト等の哺乳動物由来の細胞であれば、いずれの細胞でも培養可能である。好ましい細胞は、ヒト由来のものであり、特に好ましいのは移植しようとする患者由来の細胞である。

培地としては、通常の動物細胞培養法で用いられるもの、例えばヒト血清を含む DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) などが使用出来る。培地にはいずれかの成長因子、例えば TGF j3 (トランスフォーミング成長因子一、 F G F (線維芽細胞増殖因子）， C h M— 1 (コンドロモジエリン一 1 ) などを添加してもよい。

播種した細胞が培養基材上で良好に増殖、分化するためには細胞付着 ·吸着性の高い培養基材は極めて重要である。

生体内の軟骨組織には血管が発達していないことから低酸素条件となっていること、また、体重による圧負荷を受けていることから、これらの生体条件に近い条件での培養も有効と考えられる。このため軟骨細胞の培養では、 1〜1 5 %の低酸素条件下で行うことや、 0 . l〜2 0 M P a (周期負荷の場合には 0 . 0 1 〜2 H z ) の圧をかけて培養を行うこと、およびこれらの条件を組み合わせて培養することも可能である。圧を負荷する方法については、具体的にはポンプゃピストン状のものを用いて培地に空気圧や水圧を加える方法等がある。

また、靭帯や腱組織では引っ張り応力が加えられており、これに近い条件下での培養も有効と考えられる。このため、線維芽細胞の培養では 0 . 0 1〜5 O m m/ c m (周期負荷の場合には 0 . 0 1〜2 H z ) の引っ張り刺激下で培養を行つてもよレ、。弓 Iつ張り刺激の負荷は具体的には、培地に浸けた基材の两端を伸縮性を有する器具等に固定し、一定の伸縮変化を加えることにより行う。

軟骨細胞の培養では、少なくとも細胞外マトリツタスが形成されるまで行なう。通常、培養 2〜 4週間程度で軟骨細胞が本発明の 3次元培養基材の上に良好に接着、増殖し、コラ一ゲン様の細胞外マトリックスが形成される。

このようにして製造される、本宪明の、キトサンと酸性生体高分子とのハイブッリド»锥よりなる 3次元基材、及び 3次元基材に付着した軟骨組織を含む基材は、軟骨損傷の修復のための移植用基材として好適に用いることができる。

線維芽細胞の培養は、少なくとも細胞外マトリッタスが形成されるまで行なう。通常、培養 2〜 4週間程度で線維芽細胞が本発明の 3次元培養基材の上に良好に接着、増殖し、コラーゲン様の細胞外マトリックスが形成される。場合によっては、体外で十分な移植用組織を作製するために、 2ヶ月程度の培養を行う。

このようにして製造される、本発明の、キトサンと酸性生体高分子とのハイブッリド繊維よりなる 3次元基材、及び 3次元基材に付着した線維芽細胞を含む基材は、靭帯や腱の修復のための移植用基材として好適に用いることができる。未分化細胞を用、る場合には、例えば骨髄液から間葉系幹細胞を密度勾配遠心法等で分離した後、 DEME等の培地に TGF— βや FGF等の成長因子を添加して軟骨細胞ゃ線維芽細胞へ分化させた後、 3次元基材上に播種し、増殖 ·分化させることも可能である。また、基材上への細胞の播種は未分ィ匕細胞の状態で行うこともでさる。また、神経幹細胞を用いて EGF (上皮増殖因子)等を培地に添加し神経細胞に分化させた後、 3次元基材上に播種し、増殖 '分化させることも可能である。また、基材上への細胞の播種は未分化細胞の状態で行うこともできる。

以下に本発明を実施例により説明する。本発明がこれら実施例に限定されるものではないことは明かである。実施例

実施例 1

キトサンとヒアルロン酸のハイブリッド繊維 (1) および（2) の製造

8 (重量/容量）％のキトサン（君津化学工業社製、 F 2 P、分子量：約 165，

000) を 4%酢酸水溶液に溶解した溶液をカラム（ガラス製、内径 45mm、長さ 410mm) に詰め、濾布で加圧（0. 6 k g f /cm²) 濾過した。この濾液を紡糸用カラム（ガラス製、内径 45mm、長さ 410mm) に詰め、これを紡糸液として簡易紡糸装置を用い、以下のような方法によって繊維を作製した。 50ホール (小孑し φ 0, 1 mm) のノズノレ力ら、 0. 8 k g f /cm²のカロ圧下で飽和塩化カルシウム溶液中（第 1凝固浴：水 Zメタノール =1/1 (容量）、浴長 100 c m、容量約 2 L) に上記紡糸液を押出し、次に水 Zメタノ一ル= 1 /1 (容量）に浸漬（第 2凝固浴：浴長 50 cm、容量約 1 L) し、さらに 0. 05%ヒアルロン酸溶液（水 Zメタノール =lZl (容量） ) に浸漬（第 3凝固浴：浴長 50 cm、容量約 15 Om 1 ) した後、ローラー（第 1ローラー：速度 3. 2m/m i n、第 2ローラー： 3. 2 m/m i n、延伸倍率 1. 0) にかけ、最後に巻取りローラーで巻き取った後、 0. 8% (重量 Z容量）の水酸化ナトリゥム溶液（水 Zメタノール =1/9 (容量））に約 15時間浸漬後、水洗し、さらにメタノ一ルに約 2時間浸漬後取り出し室温で風乾させ、またはローラーから糸状に巻取りそのまま室温で風乾させ、しなやかなキトサン一ヒアルロン酸ノヽィブリッド繊锥（以下、「キトサン一ヒアル口ン酸ハイブリッド繊維（ 1 ) 」と呼ぶ）を得た。

第 3凝固浴中のヒアルロン酸濃度を 0. 1% (重量/容量）としたことを除いて、上記と同様な方法で紡糸を行ない、しなやかなキトサン一ヒアル口ン酸ハイプリッド H /維（以下、「キトサンーヒアル口ン酸ハイプリッド »| (2) J と呼ぶ）を得た。比較例 1

後処理を行わないハイプリッド繊維の製造

紡糸後水酸化ナトリゥム溶液で後処理を行わないことを除いては実施例 1のキトサン一ヒアルロン酸ハイブリッド繊維 (1) と同条件で繊維を製造した。比較例 2

キトサン単独繊維 (a) の製造

第 3凝固浴中にヒアルロン酸を添加しないことを除いて、実施例 1と同様な方法で紡糸を行ない、キトサン単独の繊維（以下、「キトサン繊維 (a) 」と呼ぶ）を得た。実施例 2

キトサンとヒアルロン酸とのハイブリッド繊維（3) および（4) の製造

3. 5 (重量 Z容量）％のキトサン（君津化学工業社製、 B、分子量：約 60 0 , 000) を 2 %水酢酸に溶解した溶液を力ラムに詰め、濾布で加圧ろ過した。この濾液を紡糸用カラムに詰め、これを紡糸液として簡易紡糸装置を用い、以下のような方法によつて維锥を作製した。 50ホール（小孔： 0. 1 mm φ ) のノズルから、 0. 8 k g f /cm²の加圧下で 53 (重量/容量）％塩化カノレシゥム溶液中（第 1凝固浴：水/メタノール =1ノ 1 (容量）、浴長 100 cm、容量約 2L) に上記紡糸液を押出し、次に水 Zメタノール =1/1 (容量））に浸漬（第 2凝固浴：浴長 50 cm、容量約 1 L) 、さらに 0. 05%ヒアルロン酸溶液（水 Zメタノ一ル= 1/1 (容量））に浸漬（第 3凝固浴：浴長 50 c m、容量約 15 Om l) した後、ローラー（第 1ローラー：速度 4. 4m/m i n、第 2ローラー： 4. 5m/m i n；延伸倍率 1. 02) にかけ、最後に巻取り口一ラーで巻き取った後、 0. 2% (重量/容量）の水酸化ナトリウム溶液（水/ メタノ一ル= 1/9 (容量））に約 15時間浸?貴後、水洗し、さらにメタノールに約 2時間浸漬後、そのまま乾燥、またはローラーから卷取り糸状にして乾燥させることによって、しなやかなキトサン一ヒアルロン酸ノヽイブリツド繊維（以下、「キトサン一ヒアルロン酸ハイブリッド条維（3) 」と呼ぶ）を得た。

第 3凝固浴中のヒアルロン酸濃度を 0. 1% (重量/容量）としたことを除いて、上記と同様な方法で調整、紡糸を行ない、しなやかなキトサン一ヒアルロン酸ハイプリッド繊锥（以下、「キトサン一ヒアル口ン酸ハイブリッド繊維

(4) 」と呼ぶ）を得た。比較例 3

^ m (b) の製造

第 3凝固浴中にヒアル口ン酸を添加しないことを除いて、実施例 2と同様な方法で紡糸を行ない、キトサン単独の繊維（以下、「キトサン繊維 (b) 」と呼ぶ）を得た。実施例 3

種々の後処理剤を用いるハイプリッド繊維の製造

実施例 2において後処理剤の 0. 2% (重量/容量）の水酸化ナトリウム溶液 (水/メタノール =1/9 (容量） ) の代わりに以下の化合物を後処理剤として用いたことを除けば実施例 2と同様にして（ヒアルロン酸濃度 0. 05%) キトサン一ヒアル口ン酸ハイブリッド酿锥を得た。後処理剤溶

炭酸カリウム 2% 水/メタノール =1/9 (容量）炭酸ナトリウム 2% ール =1/1 (容量）炭酸水素ナトリウム 1% ール =1 1 (容量）炭酸水素ナトリウム 3% 水/メタノール =3 2 (容量）リン酸 3カリウム 2% -ル =1/1 (容量）リン酸水素 2カリゥム 2% ール =1 1 (容量）リン酸 2水素ナトリウム 2% ール =1 1 (容量）硫酸 2% -ル =3/ 2 (容量）クェン酸 3%_ -ル = 1/9 (容量）実施例 4

種々の凝固剤を用いるハイプリッド繊維の製造

3. 5 (重量/容量）％のキトサン（君津化学工業社製、 B、分子量：約 60 0， 000) を 2%酢酸に溶解した溶液をカラムに詰め、濾布で加圧ろ過した。この濾液を紡糸用カラムに詰め、これを紡糸液として簡易紡糸装置を用い、以下のような方法によつて |¾锥を作製した。 50ホール（小孔： 0. 1 mm φ ) のノズルから、 0. 8 k g f Zcm²の加圧下で表 2に示す各種凝固液中（第 1凝固浴：浴長 100 c in 容量約 2 L) に上記紡糸液を押出し、次に水/メタノール = 1/1 (容量） ) に浸漬（第 2浴：浴長 50 cm、容量約 1 L) した。次に 0.

05 %ヒアル口ン酸溶液（水/メタノ一ル= 1 / 1 (容量） ) に浸漬（浴長 50 cm、容量約 1 5 Om l) した後、ローラー（第 1ローラー：速度 4. 4m/m

1 n、第 2ローラー： 4. 5m/m i n；延伸倍率 1. 02) にかけ、最後に卷取りローラーで卷き取った。その後、水に 10分間浸漬後もう一度水洗し、さらにメタノ一ルに約 2時間浸漬脱水後、乾燥させて «を得た。

表 2

凝固剤鐘溶讓成

水酸化ナトリウム 5% ール =lZl (容量）

炭酸カリウム 5% 水 Zメタノール = 1ノ1 (容量）

リン酸 3カリウム 5% 水/メタノール =iZi (容量）

硫酸ナトリウム 5% ール =2 1 (容量）実施例 5

キトサンとアルギン酸のハイプリッド繊維の製造

実施例 2において 0. 05%ヒアルロン酸に変えて、それぞれ 0. 0 5%および 0. 1%アルギン酸を用いた外は実施例 2と同様にしてキトサンとアルギン酸のハイプリッド繊锥を製造した。実施例 6

キトサンとヒァノレ口ン酸ハイプリッド繊維の引張強度試験

実施例 1及び 2で作製した各繊維の引張強度および伸度を測定した。破断時の荷重および伸び率の測定は J I S繊維規格 L 1015に従った。また、各繊維の断面積は顕微鏡下での画像処理により求めた。

繊維の破断力および伸度（伸び）の測定方法：

糸状の各 Ht (モノフィラメントが 50本束になったもの）を長さ約 4 Omm に切断し、両端をそれぞれ接着性のある紙（ここではポストイットを使用）で挟み、標点間距離を 20 mmにした各サンプルを作製した。このサンプ /レの両端をクリップ式つかみ具（製品番号 343— 06742— 03、島津製作所製）に固定し、上端側のつかみ具をロードセル（ 20 N、製品番号 346-51294- 07、島津製作所製）につるした後、卓上型精密万能試験機（AGS— H、製品番号 346— 51299— 02、島津製作所製）にセットした。引張速度 2 Om m/m i nで垂直方向に引張り、破断点での力おょぴ変位から破断力および伸度

(伸び）を測定し、これらのデータをパソコン（I BM、 Ne tV i s t a A 40) に取込んだ。測定およびデータの解析には専用のソフト（TRAPEZ I UM、島津製作所製）を使用した。

繊維断面積の測定方法：

糸状の各 Ht (モノフィラメントが 50本束になったもの）を長さ約 5mmに切断し、これらを直径約 1 mm φの小孔をあけたプラスチック板の穴に揷し固定した。このプラスチック板を光学顕微鏡（BX50、ォリンパス光学工業社製）の台座に乗せ、霧維断面の画像を C C Dカメラを含む力メラコント口一ルュニット（I CD— 740、池上通信機社製）を通して捕らえた後、画像処理装置 (VIDEO MICRO METERModel VM-30, ォリンパス光学工業社製、モニター画面： TM1150、池上通信機社製）によって断面積を測定した。

各繊維の強度及び伸度を表 3に示す。

表 3

キトサン—ヒアルロン酸ノヽイブリツド繊維 (!) および（₂) の強度および伸度 (平均値土標準誤差、 n=5)

キトサン戦虫 Htの強度は約 13 ON/mm²であったが、ヒアルロン酸とのハイプリッド化によって繊維強度は約 150〜22 ON/mm² まで上昇した。なお、コラーゲンファイバーにノルジヒドログアヤレチン酸を架橋した構造物 (フアイパー）での強度は約 50 N/mm ² である（Koob T. J., et al., J. Biomed. Mater. Res., 56, 40-48 (2001) ) ことから、本発明のキトサン一ヒアル口ン酸ハイブリッド繊維の強度はコラ一ゲン繊維に比べて 3〜 5倍程度の強度を有することが確認された。

表 4

キトサン一ヒアルロン酸ハイプリッド難（3)および (4)の強度および伸度 (平均値土標準誤差、 n = 5)

最大点破断力断面積 (μτη

伸度 (%) 瞧の種類 (N) ²) キトサン賺 15576.08 ±

2.86±0.03 183.60 ±1.65 2.54±0.16 (b) 332.20

キトサン-ヒアルロン酸ハイ

19165.34+

フ、、リツド瞧 4.17±0.08 2Γ7.60±3.93 5.89±0.26

133.35

(3)

キトサン-ヒアルロン酸ハイ

18031.82 ±

フ、、リツド讓 3.58±0.06 198.51±3.47 4.55±0.22

243.88

(4) 実施例 7 ^J キトサンとヒアルロン酸とのハイプリッド繊維の軟骨細胞の接着性

軟骨細胞が基材上で良好な増殖 ·分化を起こすためには、軟骨細胞が培養基材に出来るだけ多く接着することが必要である。このため、実施例 2で作製したキトサン単独条翁锥およびキトサン一ヒアル口ン酸ハイブリッド纖維への軟骨細胞の接着性を評価した。比較対象として市販の医療用吸収性縫合糸（生体吸収性合成高分子）：ポリダラクチン一 9 1 0 (Vicryl 3-0、 EtHconCo, NJ, USA) を用いた。

軟骨細胞は日本白色家兎（ 8週齢、体重 1 . 8〜 2 . O k g ) の膝関節部位から分離調整した。軟骨細胞の濃度は 2 X 1 0 ⁶ c e 1 1 s /m 1とし、細胞の接着性評価は西村の方法 (Nishimura, J. Biol. Macromol. 7, 100-104, 1985) に準じた。すなわち、各纖锥を 1 O mmの長さに切断し、テフロンチューブ（内径： 5 mm_N 長さ： 3 0 mm) に一定量（l O O m g ) ずつ密に詰めた後、このチューブの片端から軟骨細胞を含む試料液 1 0 0 /X 1を添加し、 3 7でで 1時間ィンキュベートした。その後、 P B S (リン酸緩衝食塩水） 1 m 1を流し、得られた流出液中の細胞数を力ゥントし、細胞流出率を算出した。表 5

各種繊維の軟骨細胞接着性の比較

*;p<0.0o VS vicryl

上記に示すように Vicrylと作製した生体高分子繊維との間には細胞接着性 ANOVAによる統計処理で有意な差が認められた実施例 8

キトサンとヒアル口ン酸ハイプリッド繊維の線維芽細胞接着性

線維芽細胞をうまく培養するためには、線維芽細胞が 3次元培養基材に出来るだけ多く接着することが必要である。実施例 1で作製したキトサン単独繊維およびキトサン一ヒアルロン酸ハイプリッド繊維への線維芽細胞の接着性を検討した。コントローノレとして市販の医療用吸収性縫合糸：ポリダラクチン一 9 1 0

(Vicryl, EthiconCo, NJ, USA) を用いた。

(試験方法）

線維芽細胞は滅菌下で日本白色家兎（ 8 ~ 1 0週齢、体重 1 . 8〜 2 . O k g ) の膝蓋腱から分離調製した。線維芽細胞の濃度は 1 X 1 0 ⁷ c e 1 1 s / m 1とし、細胞の接着性は西村の方法（Nishimura, J. Biol. Macromol. 7， 100- 104, 1985) に準じて評価した。つまり、各繊維を 5 mmの長さに切断し、テフロン（登録商標）チューブ（内径： 5 mm、長さ： 3 0 mm) に一定量詰めた。このチューブの片端から線維芽細胞を含む試料液 1 m 1を添加し、室温で 1 5分間ィンキュベートした後、 P B S (リン酸緩衝食塩液） 1 m 1を流し、得られた洗浄液中の細胞数をカウントし、繊維に接着していない細胞数とした。

表 6

各種繊維の線維芽細胞接着性の比較

上に示すように Vicrylと作製した生体高分子繊維との間には細胞接着性に分散分析法（ANOVA： analysis of variance) による統計処理で有意な差が認められた。キトサン単独繊維とキトサンーヒアル口ン酸ハイプリッド繊維との間にも有意差があり、線維芽細胞の接着性はハイプリッド繊維の方が良いことが認められた。実施例 9

培養液中での繊維の安定性

実施例 1〜4で製造した各キトサン Zヒアルロン酸ハイプリッド ¾锥、比較例

1で製造したキトサン/ヒアル口ン酸ハイブリッド繊維、比較例 2および 3で製造したキトサン単独繊維、各約 2 O m gずつを試験管に入れ、これに 1 0 % F B

S (ゥシ胎仔血清）を添加した DMEM (Dulbecco s Modified Eagles Medium, Sigma社製、コード D5796) 培養液 2 m lを加えて、室温で 2週間放置した。

このうち比較例 1のハイプリッド繊維の内、塩化カルシウムを凝固剤として用レヽ、後処理を行わなかった繊維では繊維の形状が不鮮明となり、培養液の色も黄色に変化した。他の繊維では、形状変化は全く見られず、培養液の色も元の赤色のままであった。実施例 1 0

キトサンとヒアノレロン酸とのハイプリッド長繊維からの 3次元培養基材の作製実施例 1の方法で紡糸後、水酸化ナトリウムおよびメタノ一ノレ処理した ¾n

(ローラーに卷いたまま）から 1 0 O m以上の長い繊锥（長編隹）を作製した。さらにこの長繊锥を撚糸した後、市販の編組機を用いて、帯状構造物を作製した。これを用いて一定形状を有する 3次元の培養基材を作製した。実施例

3次元基材を用いた軟骨細胞の培養

実施例 1 0の 3次元基材を用いて軟骨細胞の培養試験を実施した。

Kawasakiら、およひ Yasuiらの方法 (Kawasa ,K., et al., J. Cell Physiol., 179, 142-148 (1999)， Yasui, Ν·， et al" Exp. Cell Biol., 50, 92- 100 (1982)) に準じて軟骨細胞の採取おょぴ培養を行った。すなわち、日本白色家兎（8週齢、体重 1 . 8〜2 . O k g ) の膝関節部位から軟骨組織片を採取し、 0 . 2 5 %トリプシン溶液を添加して 3 7 °Cで 2 5分間処理した後、 0 . 2 5 %コラゲナーゼ (タイプ Π ) 溶液を添加し、 3 7でで 5時間程度処理を行い、細胞を単離した。この細胞浮遊液を 5 0 μ 1採取しトリパンブルー 5 0 μ Iを加えた後、良く攪拌した後、 2 0 μ 1を血球計算盤に乗せて細胞数をカウントし、全細胞数を算出した。予めオートクレープ滅菌しておいたキトサン一ヒアルロン酸ハイプリッド 3 次元基材をマルチウエルプレート（1 2ゥエル、 F a 1 c ο n社製）に入れ、繊維上に各ゥエル当り 5 X 1 0 ⁵個となるように軟骨細胞を含む溶液約 1 0 0 μ 1 を添加した。 5 % C Ο ₂存在下、 3 7 °Cの培養器で 1時間ィンキュベートした後、 DM E M培地 2 m 1を少量ずつ添加し、さらに 0 , 1 %ァスコルビン酸ホスフエート 2 0 μ 1を加えて、上記条件下で培養した。

図 1には培養 2 1日目の光学顕微鏡写真を示したが、播種した軟骨細胞は繊維上および »間の隙間で良好に増殖していることが確認された。また、図 2にはアルシアンブルー■サフラニン染色の結果を示したが、青色に強く染色された細胞外マトリックスが多数確認された。以上のこと力ゝら、この繊維上で軟骨細胞は順調に増殖 ·分化し、コンドロィチン硫酸等の細胞外マトリックスを盛んに産生していることが判る。また、図 3には、培養 1日目、 7 13目、 1 4日目おょぴ 2 1 目の 3次元基材当りのタンパク量および酸性ムコ多糖量の測定結果を示した 1 培養に伴って両者とも増加した。これらのことからも軟骨細胞は良好な増殖 -分化によって各種タンパクの合成およびコンドロイチン硫酸等の細胞外マトリックスを産生していることが判る。実施例 1 2

培養した 3次元基材の動物への移植における軟骨組織再生評価

麻酔下で日本白色家兎 ( 8週齢、体重 1 . 8〜 2 . O k g ) の膝関節部位に約 4 X 6 mm、深さ約 1 . 5 mmの欠損部を作製し、ここに予め 2週間ゥサギ軟骨細胞を培養した実施例 1 0の 3次元基材を移植し、基材の両側を生体吸収性の鏠合糸で軽く固定した。移植後 8週目に欠損部を開腹しサフラニン 0染色による組織観察を行った結果、培養基材を移植した欠損部位に赤く染色された軟骨基質が認められ、軟骨組織の再生が起こっていることを確認した。なお、基材の固着性も非常に良好であり、また、基材自体は次第に吸収されている様子が観察された（図 4) 。また、基材移植に伴う炎症細胞等の浸潤は殆ど見られなかったこと力ら、基材移植に伴う強い異物反応は起こっていないものと考えられる。実施例 1 3

3次元基材を用いた線維芽細胞の培養

Ma r t i nの方法 (Martin, G. M. , Tissue Culture, Metnods and

Applications, Academic Press, 39, 1973) に準じて線維芽細胞の採集および培養を行った。すなわち日本白色家兎（8〜1 0週齢、体重 1. 8〜2. O k g) の膝蓋腱から 2 mm角の小片を作製し、カバーグラスをかけて直径 35mmのシヤーレに固定した。これに 10%FB Sを添加した DMEMを加え、 5%C0₂ 存在下、 3 7 °Cの培養器で 2週間培養した。線維芽細胞がコンフルェン卜な状態になったところで培地を除き、 PBS (—）で洗浄した。 0. 25%トリプシン 0. 5m 1を加えて 37°Cで 1 5分間インキュベート後、培地 lmlを添加し、細胞を回収した。この細胞懸濁液 50 / 1に 0. 04 %トリパンブルー 50 μ I を加え血球計算盤で細胞数を力ゥントした。予めォートクレープ滅菌しておいたキトサンとヒアルロン酸とのハイプリッド繊維から成る実施例 10の 3次元基材を 1 2穴のプレートに置き、繊維上に各プレート当り 1 X 1 0⁶個となるように線維芽細胞を含む溶液約 1 00 μ 1を添加した。 5 %C0₂存在下、 3 7 °Cの培養器で 1時間ィンキュベートした後、 DMEM培地約 2m 1を添加し上記条件下で培養した。培養後 1日目、 7日目、 14日目おょぴ 28日目に、細胞数の指標である DN A量を測定した。

測定は、 R a g oらの方法 (Rago, R.， et al. , Anal. Biochem. , 191， 31—34 (1990)) に準じて行った。即ち、 0. 05Mのリン酸緩衝液 (pH7. 4) に塩化ナトリゥムを添加して 2M溶液とした。培養した線維芽細胞を基材ごと取り出し、 P B Sで培地を洗い流した。ハサミを用いて基材を細かく刻んだ後 1. 5 m L容量のチューブに移し、 0. 05Mリン酸緩衝液（2M 塩化ナトリウムを含む、 pH7. 4) を lmL添加してよく撹拌し、室温で 1分間放置した。この溶液を再度よく撹拌した後、その上清部分を試料溶液とした。試料溶液 100 _μ L に 0. 05Μリン酸緩衝液（2Μ 塩化ナトリウムを含む、 ρΗ7. 4) 2mL を加え、さらに蛍光試薬 (Ho e c h s t 33258、 0. 02%溶液を精製水により調製）を 10μ L添加して十分撹拌した後、分光蛍光光度計（RT— 5 300 PC、島津製作所社製）を用いて蛍光強度（励起波長 356 nm、吸収波長 458 nm) を測定した。標品の DNAを用いて 0〜 125 g/mLの範囲で検量線を作成した後、この検量線から各試料溶液中に含まれる D N A濃度を求めた。図 5に示したように、培養に伴って DNA量は増加し、 3次元基材上で線維芽細胞が良好に増殖することを確認した。

また、図 6には抗マウス抗体を用いた streptavidin-biotin法による I型コラ一ゲンの免疫組織染色の結果（ 3次元基材で 28日間培養したもの）を示したが、細胞外基質が染色されており、このハイプリッド繊锥から作製した 3次元基材は靭帯および腱組織の細胞外マトリックスであるタイプ Iコラ一ゲンの産生にも優れていることを確認した。図 7には、この 3次元基材を用いて 283間培養した場合の走査型電子顕微鏡像を示した。資料の作製方法は以下のとおりである。 0. 1Mのリン酸緩衝液 (pH7. 2) を調製した。このリン酸緩衝液 200m Lにショ糖 6. 85 gを添加し、 0. 1Mショ 11^·有 0. 1Mリン酸緩衝液を作製した。また同様にして、 0. 2Mショ 11^·有 0. 2Mリン酸緩衝液 (pH7.

2) を作製した。さらに、 0. 2]^[ショ||^有0. 2Mリン酸緩衝液を用いて

2 %ォスミゥム酸溶液を 2倍に希釈した 1 %ォスミゥム酸溶液を調製した。

28日間培養した基材を 0. 1 Mショ糖加 0. IM ン酸緩衝液中に浸漬し、

37でで 10分間放置した。この操作を 3回繰り返した後、 2 %グルタルアルデヒド溶液（ 0. IM ン酸緩衝液で調製）中に浸漬し、 37 °Cで 1時間放置して前固定処理を行った。この細胞を含む基材を 0.

糖加0. 1Mリン酸緩衝液中に浸漬し、 37でで 10分間放置して洗浄した。この操作を 3回繰り返した後、室温で 1 %ォスミゥム酸溶液に 1時間浸漬して後固定処理を行つた。さらに導電染色を行うために、 0. 1Mリン酸緩衝液を用いて洗浄した後、室温で 2 %タンニン酸水溶液に 2時間浸漬し、続いて 0. IM ン酸緩衝液中に 2時間浸漬した。その後、 2 %ォスミゥム酸溶液（ショ糖を 0. 34gZl0mL添加) 中に 2時間浸潰し、再び 0. 1Mリン酸緩衝液中に 2時間浸漬した。

この基材を 20 %エタノールから順次 10 %間隔で濃度を上げたエタノ一/レ溶液 ( 20〜 99. 5%) に 10分間ずつ浸け、最後に無水エタノ一ノレに 30分間、 2回浸漬して脱水した。その後、酢酸ィソァミル中に 30分間 2回浸漬を繰り返して、エタノールから酢酸イソァミルへの置換を行った。液化 CO 2を移行液として用いて臨界点乾燥処理（31°C、 72. 8気圧）を行った試料にイオン'スパッタ装置（E—102、日立製作所社製）を用いて白金一パラジウム蒸着処理を行った後、走査型電子顕微鏡（S—2300型、日立製作所社製）を用いて 3 次元基材での線維芽細胞の増殖'分化の状況を観察した。その結果、線維芽細胞は 3次元基材の表面で増殖■分化し、その周辺にはコラーゲンと思われる多数の糸状物質が観察された（図 7) 。

Claims

請求の範囲

1 . 繊維内部がキトサンまたはその塩よりなり、繊維表面がキトサンと生体吸収性の酸性生体高分子との複合体で被覆されているキトサン Z酸性生体高分子ハイブリツド¾；維であって、 1 0 % F B S (ゥシ胎仔血清）を添加した DMEM

(Dulbecco's Modified Eagles Medium) 培地中に、室温で 2週間置いても形態を保持する繊維。

2 . 酸性生体高分子がヒアルロン酸、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、へパリン、へパラン硫酸、ケラタン硫酸おょぴポリグルタミン酸よりなる群から選択される請求の範囲第 1項に記載のハイプリッド繊維。

3 . 以下の工程：

2 ) キトサンの塩の水溶液を、アルカリ土類金属の塩を凝固剤として用いて湿式紡糸して繊維を形成させる；

4 ) 場合によりハイブリッド繊維を延伸する；、

5 ) ハイブリッド繊維を塩基、 2塩基酸以上の無機酸もしくはその塩、または 3酸塩基以上の有機酸もしくはその塩の水溶液で処理する；

ことを含む請求の範囲第 1項に記載の繊維の製造方法。

4. 以下の工程：

2 ) キトサンの塩の水溶液を、塩基、 2塩基酸以上の無機酸もしくはその塩、または 3酸塩基以上の有機酸もしくはその塩を凝固剤として用いて湿式紡糸して繊維を形成させる；

3 ) その繊維を生体吸収性の酸性生体高分子の溶液に浸漬して、繊維表面でキトサンと酸性生体高分子を反応させてキトサン/酸性生体高分子ハイプリッド繊維を形成させる； 4) 場合によりハイプリッド繊維を延伸する；

ことを含む請求の範囲第 1項に記載の繊維の方法。

5. 請求の範囲第 1項に記載の繊維よりなる動物細胞培養用 3次元基材。

6. 動物細胞が軟骨細胞である請求の範囲第 5項に記載の 3次元基材。

7. 動物細胞が線維芽細胞である請求の範囲第 5項に記載の 3次元基材。

8. 動物細胞が未分化細胞である請求の範囲第 5項に記載の 3次元基材。

9. 請求の範囲第 6項に記載の 3次元基材を用いて、軟骨細胞を生体外で培養することを含む軟骨細胞の培養方法。

10. 培養時に成長因子を添加する請求の範囲第 9項に記載の培養方法。

11. 培養を 1 ~ 15 %の低酸素条件下で行うこと、および Zまたは 0. 1 ~ 2 OMP aの圧負荷下で行うことを含む請求の範囲第 9または 10項に記載の培養方法。

12. 請求の範囲第 7項に記載の 3次元基材を用いて、線維芽細胞を生体外で培養することを含む線維芽細胞の培養方法。

13. 培養時に成長因子を添加する請求の範囲第 12項に記載の培養方法。

14. 培養を 0. 01〜5 OmmZcmの引張り刺激を加えながら行う請求の範囲第 12または 13項に記載の培養方法。

15. 請求の範囲第 8項に記載の 3次元基材を用いて、未分化細胞を生体外で培養することを含む動物細胞の培養方法。