CN104548203B - 一种富含胶原蛋白人工神经支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种富含胶原蛋白人工神经支架的制备方法，包括支架膜料以及支架膜料包裹的可降解金属丝，所述支架膜料含有胶原蛋白，神经生长因子和聚乳酸‑聚羟基乙酸共聚物(PLGA)。该方法制备的人工神经支架力学性能良好，生物可降解，具有神经再生所需要的三维结构，还可以对NGF缓慢释放，对神经修复具有深远的意义。

Description

一种富含胶原蛋白人工神经支架的制备方法
技术领域
本发明涉及神经修复技术领域，具体地，涉及一种富含胶原蛋白人工神经支架的制备方法。
背景技术
由于各种外伤原因导致的周围神经损伤或断裂造成伤者感觉和运动功能的下降或丧失。严重的外周神经损伤往往导致患者瘫痪或永久丧失劳动力。外周神经损伤在我国发病率较高，据统计，在外伤患者中，四肢神经伤约占外伤总数的10％，火器伤骨折中约有60％的合并神经伤。为此，需寻找理想的外周神经伤治疗手段。对于外周神经断裂类损伤，若断裂缺口较大，就须借助对缺口进行桥接移植手术才能使断裂的周围神经得到再生修复。
目前，常用的移植体有自体移植体和人工神经支架。自体移植体来源有限且会带来供体后遗症。人工神经支架方面，由于非降解导管材料可能导致神经压迫和二次手术的风险，近年来研究的主要趋向于生物可降解支架材料的开发和研究。当前，美国已经批准多种品牌，如，NeuraGen、SaluBridge,Neurolac等的神经导管用于临床。然而，我国在神经支架方面的研究较为落后，并没有开发出具有自主知识产权的神经导管。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种富含胶原蛋白人工神经支架的制备方法，该方法制备的人工神经支架力学性能良好，生物可降解，具有神经再生所需要的三维结构和NGF，对神经修复具有深远的意义。
本发明的技术方案如下：一种富含胶原蛋白的人工神经支架，包括支架膜料以及支架膜料包裹的可降解金属丝，所述支架膜料的主要成分为胶原蛋白，神经生长因子(NGF)和聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)。
所述聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物和所述胶原蛋白的质量比为8-7：2-3。
所述NGF与明胶制成NGF明胶微球分布与所述支架膜料中，所述NGF明胶微球的质量含量为PLGA粉末和胶原蛋白粉末总质量含量的20-40％。
所述可降解金属丝的主要成分为镁，锌，钙，铁或其合金。
所述支架为片状，长条状或圆柱状。
所述可降解金属丝沿所述支架横向和纵向分布。
所述富含胶原蛋白的人工神经支架的制备方法，包括如下步骤：
1)胶原蛋白粉末的制备：动物皮去除皮下脂肪组织后，洗净，切碎，在碱性溶液中脱脂18-36h；用清水漂洗三次，每次18-24h；于0.5％的胰蛋白酶中在37℃振荡浸泡18-30h；在10mMTrisHCl(pH8.0)+2％TritonX-100中在37℃振荡浸泡48-72h；室温下用清水清洗2d；取出用灭菌的PBS浸泡，冷冻干燥后经机械粉碎，过400目分子筛，得到胶原蛋白粉末；所述胶原蛋白粉末的主要成分为胶原蛋白，还含有纤维连接蛋白和层粘连蛋白；
2)NGF明胶微球的制备：在20％的明胶水溶液中加入NGF,所述NGF浓度为0.06-0.10μg/ml,将混合溶液加入要其体积3.5倍的色拉油中，预热到37℃以10000rpm搅拌10min乳化形成油水乳液，冷冻至-20℃，取出乳液放入冷冻离心机中以2000rpm离心10min,取沉淀物，用丙酮洗涤3-5次，洗涤后的沉淀物即为NGF明胶微球；
3)制备支架膜料：按质量比例8-7：2-3称量PLGA粉末和步骤1)所得胶原蛋白粉末，将PLGA粉末完全溶解在二氯甲烷中，加入胶原蛋白粉末和步骤2)所得NGF明胶微球，超声分散均匀，得到支架膜料；
4)将步骤3)所得支架膜料转入制膜模具的模具腔中，模具腔中沿支架膜料成型方向横向和纵向放置拉直的可降解金属丝，使可降解金属丝浸入支架膜料中，溶剂自然挥发干燥，抽真空48h,此时，干燥的支架膜料包裹所述可降解金属丝，得到所述人工神经支架。
所述NGF明胶微球的粒经为1-20μm，微球对NGF的封载率为81.5％。
所述NGF明胶微球的用量为PLGA粉末和胶原蛋白粉末总量的20-40％。
动物皮被处理后，脱出了细胞，形成了结构松散的ECM，其主要成分是胶原蛋白，还含有纤维连接蛋白，层粘连接蛋白，氨基葡聚糖，蛋白聚糖等，这些有利于神经传导以及轴突的生长，具有良好的生物相容性。将ECM单独用于神经损伤移植，会由于ECM太软，难以为神经生长提供形态学上的支撑，同时，短时间内，这些ECM就会被钙化。因此，将胶原蛋白与PLGA结合使用使得制成的支架具有一定的力学性能，能够为神经生长提供形态学上的支撑，也防止胶原蛋白钙化。另外，扫描电子纤维镜表明，所得人工神经支架的内部结构为蜂窝状，为神经细胞的爬行和生长提供了空间。
可降解金属及其合金可以引导神经细胞生长，从而有利于神经细胞的修复。
NGF是生物活性物质，在周围神经修复的过程中，神经组织会分泌NGF，添加外源的NGF有利于神经的修复。本发明中，使用明胶制备NGF明胶微球，由于明胶是水溶性物质，在有机溶剂中不溶解，在材料的制备中明胶可将NGF与有机溶剂隔离，从而有利于保持NGF活性。明胶还有助于所述NGF的缓慢释放。
PLGA的降解所产生的酸性物质会造成局部集酸现象，影响组合的稳定性。因此，可以通过添加弱碱性添加剂改善这一情况。较佳地，步骤3)中还添加有所述弱碱性添加剂。所述弱碱性添加剂为碱性氨基酸，壳聚糖，海藻酸钠或碳酸氢钠，其添加量应保证所述PLGA的降解环境pH值为7.28-6.62。
本发明的有益效果为：本发明所述富含胶原蛋白的人工神经支架力学性能良好，生物可降解，具有神经再生所需要的三维结构和NGF，对神经修复具有深远的意义。
附图说明：
图1为本发明所述富含胶原蛋白的人工神经支架的结构示意图。
图2为本发明中猪皮经脱细胞处理后形成的疏松多孔的三维结构。
图3为显微镜下本发明中所得NGF明胶微球的形态
图4为用扫描电镜观测所得人工神经支架的横断面。
具体实施方式
下面结合附图和优选实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
参照图1，一种富含胶原蛋白的人工神经支架，包括支架膜料1以及支架膜料1包裹的可降解金属丝2。所述支架可以根据使用需要制备成各种形状，一般为片状，长条状或圆柱状。图1所示为圆柱状。所述可降解金属丝2沿所述支架横向和纵向分布。
所述支架膜料1含有胶原蛋白，神经生长因子和聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)；所述聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物和所述胶原蛋白的质量比为8-7：2-3；所述NGF明胶微球的质量含量为PLGA粉末和胶原蛋白粉末总质量含量的20-40％。
所述可降解金属丝2的主要成分为镁，锌，钙，铁或其合金。
实施例1：
一种富含胶原蛋白的人工神经支架的制备方法，包括如下步骤：
1)胶原蛋白粉末的制备：猪皮去除皮下脂肪组织后，洗净，切碎，在碱性溶液中脱脂24h；用清水漂洗三次，每次20h；于0.5％的胰蛋白酶中在37℃振荡浸泡24h；在10mMTrisHCl(pH8.0)+2％TritonX-100中在37℃振荡浸泡50h；室温下用清水清洗2d；取出用灭菌的PBS浸泡，冷冻干燥后经机械粉碎，过400目分子筛，得到胶原蛋白粉末；所述胶原蛋白粉末的主要成分为胶原蛋白，还含有纤维连接蛋白和层粘连蛋白。
用H.E染色及扫描电镜观测所得胶原蛋白粉末，如图2所示。经观察可知，猪皮经脱细胞处理后形成疏松多孔的三维结构。
2)NGF明胶微球的制备：在20％的明胶水溶液中加入NGF,所述NGF浓度为0.06-0.10μg/ml,将混合溶液加入要其体积3.5倍的色拉油中，预热到37℃以10000rpm搅拌10min乳化形成油水乳液，冷冻至-20℃，取出乳液放入冷冻离心机中以2000rpm离心10min,取沉淀物，用丙酮洗涤3-5次，洗涤后的沉淀物即为NGF明胶微球。用显微镜观察所得NGF明胶微球的形态，如图3所示。所述NGF明胶微球的粒经为1-20μm。
3)制备支架膜料：按质量比例8-7：2-3称量PLGA粉末和步骤1)所得胶原蛋白粉末，将PLGA粉末完全溶解在二氯甲烷中，加入胶原蛋白粉末，步骤2)所得NGF明胶微球，超声分散均匀，得到支架膜料；
4)将步骤3)所得支架膜料转入制膜模具的模具腔中，模具腔中沿支架膜料成型方向横向和纵向放置拉直的可降解金属丝，使可降解金属丝浸入支架膜料中，溶剂自然挥发干燥，抽真空48h,此时，干燥的支架膜料包裹所述可降解金属丝，得到所述人工神经支架。
实施例2：
一种富含胶原蛋白的人工神经支架的制备方法，包括如下步骤：
1)胶原蛋白粉末的制备：猪皮去除皮下脂肪组织后，洗净，切碎，在碱性溶液中脱脂36h；用清水漂洗三次，每次24h；于0.5％的胰蛋白酶中在37℃振荡浸泡18h；在10mMTrisHCl(pH8.0)+2％TritonX-100中在37℃振荡浸泡48h；室温下用清水清洗2d；取出用灭菌的PBS浸泡，冷冻干燥后经机械粉碎，过400目分子筛，得到胶原蛋白粉末；所述胶原蛋白粉末的主要成分为胶原蛋白，还含有纤维连接蛋白和层粘连蛋白。
2)NGF明胶微球的制备：在20％的明胶水溶液中加入NGF,所述NGF浓度为0.06-0.10μg/ml,将混合溶液加入要其体积3.5倍的色拉油中，预热到37℃以10000rpm搅拌10min乳化形成油水乳液，冷冻至-20℃，取出乳液放入冷冻离心机中以2000rpm离心10min,取沉淀物，用丙酮洗涤3-5次，洗涤后的沉淀物即为NGF明胶微球。
3)制备支架膜料：按质量比例8-7：2-3称量PLGA粉末和步骤1)所得胶原蛋白粉末，将PLGA粉末完全溶解在二氯甲烷中，加入胶原蛋白粉末和弱碱性添加剂，步骤2)所得NGF明胶微球，超声分散均匀，得到支架膜料；所述弱碱性添加剂为碱性氨基酸，其添加量应保证所述PLGA的降解环境pH值为7.28-6.62；
4)将步骤3)所得支架膜料转入制膜模具的模具腔中，模具腔中沿支架膜料成型方向横向和纵向放置拉直的可降解金属丝，使可降解金属丝浸入支架膜料中，溶剂自然挥发干燥，抽真空48h,此时，干燥的支架膜料包裹所述可降解金属丝，得到所述人工神经支架。
用扫描电镜观测所得人工神经支架的横断面显示所得人工神经支架的横断面呈蜂窝状结构。蜂窝状结构为神经细胞其中的爬行及延伸提供了需要的空隙。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其架构形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。

Claims (4)

1.一种富含胶原蛋白人工神经支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)胶原蛋白粉末的制备：动物皮去除皮下脂肪组织后，洗净，切碎，在碱性溶液中脱脂18－36h；用清水漂洗三次，每次18－24h；于0.5％的胰蛋白酶中在37℃振荡浸泡18－30h；在pH8.0的10mMTrisHCl+2％TritonX－100中在37℃振荡浸泡48－72h；室温下用清水清洗2d；取出用灭菌的PBS浸泡，冷冻干燥后经机械粉碎，过400目分子筛，得到胶原蛋白粉末；
2)NGF明胶微球的制备：在20％的明胶水溶液中加入NGF，所述NGF浓度为0.06－0.10μg/ml，将混合溶液加入到其体积3.5倍的色拉油中，预热到37℃以10000rpm搅拌10min乳化形成油水乳液，冷冻至－20℃，取出乳液放入冷冻离心机中以2000rpm离心10min，取沉淀物，用丙酮洗涤3－5次，洗涤后的沉淀物即为NGF明胶微球；
3)制备支架膜料：按质量比例8－7：2－3称量PLGA粉末和步骤1)所得胶原蛋白粉末，将PLGA粉末完全溶解在二氯甲烷中，加入胶原蛋白粉末和步骤2)所得NGF明胶微球，超声分散均匀，得到支架膜料；
4)将步骤3)所得支架膜料转入制膜模具的模具腔中，模具腔中沿支架膜料成型方向横向和纵向放置拉直的可降解金属丝，使可降解金属丝浸入支架膜料中，溶剂自然挥发干燥，抽真空48h，此时，干燥的支架膜料包裹所述可降解金属丝，得到所述人工神经支架。
2.如权利要求1所述的富含胶原蛋白的人工神经支架的制备方法，其特征在于，所述NGF明胶微球的粒径为1－20μm，微球对NGF的封载率为81.5％。
3.如权利要求1所述的富含胶原蛋白的人工神经支架的制备方法，其特征在于，所述NGF明胶微球的用量为PLGA粉末和胶原蛋白粉末总质量含量的20－40％。
4.如权利要求1所述的富含胶原蛋白的人工神经支架的制备方法，其特征在于，步骤3)中还添加有弱碱性添加剂，所述弱碱性添加剂为碱性氨基酸，壳聚糖，海藻酸钠或碳酸氢钠，其添加量应保证所述PLGA的降解环境pH值为7.28－6.62。
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