JP5092210B2 - コラーゲン基材 - Google Patents

Description

本発明は、コラーゲン長繊維を含む細胞培養用の基材に関する。詳細には、再生医療における移植用細胞培養基材等の各種培養基材としての用途、又は、生体内欠損部を補填することにより再生誘導を促す各種補填材若しくは補綴材としての用途に用いられる医療用基材に関する。

再生医療の分野では、全身のあらゆる組織や臓器を対象として、自己の細胞が増殖できる足場となる環境を与えることによって、組織や臓器が本来の構造及び機能を再生復元することが行われている。このような再生医療において、欠損した組織や臓器が再生する足場となる基材としてコラーゲン等の生分解性物質からなるものが着目されている。特に、コラーゲンは、生体を構成する主要なタンパクであり、生体適合性、組織再生、細胞増殖に適している。また、コラーゲン以外の基材で目的の細胞を体内培養する場合には、細胞の産生物により基材が分解されて形状が崩れたり流動化することを防止するために、体内培養に先立って前培養を必要とすることがあるが、コラーゲン基材を用いることにより、前培養を省略できる可能性もある。その一方で、コラーゲンは、様々な組織や臓器の再生に適した形状に加工することが難しいという問題がある。

医療用材料としてのコラーゲンは、ブタ等の動物から、所定の酸又はアルカリ等の条件下で酵素により抽出されたものに、ペプシン処理を施して抗原性発現部位を除去し、得られたコラーゲン溶液を凍結乾燥してスポンジ状の基材を製造する方法や、該コラーゲン溶液を湿式紡糸法で紡糸して繊維状の基材を製造する方法が公知である（例えば、特許文献１，２参照）。

特開２０００−２１０３７６号公報 特開２００３−３０１３６２号公報

しかし、前述した製造方法で得られる医療用材料は、不織布と呼ばれる２次元のものやスポンジ状のものである。不織布は、勿論厚みを有するものではあるが、専ら２次元方向に広がる基材として用いられるものであるから、血管や食道のような管状或いは膜状の組織を再生するための基材としては好適であるものの、例えば、骨の欠損部位に詰め物として基材を充填して骨細胞を体内培養するように、立体的な組織や臓器の三次元基材として用いるには不適である。

また、不織布の強度を増すために、縦横方向に交叉するように配列されたコラーゲン糸に可溶化コラーゲン溶液又はゼラチン溶液を噴霧して、コラーゲン糸同士を結着させるバインディング処理がなされるので、最終的に不織布とするまでの工数が多いという問題がある。

一方、スポンジ状の基材は、立体的な組織や臓器の三次元基材として用いることができるが、スポンジ状の基材は、コラーゲン溶液を凍結乾燥することにより多孔性の基材としたものなので、物理的強度が弱いという欠点がある。また、上記スポンジ状の基材の孔は独立気泡として形成されるので、気泡間において連続的に細胞を増殖させることは困難であり、細胞が成長し難いという問題がある。

本発明は、かかる問題に鑑みてなされたものであり、生体の欠損部位に対して、組織再生又は細胞増殖に適し、簡易に製造可能な三次元構造の医療用基材を提供することを目的とする。

(1)本発明は、湿式紡糸法により得られるコラーゲン長繊維を三次元網目構造をなす立体構造物とするコラーゲン基材の製造方法であって、可溶化コラーゲン溶液を、コラーゲンを凝固する溶媒が貯留された浴槽中に沈められた型枠内へ、ランダムに移動する口金から吐出して三次元網目構造をなす立体構造物にする立体構造形成工程と、上記立体構造物を乾燥又は架橋処理のいずれか一方又は双方を行う乾燥工程と、を含むものである。

(2)上記型枠は、所望のヒトの部位の形状であってもよい。

(3)また、上記コラーゲン長繊維の長さが、１００ｍｍ以上であることが好適である。

(4)また、上記コラーゲン長繊維の長さが、１００ｍｍから１００００００ｍｍの範囲内であることが好適である。

(5)また、上記コラーゲン長繊維の径が、３μｍから１００μｍであることが好適である。

(6)また、上記コラーゲン基材は、培養用として用いられるものが好適である。

(7)また、本発明に係るコラーゲン基材の使用方法は、上記製造方法により得られたコラーゲン基材を培養基材として使用するものである。

本発明に係るコラーゲン基材の製造方法によれば、コラーゲン長繊維が三次元網目構造体をなして、三次元網目構造体の立体形状が維持されるので、三次元構造の医療用基材を簡易に得ることができる。

以下、本発明の好ましい実施形態を説明する。

本発明の三次元網目構造体とは、コラーゲン長繊維により細胞が三次元的に増殖可能な足場及び連続的な空孔が形成された構造体をいう。

本発明において使用されるコラーゲンは、例えば酸可溶化コラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲン、又は中性可溶化コラーゲン等であり、ペプシンやトリプシン等の蛋白質分解酵素により可溶化処理或いはアルカリにより可溶化処理されたものが挙げられる。特に、取り扱いの容易性の観点から、酸可溶化コラーゲン又はアルカリ可溶化コラーゲンが好ましく、さらに、これらからコラーゲンから抗原決定基であるテロペプタイドが除去処理されたアテロコラーゲンがより好ましい。

コラーゲンの由来は特に限定されるものではなく、例えば、牛、ブタ、鳥類、魚類、ウサギ、ヒツジ、ネズミ、ヒト等から得られたものが使用でき、これら生体の皮膚や腱、骨、軟骨、臓器等から公知の抽出方法により得ることができる。I型、II型、III型等に分類されるコラーゲンのタイプは特に限定されるものではないが、再生したい部位を主に構成するコラーゲンの型と同じ型のコラーゲンを使用することが好ましい。例えば、皮膚、骨、腱等の再生を目的とするのであればI型を使用することが好ましく、軟骨等の再生を目的するのであればII型を使用することが好ましく、皮膚、筋肉等の再生を目的とするのであればIII型を使用することが好ましい。また、産業上の取り扱いの観点からは、I型コラーゲンが好適である。

本発明におけるコラーゲン長繊維は、種々の紡糸方法により紡糸された糸をいう。紡糸法としては、湿式紡糸法や乾式紡糸法、溶融紡糸法等が挙げられる。特に、製造が容易であることから、湿式紡糸法が好ましい。

上記湿式紡糸法においては、可溶化コラーゲン溶液が使用される。可溶化コラーゲンの溶媒としては、上記コラーゲンを溶解するものであれば特に限定されず、例えば、塩酸や酢酸、硝酸等の希酸溶液、エタノールやメタノール、アセトン等の親水性有機溶媒、水等がある。また、これら溶媒は単独で用いても２種以上を混合して用いてもよいが、中でも特に水が好適である。

また、可溶化コラーゲン溶液のコラーゲン濃度は、所定の紡糸方法でコラーゲン長繊維を紡糸可能な濃度であれば特に限定されないが、例えば湿式紡糸法により紡糸するのであれば約０．５〜３０重量％が好適であり、さらに好ましくは約１〜１０重量％であり、特に好ましくは約５〜７重量％である。なお、湿式紡糸法とは、可溶化コラーゲン溶液を凝固液で満たされた浴槽中にノズルから連続的に吐出して、脱水及び凝固することによりコラーゲン長繊維を得る製法である。

コラーゲン長繊維は、一つのコラーゲン基材において一連の１本の糸である必要はないが、ほぼ一連の糸としてコラーゲン長繊維を連続的に紡糸することが好適である。コラーゲン長繊維の１本当たりの長さは、浴槽中において三次元構造の立体構造物を形成できる長さであればよく、具体的には、１００ｍｍ以上であり、好ましくは１００〜１００００００ｍｍの範囲内である。

湿式紡糸法において、可溶化コラーゲン溶液を吐出する浴槽は、コラーゲンを凝固させることが可能な溶液が満たされたものであれば特に限定されず、例えば、硫酸ナトリウムや塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等の無機塩類水溶液、これら無機塩類をアルコールやアセトンに溶解又は分散させた無機塩類溶解有機溶媒、メタノールやエタノール、イソプロパノール、アミルアルコール等のアルコール類、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類を用いることができる。また、コラーゲン長繊維の強度の観点からは、凝固液はアルコール類が好ましくは、さらにはエタノールが特に好ましい。また、エタノールの含水率は、コラーゲン長繊維の強度の観点から約２０％以下が好ましく、さらに好ましくは約５％以下であり、特に好ましくは約１％以下である。

浴槽への可溶化コラーゲン溶液の吐出は、所定の径の口金から連続的に可溶化コラーゲン溶液を吐出できるものであれば、例えば公知のギアポンプやディスペンサ、押出装置等を用いることができる。特に、可溶化コラーゲン溶液の吐出量に変動がないものが均一な径のコラーゲン長繊維を得るために好適である。

また、可溶化コラーゲン溶液を吐出するための口金の径は、三次元網目構造体の強度や空孔の大きさを考慮して設定する。コラーゲン長繊維の径は、可溶化コラーゲン溶液の連続的に吐出の容易性や、浴槽中に吐出されたコラーゲン長繊維が立体構造物として三次元構造を維持できること、コラーゲン基材の強度や空孔の大きさを考慮すると、３〜１００μｍ、好ましくは５〜７５μｍが好適であり、上記口金の径も、このコラーゲン長繊維の径と同程度のものにすることが好適である。また、細胞や培養に必要な酸素等が三次元マトリックス内に進入しやすい空孔を形成するには、比容積を１〜１００ｃｍ^３／ｇ、好ましくは、２〜５５ｃｍ^３／ｇ、さらに好ましくは４〜１２ｃｍ^３／ｇとすることができる。

また、浴槽中へ可溶化コラーゲンを吐出する際には、口金を水平面に沿ってランダムに移動させて、浴槽中へ沈降したコラーゲン長繊維を１つの三次元構造の立体構造物にする。これにより、コラーゲン長繊維が三次元網目構造を構成し、組織再構築における細胞の三次元的な足場となる。この際、例えば生体内の欠損部位に対応する形状や、体外培養において目的とする臓器の形状等の所望のコラーゲン基材の形状があれば、その形状の型枠を浴槽中に沈めておき、該型枠中に可溶化コラーゲンをランダムに吐出する。浴槽へ吐出された可溶化コラーゲンは、スラリー状のコラーゲン長繊維となって浴槽の底又は型枠へ沈降して、三次元にランダムに接触した一定形状の立体構造物になる。この工程が本発明において立体構造形成工程と称される。

上記立体構造物は、浴槽中から取り出されて乾燥される（乾燥工程）。この乾燥工程において、三次元にランダムに接触したコラーゲン長繊維が相互に接着する。接着とは、コラーゲン長繊維間に剪断応力が生じうる程度に結合した状態をいう。結合の形態としては、物理的相互作用による結合や化学的相互作用による結合、機械的結合等が挙げられる。特に、結合強度の観点から、化学的相互作用による結合が好適であるが、本発明がこれに限定されるものではない。化学的相互作用による結合としては、共有結合やイオン結合、配位結合、水素結合等が挙げられる。特に結合強度の観点から、共有結合及びイオン結合が好適であり、共有結合が最も好ましいが、本発明がこれに限定されるものではない。共有結合を形成する方法としては、主に架橋処理による方法が挙げられる。

架橋処理は、物理的架橋方法と化学的架橋方法のいずれであってもよい。物理的架橋方法とは、γ線、紫外線、電子線、プラズマ、熱脱水架橋に例示される架橋方法である。一方、化学的架橋方法とは、アルデヒド類やエポキシ類、カルボジイミド類、イソシアネート類、タンニン処理、クロム処理等に例示される架橋方法である。また、化学的架橋方法は、可溶化コラーゲン溶液を吐出する浴槽に各種架橋剤を加えることにより、可溶化コラーゲン溶液の凝固と架橋処理とを同時に行うこととしてもよい。また、コラーゲン基材が体内培養用の基材として用いられることを考慮すると、生体内埋殖時の安全性及び細胞毒性の観点から、物理的架橋方法を採用することが好適である。さらに、物理的架橋方法の中でも熱脱水架橋が好適であるが、これに限定されるものではない。

この架橋処理により、コラーゲン長繊維をコラーゲンを溶解する溶媒に浸しても再び溶解されることがなく、また、コラーゲン長繊維が三次元網目構造をなして相互に接触している部位が架橋により接着され、三次元網目構造が維持される。これらを考慮すると、熱脱水架橋により架橋を行う場合に、温度約１１０〜１４０℃、約６〜４８時間、熱脱水架橋を行うことが好適である。

架橋処理を終えた三次元網目構造体は、体内に埋殖された際の安全性の観点から、中和液に浸して中和することが好ましい（中和工程）。中和液は、紡糸された三次元網目構造体のｐＨの応じて、酸性溶液、アルカリ性溶液等を種々選択すればよい。この中和は、中和液を交換しながら複数回行うことが好ましい。また、中和液としては、コラーゲンの分子構造維持の観点から、弱酸性溶液又は弱アルカリ性溶液が好ましく、例えば、炭酸水素ナトリウム水溶液、アンモニア水、リン酸緩衝液等を用いることができる。これらの中でも炭酸水素ナトリウム水溶液が好適であるが、これに限定されるものではない。中和が行われることにより、コラーゲン基材が体内に埋殖された際に、炎症反応が生じないようにできるので好ましい。

そして、中和された三次元網目構造体は、さらに強度を向上させる観点から、再び架橋処理を施してもよい。この架橋処理は、前述と同様に、物理的架橋方法及び化学的架橋方法を用いることができるが、コラーゲン長繊維の中和状態を維持し、且つ簡易に架橋処理を行うには、熱脱水架橋が好適である。熱脱水架橋は、例えば、真空下で１１０〜１４０℃、約６〜４８時間程度行う。これにより、コラーゲン長繊維の繊維強度が高まるとともに、三次元構造を形成するように相互に接触しているコラーゲン長繊維が、さらに強固に架橋されて適度な空孔を有する三次元網目構造が維持される。なお、この架橋処理の前後に、上記三次元網目構造体を風乾することとしてもよい。

このようにして、三次元網目構造体のコラーゲン基材を得ることができる。本実施の形態に係るコラーゲン基材によれば、コラーゲン長繊維が三次元網目構造の立体形状を維持するので、三次元構造の医療用基材を簡易に得ることができる。また、体外培養において、コラーゲン基材を足場として三次元的に組織細胞を培養することができる。また、臓器、骨及び皮膚等の組織の損傷又は欠損部の形状に応じてコラーゲン基材を成形し、補填材として使用することができる。特に、臓器及び皮膚の補填に本コラーゲン基材を用いた場合には、コラーゲンが有する止血効果により、損傷部は欠損部の止血が促進されるとともに、組織の再生（体内培養）が促されるので好適である。

以下、本発明の実施例について説明する。

〔実施例〕
ブタ由来I型，III型混合コラーゲン粉末（日本ハム株式会社製；ＳＯＦＤタイプ）を注射用蒸留水に溶解して７重量％の可溶化コラーゲン溶液を調製した。この可溶化コラーゲン溶液１５０ｍｌを、図１に示すように、９９．５容量％エタノール（和光純薬、特級）３Ｌの凝固浴１中に、ノズル２の先端から吐出して脱水凝固を行った。これにより、コラーゲン長繊維の三次元網目構造体３を得た。

得られた三次元網目構造体３を、クリーンベンチ内で風乾後、バキュームドライオーブン（ＥＹＥＬＡ社製：ＶＯＳ−３００ＶＤ型）中にて、高真空下（１ｔｏｒｒ以下）、１２０℃、２４時間の条件で熱脱水架橋反応を施した。架橋後、コラーゲン長繊維の三次元網目構造体３を７．５重量％炭酸水素ナトリウム水溶液（重曹）中に３０分間浸して中和処理を行った。中和後、蒸留水により洗浄し、クリーンベンチ内で風乾した。その後、三次元網目構造体３をバキュームドライオーブン中にて高真空下（１ｔｏｒｒ以下）、１２０℃、１２時間の条件で、再度熱脱水架橋反応を施した。これにより、図２に示すように、上記実施形態に記載したコラーゲン基材を得た。

〔実験例〕
実施例と同様にしてヒトの耳の形状に成形したコラーゲン基材を製造した。このコラーゲン基材を用いて、ヒト軟骨細胞の三次元培養を行った。まず、Condrocyne Basal Medium（商品名、ＣＥＬＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ社製）５００ｍｌにCondrocyne Glowth Supplement（商品名、ＣＥＬＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ社製）１０ｍｌを添加した培地を用いて、細胞濃度４．０×１０^５個／ｍｌとなるように細胞懸濁液を調製した。次に、コラーゲン基材（約３ｇ）の一部に上記細胞懸濁液３０ｍｌを塗布した。このコラーゲン基材を、細胞懸濁液が塗布された部分が底面となるようにシャーレ（ＣＯＲＮＩＮＧ社製、２５０ｍｌ）に静置し、上記培地６０ｍｌを静かに注入して、２ヶ月間静置培養を行った。培養は、３７℃、５容量％ＣＯ_２雰囲気下で行い、２日に１回の周期で培地を交換した。

培養開始より２ヶ月後に、コラーゲン基材の様子を観察した（図３）。底面に播種した細胞が、播種前のコラーゲン基材と略同形状に三次元に成長したことが確認された。また、培養された細胞は、コラーゲン基材の沿ったヒトの耳の形状に酷似していることが確認された。これにより、本発明に係るコラーゲン基材が今後の再生医療に貢献しうる培養基材であることが確認された。

図１は、実施例における三次元網目構造体３の製造工程を示す図である。 図２は、実施例で得られたコラーゲン基材を示す図である。 図３は、実験例で培養されたヒト軟骨細胞を示す図である。

符号の説明

１・・・凝固浴
２・・・ノズル
３・・・三次元網目構造体

Claims (7)

1. 湿式紡糸法により得られるコラーゲン長繊維を三次元網目構造をなす立体構造物とするコラーゲン基材の製造方法であって、
   可溶化コラーゲン溶液を、コラーゲンを凝固する溶媒が貯留された浴槽中に沈められた型枠内へ、ランダムに移動する口金から吐出して三次元網目構造をなす立体構造物にする立体構造形成工程と、
   上記立体構造物を乾燥又は架橋処理のいずれか一方又は双方を行う乾燥工程と、を含むものであるコラーゲン基材の製造方法。
2. 上記型枠は、所望のヒトの部位の形状である請求項１に記載のコラーゲン基材の製造方法。
3. 上記コラーゲン長繊維の長さが、１００ｍｍ以上である請求項１又は２に記載のコラーゲン基材の製造方法。
4. 上記コラーゲン長繊維の長さが、１００ｍｍから１００００００ｍｍの範囲内である請求項１又は２に記載のコラーゲン基材の製造方法。
5. 上記コラーゲン長繊維の径が、３μｍから１００μｍである請求項１から４のいずれかに記載のコラーゲン基材の製造方法。
6. 得られたコラーゲン基材が培養用として用いられる請求項１から５のいずれかに記載のコラーゲン基材の製造方法。
7. 請求項１から５のいずれかに記載のコラーゲン基材の製造方法により得られたコラーゲン基材を培養基材として使用するものであるコラーゲン基材の使用方法。