CN114481363A - 使用蘑菇壳聚糖纤维支架生产细胞培养肉的方法 - Google Patents

使用蘑菇壳聚糖纤维支架生产细胞培养肉的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了使用蘑菇壳聚糖纤维支架生产细胞培养肉的方法，包括将蘑菇壳聚糖配制成纺丝液并纺丝，纺丝通过固定液固定，之后后处理得到蘑菇壳聚糖纤维支架，之后将细胞接种于灭菌后的蘑菇壳聚糖纤维支架上，培养得到细胞培养肉。本发明一些实例的方法，制备得到的蘑菇壳聚糖纤维支架具有良好的生物相容性，多种细胞均可有效附着，利于生产细胞培养肉；所使用的材料全部可食用，具有良好的安全性；所使用的材料全部为非动物源材料，可以摆脱对传统动物饲养的依赖。

Description

使用蘑菇壳聚糖纤维支架生产细胞培养肉的方法
技术领域
本发明涉及生物领域，具体涉及使用蘑菇壳聚糖纤维支架生产细胞培养肉的方法。
背景技术
肉是人们日常生活中很重要的蛋白质来源之一，目前肉主要来源于传统畜牧业，但是随着人口增长，现有的耕地面积很难满足人类肉类需求，如据预测2050年，全球人口将攀升至97亿，到时候将面临巨大的肉类需求缺口。
大规模的传统畜牧业与一系列公共卫生问题有关，主要是由于动物农业中人畜密切接触的增加、野生动物栖息地的破坏、人口增长和全球流动性，75%的人类新传染病来自动物源（动物传染病）。集约化畜牧业需要使用大量抗生素，大约80%美国销售的抗生素和73%全球销售的抗生素用于牲畜，这在抗生素耐药性方面也发挥着重要作用。随着人口的进一步增加，对肉类的需求量也越来越大，传统的畜牧业、渔业将难以满足人们对肉类的需求。
细胞肉是利用组织工程技术，通过体外培养细胞控制其快速增殖、定向分化并收集加工而成的一种新型肉类食品。与动物肉相比，细胞肉能节约99％的土地和96％的水。另外，因此发展细胞肉，是解决未来人类蛋白质短缺问题的一个重要手段。
在细胞肉的培养过程中，支架扮演重要的作用，它为细胞提供了黏附、增殖和分化的空间，是细胞获取营养物质、气体交换、排泄废物和生长代谢的主要场所，有利于细胞外基质的形成。在细胞肉中，支架除了满足良好的生物相容性、易加工成型、适宜的结构等基本要求外，作为一种食品，其还应满足食品材料要求。在各种支架类型中，纤维支架作为重要的做成部分，其可以模拟细胞外基质，诱导细胞沿着纤维方向定向生长，这有利于后期细胞分化产生肌纤维，使其接近动物肉。同时，其本身也可以通过模拟动物肌纤维组织，使其具有动物肉纤维口感。因此开发纤维支架对细胞肉具有重要意义。
目前虽然有一些研究将纤维支架应用于细胞培养中，但是其仍存在一些缺点，如目前在静电纺丝制备纤维支架过程中使用一些有机溶剂如氯仿、六氟异丙醇以及一些纺丝助料等，如专利[US20200245658A1]中添加PEO和PCL帮助其更好纺丝，而这些物质不允许在食品中使用。同时，纤维支架配方中常使用胶原、明胶等动物来源成分，如报道专利[CN113215670A]中使用明胶材料，这造成支架制备仍很难摆脱对饲养动物的依赖。
壳聚糖是一种常用的纤维支架材料，一般从甲壳动物的壳中提取得到，其细胞相容性较差，细胞难以有效附着在壳聚糖纤维支架上生长。一般需要对壳聚糖纤维支架进行相容性改性，这导致其成本增加。
蘑菇壳聚糖是一种从蘑菇中提取的天然多糖物质，相比于传统虾蟹壳来源壳聚糖，其完全是植物来源，可摆脱对饲养动物的依赖。然而蘑菇壳聚糖的研究相对较少。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供使用蘑菇壳聚糖纤维支架生产细胞培养肉的方法。
本发明所采取的技术方案是：
使用蘑菇壳聚糖纤维支架生产细胞培养肉的方法，包括如下步骤：
将蘑菇壳聚糖配制成纺丝液，所述纺丝液中，蘑菇壳聚糖的含量为为1～30 w/v%、植物蛋白0～50wt.%、食用胶0～50wt.%，溶剂为0.5～90v/v的醋酸溶液；
将可食用的碱和/或强碱弱酸盐配制固定液；
纺丝制备得到蘑菇壳聚糖纤维支架；
将细胞接种于灭菌后的蘑菇壳聚糖纤维支架上，培养得到细胞培养肉。
在一些方法的实例中，所述植物蛋白包括但不限于大米蛋白、土豆蛋白、谷朊蛋白、豌豆蛋白中的至少一种。
在一些方法的实例中，所述食用胶包括但不限于魔芋胶、卡拉胶、可得然胶中的至少一种。
在一些方法的实例中，所述可食用的碱包括但不限于NaOH。
在一些方法的实例中，所述强碱弱酸盐包括但不限于碳酸钠、碳酸钾中的至少一种。
在一些方法的实例中，所述纺丝为静电纺丝或湿法纺丝。
在一些方法的实例中，所述静电纺丝的参数为：电压5～40 kV，注射速度0.1～5ml/min、纺丝距离5～30 cm。
在一些方法的实例中，静电纺丝结束后将材料直接浸入固定液进行固定，之后清洗、干燥、热处理得到纤维支架。
在一些方法的实例中，所述湿法纺丝将纺丝液体挤出到碱性溶液并进行拉伸制得。
在一些方法的实例中，湿法纺丝拉伸得到的纤维经清洗、干燥、热处理得到纤维支架。
在一些方法的实例中，所述干燥的方式包括但不限于烘干、风干或冻干。
在一些方法的实例中，所述热处理的温度为50～200℃。
在一些方法的实例中，所述纺丝液中，蘑菇壳聚糖的含量为为1～10 w/v%、植物蛋白0～20wt.%、食用胶0～10wt.%，溶剂为1～10v/v的醋酸溶液。
在一些方法的实例中，所述固定液为1～10 wt.%的NaOH溶液。
在一些方法的实例中，所述蘑菇壳聚糖的规格为10～1000 cps。
在一些方法的实例中，所述细胞包括但不限于多个肌细胞、多个成纤维细胞、多个成脂细胞、多个肝细胞、多个造血干细胞、多个肝造血干细胞、多个骨髓干细胞、多个脂肪的成纤维细胞、多个脂肪干细胞、多个间质干细胞、多个骨髓基质细胞、多个肌肉侧群细胞、多个血液来源的间质前体细胞、多个肌肉前体细胞、多个循环的骨骼干细胞、多个多潜能成体祖细胞、多个中胚层祖细胞、多个脊髓祖细胞多个混合及其任何组合所组成的一群组的多个培养肉细胞的至少一种。
本发明的有益效果是：
本发明一些实例的方法，制备得到的蘑菇壳聚糖纤维支架具有良好的生物相容性，多种细胞均可有效附着，利于生产细胞培养肉。
本发明一些实例的方法，所使用的材料全部可食用，具有良好的安全性。
本发明一些实例的方法，所使用的材料全部为非动物源材料，可以摆脱对传统动物饲养的依赖。
附图说明
图1是实施例1制备蘑菇壳聚糖纤维形貌图；
图2是小鼠成肌细胞在实施例1制备蘑菇壳聚糖纤维支架上生长形貌；
图3是实施例2制备蘑菇壳聚糖（600cps）纤维形貌图；
图4是实施例3制备蘑菇壳聚糖（800cps）纤维形貌图和鸡成纤维细胞在支架上生长形貌图；
图5是实施例4制备蘑菇壳聚糖/谷朊蛋白复合纤维形貌图和小鼠成肌细胞在纤维支架上生长形貌图；
图6是实施例5制备蘑菇壳聚糖/土豆蛋白复合纤维形貌图；
图7是实施例6制备蘑菇壳聚糖/魔芋胶复合纤维形貌图。
具体实施方式
使用蘑菇壳聚糖纤维支架生产细胞培养肉的方法，包括如下步骤：
将蘑菇壳聚糖配制成纺丝液，所述纺丝液中，蘑菇壳聚糖的含量为为1～30 w/v%、植物蛋白0～50wt.%、食用胶0～50wt.%，溶剂为0.5～90v/v的醋酸溶液；
将可食用的碱和/或强碱弱酸盐配制固定液；
纺丝制备得到蘑菇壳聚糖纤维支架；
将细胞接种于灭菌后的蘑菇壳聚糖纤维支架上，培养得到细胞培养肉。
植物蛋白可以进一步调节口感，改善细胞相容性等，可以根据需要增加一定的植物蛋白。在一些方法的实例中，所述植物蛋白包括但不限于大米蛋白、土豆蛋白、谷朊蛋白中的至少一种。
食用胶可以改善纤维的力学性能、口感等，可以根据需要进行在一些方法的实例中，所述食用胶包括但不限于魔芋胶、卡拉胶、可得然胶中的至少一种。
固定液可以使用成熟的固定液。在一些方法的实例中，所述可食用的碱包括但不限于NaOH。
在一些方法的实例中，所述强碱弱酸盐包括但不限于碳酸钠、碳酸钾中的至少一种。
使用可食用碱或强碱弱酸盐更有利于减少后续处理的难度。
在一些方法的实例中，所述纺丝为静电纺丝或湿法纺丝。
在一些方法的实例中，所述静电纺丝的参数为：电压5～40 kV，注射速度0.1～5ml/min、纺丝距离5～30 cm。这样可以得到更为适合细胞培养的纤维。
在一些方法的实例中，静电纺丝结束后将材料直接浸入固定液进行固定，之后清洗、干燥、热处理得到纤维支架。
在一些方法的实例中，所述湿法纺丝将纺丝液体挤出到碱性溶液并进行拉伸制得。
在一些方法的实例中，湿法纺丝拉伸得到的纤维经清洗、干燥、热处理得到纤维支架。
纺丝得到的纤维可以按现有方法干燥，以去除其中至少部分水分，以利于后续加工。在一些方法的实例中，所述干燥的方式包括但不限于烘干、风干或冻干。
热处理的温度可以根据材料、需要的外观进行相应的调整。在一些方法的实例中，热处理的温度为50～200℃。
在一些方法的实例中，所述纺丝液中，蘑菇壳聚糖的含量为为1～10 w/v%、植物蛋白0～20wt.%、食用胶0～10wt.%，溶剂为1～10v/v的醋酸溶液。
在一些方法的实例中，所述固定液为1～10 wt.%的NaOH溶液。其固化效果好，配置简单。
在一些方法的实例中，所述蘑菇壳聚糖的规格为10～1000 cps。
在一些方法的实例中，所述细胞包括但不限于多个肌细胞、多个成纤维细胞、多个成脂细胞、多个肝细胞、多个造血干细胞、多个肝造血干细胞、多个骨髓干细胞、多个脂肪的成纤维细胞、多个脂肪干细胞、多个间质干细胞、多个骨髓基质细胞、多个肌肉侧群细胞、多个血液来源的间质前体细胞、多个肌肉前体细胞、多个循环的骨骼干细胞、多个多潜能成体祖细胞、多个中胚层祖细胞、多个脊髓祖细胞多个混合及其任何组合所组成的一群组的多个培养肉细胞的至少一种。
下面结合实例，进一步说明本发明的技术方案。
实施例1：
一种蘑菇壳聚糖纤维的制备，其是通过将200cps规格壳聚糖溶解于2% （v/v）醋酸溶液，得到4%（w/v）壳聚糖溶液，将其以NaOH（5%（w/v））溶液为凝固液通过湿法纺丝制的，并通过清洗得到纤维材料。进一步，可以通过将材料冷冻干燥，并在120℃条件下进行高温高压灭菌，得到无菌纤维支架，进行细胞培养。
图1是实施例1制备蘑菇壳聚糖纤维形貌图，可以看出纤维呈现连续性，纤维直径大小在200μm左右；
图2是小鼠成肌细胞在实施例1制备蘑菇壳聚糖纤维支架上生长形貌，可以看出细胞在支架上正常黏附，呈现铺展状体，同时随着培养时间延长，细胞数量不断增加，说明制备纤维生物相容性良好。
实施例2：
一种蘑菇壳聚糖纤维的制备，其是通过将600cps规格壳聚糖溶解于2% （v/v）醋酸溶液，得到3%（w/v）壳聚糖溶液，将其以NaOH（5%（w/v））溶液为凝固液通过湿法纺丝制的，并通过清洗得到纤维材料。进一步，可以通过将材料冷冻干燥，并在120℃条件下进行高温高压加热，得到无菌纤维支架，图3为纤维形貌，可以看出纤维呈现连续杆状形态，纤维大小在150μm左右，说明纤维纺丝性能良好。
实施例3：
一种蘑菇壳聚糖纤维的制备，其是通过将800cps规格壳聚糖溶解于4% （v/v）醋酸溶液，得到2%（w/v）壳聚糖溶液，将其以NaOH（5%（w/v））溶液为凝固液通过湿法纺丝制的，并通过清洗得到纤维材料。进一步，可以通过将材料冷冻干燥，并在120℃条件下进行高温高压加热，得到无菌纤维支架，进一步，在材料上接种细胞数量为2*10^5鸡成纤维细胞，将其放置于二氧化碳培养箱中静态条件下进行培养1d，取出材料使用磷酸缓冲液清洗3次，加入二乙酸荧光素（5μg/mL）避光染色5min，使用磷酸缓冲液清洗3次，在荧光倒置显微镜下拍照得到细胞在实施例3制备蘑菇壳聚糖纤维。
图4a是实施例3制备蘑菇壳聚糖（800cps）纤维形貌图，从图中看出纤维呈现长条形形貌，纤维大小在200μm左右。图4b是鸡成纤维细胞在实施例3制备蘑菇壳聚糖纤维支架上生长形貌图，可以看出，细胞在纤维支架上正常黏附，细胞呈现铺展状态，说明制备纤维支架生物相容性良好。
实施例4：
一种蘑菇壳聚糖纤维的制备，其是通过将谷朊蛋白溶解于2% （v/v）醋酸溶液中，得到5%（w/v）谷朊蛋白溶液，进一步将壳聚糖（600cps）溶解于其中得到3%（w/v）壳聚糖溶液，将其以NaOH（5%（w/v））溶液为凝固液通过湿法纺丝制的，并通过清洗得到纤维材料，进一步，可以将材料清洗，并使用100℃蒸汽加热得到交联纤维支架，并进一步，也可以通过将材料冷冻干燥，并在120℃条件下进行高温高压加热，得到交联纤维支架。进一步，在材料上接种细胞数量为2*10^5小鼠成肌细胞，将其放置于二氧化碳培养箱中静态条件下进行培养1d，取出材料使用磷酸缓冲液清洗3次，加入二乙酸荧光素（5μg/mL）避光染色5min，使用磷酸缓冲液清洗3次，在荧光倒置显微镜下拍照得到细胞在实施例3制备蘑菇壳聚糖纤维。
图5是实施例4制备蘑菇壳聚糖/谷朊蛋白复合纤维形貌图，可以看出图中看出纤维呈现长条形形貌，纤维大小在200μm左右。图5b是小鼠成肌细胞在实施例4制备蘑菇壳聚糖/谷朊蛋白复合纤维支架上生长形貌图，可以看出，细胞在纤维支架上正常黏附，细胞基本都已经呈现铺展状态，说明制备纤维支架生物相容性良好。
实施例5：
一种蘑菇壳聚糖纤维的制备，其是通过将土豆蛋白溶解于2% （v/v）醋酸溶液中，得到30%（w/v）大米蛋白溶液，进一步将壳聚糖（600cps）溶解于其中得到3%（w/v）壳聚糖溶液，将其以NaOH（5%（w/v））溶液为凝固液通过湿法纺丝制的，并通过清洗得到纤维材料，进一步，可以将材料清洗，并使用100℃蒸汽加热得到交联纤维支架，并进一步，也可以通过将材料冷冻干燥，并在120℃条件下进行高温高压加热，得到交联纤维支架。
图6是实施例5制备蘑菇壳聚糖/土豆蛋白复合纤维形貌图，纤维呈现连续状，纤维比较均匀，纤维直径在250μm左右，说明复合纤维具有良好纺丝性能；
实施例6：
一种蘑菇壳聚糖纤维的制备，其是通过将600cps壳聚糖溶解于4% （v/v）醋酸溶液中，得到3%（w/v）相应溶液，进一步将魔芋胶溶解于其中，质量分数为1%（w/v），将其以NaOH（5%（w/v））溶液为凝固液通过湿法纺丝制的，并通过清洗得到纤维材料，进一步，可以将材料清洗，并使用100℃蒸汽加热得到交联纤维支架，并进一步，也可以通过将材料冷冻干燥，并在120℃条件下进行高温高压加热，得到交联纤维支架。
图7是实施例6制备蘑菇壳聚糖/魔芋胶复合纤维形貌图，可以看出纤维呈现连续状，纤维比较均匀，纤维直径在200μm左右，说明复合纤维具有良好纺丝性能。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.使用蘑菇壳聚糖纤维支架生产细胞培养肉的方法，包括如下步骤：
将蘑菇壳聚糖配制成纺丝液，所述纺丝液中，蘑菇壳聚糖的含量为为1～30 w/v%、植物蛋白0～50wt.%、食用胶0～50wt.%，溶剂为0.5～90v/v的醋酸溶液；
将可食用的碱和/或强碱弱酸盐配制固定液；
纺丝制备得到蘑菇壳聚糖纤维支架；
将细胞接种于灭菌后的蘑菇壳聚糖纤维支架上，培养得到细胞培养肉。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述植物蛋白包括但不限于大米蛋白、土豆蛋白、谷朊蛋白、豌豆蛋白中的至少一种；和/或
所述食用胶包括但不限于魔芋胶、卡拉胶、可得然胶中的至少一种；和/或
所述可食用的碱包括但不限于NaOH；所述强碱弱酸盐包括但不限于碳酸钠、碳酸钾中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述纺丝为静电纺丝或湿法纺丝。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述静电纺丝的参数为：电压5～40 kV，注射速度0.1～5 ml/min、纺丝距离5～30 cm；
所述湿法纺丝将纺丝液体挤出到碱性溶液并进行拉伸制得。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：静电纺丝结束后将材料直接浸入固定液进行固定，之后清洗、干燥、热处理得到纤维支架；或
静电纺丝结束后，去除材料中至少部分水分，然后入固定液进行固定，固定完成后清洗、干燥、热处理得到纤维支架；或
湿法纺丝拉伸得到的纤维经清洗、干燥、热处理得到纤维支架。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述干燥的方式选自烘干、风干或冻干；和/或
所述热处理的温度为50～200℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述纺丝液中，蘑菇壳聚糖的含量为为1～10 w/v%、植物蛋白0～20wt.%、食用胶0～10wt.%，溶剂为1～10v/v的醋酸溶液。
8.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于：所述固定液为1～10 wt.%的NaOH溶液。
9.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于：所述蘑菇壳聚糖的规格为10～1000cps。
10.根据权利要求1～4、7任一项所述的方法，其特征在于：所述细胞包括但不限于多个肌细胞、多个成纤维细胞、多个成脂细胞、多个肝细胞、多个造血干细胞、多个肝造血干细胞、多个骨髓干细胞、多个脂肪的成纤维细胞、多个脂肪干细胞、多个间质干细胞、多个骨髓基质细胞、多个肌肉侧群细胞、多个血液来源的间质前体细胞、多个肌肉前体细胞、多个循环的骨骼干细胞、多个多潜能成体祖细胞、多个中胚层祖细胞、多个脊髓祖细胞多个混合及其任何组合所组成的一群组的多个培养肉细胞的至少一种。
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