JPH02207785A - 細胞培養用多孔担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な構造を有する細胞培養用多孔担体に関
する。より詳細に述べると、細胞培養用マイクロキャリ
ア等に好適な構造を持つ高分子物質多孔粒子を含む多孔
担体に関する。

〔従来の技術〕

従来、接着依存性細胞の接着かつ増殖担体として研究室
規模ではガラスルーピンや特殊な処理を行なったポリス
チレン表面をもつ細胞培養用Ｔフラスコ、あるいは若干
規模の大きなものとしてはローラーボトルがあるが、大
量の有用物質を生産する場合膨大な数のボトルと労力を
要し、連続的な装置化は難しいので人手に頼らざるを得
す、二次汚染の危険性も高かった。以上のような欠点を
改善するために微小球形ビーズに細胞を接着させ、槽内
で浮遊培養を行なうマイクロキャリア法が開発された。

マイクロキャリアとしては、現在ファルマシア社゛（ス
ウェーデン）から市販されているＣ）ｌｔＯｄｅｘが代
表例である。しかしながら、現在のマイクロキャリアで
は、第１にキャリアに細胞を接着させることがそれ程容
易でなく、第２に槽内の撹拌による剪断力と、マイクロ
キャリア同士の衝突が細胞に損傷を与えたり、脱落ある
いは増殖に悪影響を与える等の欠点があげられている。

更に、第３としてマイクロキャリア法の開発により細胞
培養濃度を実質的に１０６セル／ｍＺまで向上させてき
たが、工業的にはこの１ケタ上ないしは２ケタ上の細胞
培養濃度を求める声が近年特に大きくなり飛躍的な革新
が切望されている。

以上３つの問題点は現行のマイクロキャリアの欠点と課
題を明確に表わしている。第１の問題はマイクロキャリ
アが球表面を持つため、細胞とキャリアの最初の接触が
点接触でしかな（、更に適度なひっかかりとなる凹凸が
ないことが大きな原因である。第２の問題は、細胞をキ
ャリア外表面に接着させる（以下、この型のマイクロキ
ャリアを「外表面接着型マイクロキャリア」と呼ぶ）た
め、極めて剪断の影響を受けやすく、しかもキャリア同
士の接触で大きな損傷を受けるという状況で起きる。第
３の問題は、単位容積あたりの細胞接着有効面積を飛躍
的に増大させることの必要性を提起しているが、外表面
付着型のマイクロキャリアではこの単位容積あたりの細
胞接着有効面積を増大させるには粒径を小さくするしか
ないが、その場合、１粒子あたりの表面積減少が、増殖
効率の低下につながりデメリットが大きい。

上記３つの問題点を解決する技術として、「培養液中に
分散された複数の発泡担体内で細胞を培養する細胞培養
方法」　（特開昭６Ｏ−２１４８７８）が提案されてい
る。しかしながら、ここで開示された培養は、かび、放
線菌等の細胞培養であり、通常マイクロキャリア培養に
用いる動物細胞培養ではない。また、用いる発泡体は、
平均細孔径約０．５１１１ｍを有する約５　ｍｍ角のウ
レタンホームであり、現行のマイクロキャリアが、一般
的に粒径２００〜３００７／Ｉｎの球径粒子であること
と比べると、単位容積あたりの細胞接着有効面積はむし
ろ小さくなっており、さらに、発泡体が大きいことから
、槽内に大量に入れると均一撹拌が困難となる等の欠点
が多く、現行マイクロキャリアの問題点を解決するには
至っていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、外表面接着型マイクロキャリアの上記
問題点を解決するため、培養担体の内部にも細胞接着に
有効な表面積を持ちかつ内部に細胞が自由に侵入できる
ような表面から内部に連通した連続孔構造を持つ新規な
細胞培養用多孔担体を提供するにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明が提供する細胞培養用多孔担体は、高分子物質（
セルロースおよび修飾されたセルロースを除く）膜で隔
てられた径が約２／／Ｉｎより大きい多数の空胞を有し
、該空胞は隣接した空胞間を隔てる膜の開孔部によりた
がいに連通した連続孔構造を形成していることを特徴と
する。

本発明の細胞培養用多孔担体の空胞の大きさは、径が約
２−より大きく、好ましくはその大部分が５声以上、更
に好ましくは１０／／ＩＴ１以上である。これより小さ
いときは、多孔担体中での細胞や培養液の自由な移動が
実現できない。空胞の大きさの上限は、特に制限される
ものではないが、現状のマイクロキャリアよりも有効表
面積を大きくするため、２００ｍ以下に設定され、通常
１００声以下、好ましくはその大部分が５０／／ｍ以下
、更に好ましくは３０声以下である。

空胞隔膜の厚みや構造に関しては、各空胞を互いに連結
するための連結口が開口されているべきこと以外は特に
制限されるものではないが、該開口の大きさは、空胞の
径に比べ余り小さすぎないことが好ましく、細胞の侵入
を可能にするため１声以上または、空胞径の１／３０程
度以上が望ましい。開口があまりに大きすぎると粒子構
造体の強度が不足して使用時の破壊につながり好ましく
ないため、空胞径の約３／４程度以下、特に約２／３程
度以下であることが望ましい。

隔膜には上記の大口径の開口部の他に、更に微細な孔構
造がみられることもあるが、培養液の流通を促進するた
めむしろ望ましい。

本発明の細胞培養用多孔担体の空胞を隔てる膜の厚さは
空胞径の１／４以下または５卿以下、好ましくは３μ以
下、更に好ましくは１卿以下である。

本発明の細胞培養用多孔担体を構成する膜は、実質的に
高分子物質（セルロースおよび修飾されたセルロースを
除く）より形成されている。ここで、高分子とは、ゴム
、多糖類、タンパク質、水溶性合成高分子、有機溶媒可
溶性合成高分子が好ましいが、特に限定はなく、無機高
分子でも本発明の範ちゅうに含める。修飾されたセルロ
ースの細胞培養用多孔担体については、本出願人の同日
付特許出願において開示しかつ特許請求しているので、
本発明の高分子物質からは除外する。ここで、修飾され
たセルロースとは、改質剤がコート、ブレンドもしくは
含浸されたセルロースまたは化学的に修飾されたセルロ
ースを指す。高分子物質の具体例をあげると、天然植物
系化合物、例えば、アラビアガム、クインスシード粘液
質、トラガカントガム、カラギーナン、アガー、グアガ
ム、カラヤガム、ローカストビーンガム、ペクチン、ガ
ラクタン、プルランまたはキサンタンガム、天然動物系
化合物、例えば、ゼラチン、カゼイン、カゼインカリウ
ム塩、カゼインナトリウム塩、またはコンドロイチン硫
酸ナトリウム塩、コラーゲン、エスラチン、ライ１０イ
ン、キトサン、キチン、ヒアルロン酸、澱粉系半合成高
分子化合物、例えば、カルボキシメチル澱粉、メチルヒ
ドロキシプロピル澱粉、デキストリン、デキストラン、
アルギン酸系半合成高分子化合物、例えば、アルギン酸
プロピレングリコールエステルまたはアルギン酸塩、合
成高分子化合物、例えば、ポリビニルアルコール、ポリ
ビニルピロリドン、ポリビニルエチルエーテル、カルボ
キシビニルポリマー、ポリアクリル酸、ポリアクリルア
ミド、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル
、ポリアクリロニトリル等またはそのそれぞれのモノマ
ーと他のビニルモノマーとの共重合体等、ポリアミド、
ポリエステル、ポリアラミド等の縮合重合体、およびエ
ポキシ反応物、右よびポリウレタンその他の付加重合体
等がある。それらの誘導体、塩、架橋体、ブレンドも含
まれ、高分子は特に制限されるものではない。

多孔担体を形成する高分子の平均分子量は特に制限され
るものではない。また、高分子中に金属、低分子量無機
物、低分子量有機物、気体が混在していても、それが本
発明の目的を損なわない限り許される。

多孔担体の形状や大きさも特に限定されるものではない
。代表的な形状として粒子状、糸状およびフィルム状の
ものが挙げられる。

多孔担体が粒子状の場合、形状は通常、球形、長球形な
いしは偏平球形から選ばれるが、特殊なものとしては、
円柱形、円筒形、鞍形など充填効果や浮遊性を高める形
状とすることも許される。

大きさも通常２０〜５００ｇｎ径、場合によっては５ｍ
ｍ径以上のものも可能である。

多孔担体が糸状の場合、断面形状は通常、円形、三角形
、六角形等の多角形、偏平多角形、偏平円形、中空状、
田型状のものから選ばれるが、この範囲に限定されるも
のではない。糸径も用途によって任意に選定されて良く
、通常１０〜５００／！Ｉｌｌ径、場合によっては５關
径以上のものさえ可能である。

糸径は糸長方向に均一である必要はなく、糸長も任意で
あることは言うまでもない。

多孔体がフィルム状の場合、膜厚は用途によって任意に
選定されて良く、通常１０〜５００声厚、場合によって
は５ｍｍ以上のものさえ可能である。膜厚は均一である
必要、はなく、むしろ凹凸をつけることやチューブ状、
ハニカム状その他の任意の形態にすることも好ましい実
施態喋となる。

本発明の細胞培養用多孔担体は、−例として、高分子溶
液を望みの形状に成形しつつ溶液の固化温度以下に冷却
して凍結させ、次いで溶媒を抽出除去するかまたは溶解
能力を失わせる方法によって製造される。

上記製造方法によれば、製造時に高分子溶液には多孔化
材などの異物を入れる必要がないため、微小な均一径の
液滴を容易に作ることができ、粒径コントロールを任意
に行なうことができる。空胞の径と形状は基本的に溶液
中の溶媒等が凍結固化する際に形成する溶媒等の結晶の
大きさと形状により決まる。従って、高分子溶液の種類
、温度などの凍結固化条件を変化させることにより空胞
の形状及び孔径を調整することができる。

高分子多孔粒子の形状と粒径は高分子溶液の種類、高分
子濃度、溶液の粘度などでコントロールできるし、また
溶液を液滴にする方法によっても任意に粒子の形状と大
きさをコントロールできる。

液滴にする方法には溶液を気体中に噴霧するスプレーノ
ズル法、流動体中への溶液吐出法、エマルジョン分散法
などがあるが、これらに限定されるものではない。

糸、フィルム、ハニカム、中空糸、チューブ等への成形
には、通常のノズルやグイからの押出し法、型枠への注
入法等があるが、これらに限定されるものではない。ま
た、適当な工程で延伸、展伸、切断することも可能であ
る。

凍結は、高分子溶液を任意の温度に調節した媒体中に導
入することによっておこなう。高分子溶液と非反応性か
つ非混和性の液体あるいは気体中であればほぼ均一に凍
結する。また、該溶液と混和性の液体中であれば、いび
つな形状で凍結するし、反応性の気体あるいは液体中で
あれば、粒子の表面部分だけを反応・改質したうえ凍結
することができる。例えば、高分子溶液と混和性の液体
あるいは気体中で凍結させると、凍結温度に達する前に
、接触界面にのみ該液体あるいは気体が浸透するため、
表面を覆う膜状に高分子が析出する。

結果として、表層のみ膜で覆われた高分子多孔体が得ら
れる。

この方法において凍結を実施するに際し、凍結温度は溶
媒等が凍結する温度より低ければ、特に制限されるもの
ではない。しかしながら、多孔体の空胞径を決定する溶
媒等の結晶の成長の点で重要であり、溶媒等の種類及び
目的とする空胞径から選択される。余りにも低い温度は
、凍結に際し結晶を形成することなく、高分子溶液が溶
液構造に近い状態のまま凍結されてしまい、通常の湿式
凝固したと同様のゲル構造となり、好ましくない場合が
多い。但し、凍結温度の適切な設定により、多孔体表面
のみゲル構造とし、内部を多孔構造にすることが可能で
あり、且つ表面を部分的にゲル被膜で覆い部分的に粒子
内部への連結口を残すこともできる。この様な構造を持
つ多孔粒子は、圧゛縮時の変形に対し特に高い抵抗力を
持つ。一般には、凍結温度は、溶媒等の凍結温度よりも
４０℃以上低くは設定されないことが好ましく、通常は
凍結温度よりも０〜２０℃低い範囲に選ばれることが多
い。

さらに、孔径の調節を行なうには、まず高分子溶液をで
きるだけ低温、望ましくは凍結温度よりも４０〜２００
℃低い温度で急速凍結し、その後温度を、凍結温度より
は若干低い温度までの任意の温度に到るまで上昇させ、
その温度で保持する時間をかえると溶媒の結晶成長をコ
ントロールできる。

すなわち、上記の方法では、孔の形状と大きさは、溶媒
結晶の形と大きさで決まるため、溶媒結晶の成長をいか
にコントロールするかが要点であり、超低温で急速凍結
を行なった後、溶媒結晶を成長させる温度と時間を任意
に設定することにより高分子溶液が同一でも孔径の制御
範囲を持たせることができる。

上記製造方法において、凍結された高分子溶液は、次い
で、高分子を溶解している溶媒を抽出除去するか、その
溶解能を低めて（以下、これらの処理を総称して「溶媒
除去等」という）、固化された高分子多孔体とする。

溶媒除去等の手法としては、通常の高分子溶液の湿式成
形時に用いられる非溶媒による置換稀釈析出もしくは沈
澱、溶媒抽出、または酸アルカリ中和反応、高分子の変
性による溶解能力除去などの凝固方法がそのまま適用で
きる。

溶媒除去等の条件は特に制限されるものではない。通常
は、高分子溶液の凍結温度以下に冷却した凝固浴中に該
高分子溶液凍結体を素早（投入すれば足りるが、この時
の凍結体と凝固浴の温度は、高分子溶液の凍結温度より
１０℃以上低くしておいた方が望ましい。

溶媒除去等を済ませた高分子多孔体は、次いで水または
他の洗浄剤により洗浄され、必要があれば乾燥や液置換
等を施された後、後処理に供される。洗浄や乾燥の条件
についても特に制限されるものではなく、用途に応じた
条件が任意に選ばれて良い。

〔作用および発明の効果〕

本発明の細胞培養用多孔担体は、約２陶より大きい大孔
径の連続空胞を持つため、細胞接着性が良く、担体内部
で細胞の培養を行なうため、撹拌による剪断力が細胞に
損傷を与えることもない。

また、内部多孔表面を細胞接着面として有効に利用する
ことに細胞培養濃度を飛躍的に上げることができる。要
するに、本発明の細胞培養担体によれば、従来の細胞培
養担体の欠点を克服したうえ、細胞培養濃度を大幅に向
上することができる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例について具体的に説明する。

粒子の経糸の径は、光学顕微鏡により適当な倍率に設定
して測定した。５０／／ＩＩＩ径以下の微小粒子表面の
開孔径等は、金スパツタリング処理して走査型電子顕微
鏡（ＳＢＭ）で適当な倍率に拡大し観察で凍結乾燥（凍
結乾燥処理）後、ＳＥＭ観察を行なった。多孔担体内部
の開孔径と膜厚は、上述のように液体窒素で凍結した後
、同温度で割断を行ない、そのまま真空中で乾燥以降の
処理を施しＳＥＭで断面の観察測定を行ない求めた。

粒子径、開孔径等については、それらが真球や真円でな
い場合は、最も短い直径をもって定義した。

実施例１ アルギン酸ナトリウム（東京化成製）を６％水酸化ナト
リウム水溶液に溶解し、２％濃度のアルギン酸ナトリウ
ム溶液を調製した。この溶液を、−１６℃のへキサン中
にスプレーノズルを用いて霧状の微粒子状態で投入し、
同温度で１時間の緩撹拌を続けたところヘキサン中で微
粒子形状の該溶液の凍結体を得た。次に、このヘキサン
容器から該溶液の凍結体を取り出し、−２０℃の５０％
硫酸水溶液中に投入し、−２０℃に５時間保った後、ア
ルギン酸粒子を取り出し水洗した。

次に、この粒子を６０℃の飽和水酸化カルシウム水溶液
中で１時間撹拌した。

１時間後濾紙で濾別し蒸留水で十分に洗浄した後、耐圧
ビンに蒸留水１００ｍ１とともに入れ、１２１℃のオー
トクレーブで２０分間滅菌処理を行なった。一部を取り
出し、光学顕微鏡で粒子を観察したところ、粒子径は５
０〜３００−ですべての粒子に１０〜２０　ｔｍ　ｌ）
孔径の孔が表面から均一に開孔していることが認められ
た。

また、ＳＥＭで観察したところ、膜で隔てられた径１０
〜２０−の空胞が集合した形状の球形の粒子であること
を確認した。高倍率での観察により、空胞間を隔てる膜
が部分的に開通した連続孔構造を形成している様子が明
らかになった。凍結割断面をＳＥＭで観察したところ、
内部の空胞径も１０〜２０−で、隔膜の厚みは、１声以
下であった。

さらに、ハムＦ−１２（大日本製薬株式会社製）培地に
牛胎児血清（大日本製薬株式会社製）を５％添加したも
の５−を径６０ｍｍの滅菌済デイツシュに入れ、水洗後
の上記粒子をデイツシュ底面に一層敷き詰めるように添
加した後、チャイニーズハムスター卵巣由来の株細胞Ｃ
ＨＯ−に１（大日本製薬株式会社製）を加え３７℃、二
酸化炭素５％の条件で１４日間インキュベートした。イ
ンキュベート後、リン酸緩衝溶液で洗浄し、２％グルタ
ルアルデヒド中に粒子をいれ４℃で３時間数セした後、
さらにリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、２％オ
スミウム酸で１．５時間、４℃で処理した。次に４℃の
２０％、５０％、７０％のエタノール水溶液で順次８１
０分間処理した後、室温の８０％６９０％。

１００％エタノールで順次アルコール置換をおこなった
。更に酢酸イソアミル中に３０分間浸漬した後、二酸化
炭素を用いた臨界点乾燥処理を行ない、乾燥試料を得た
。この試料を金蒸着処理した後ＳＥＭで観察したところ
ＣＨＤ−Ｋｌが粒子の孔に入り込んで付着繁殖している
状態を確認した。

さらに、ＣＩ（（１−Ｋｌが粒子表面の開孔部より粒子
内部にまで入り込んで付着繁殖していることを詳しく観
察するために、粒子の切片を作成した。前述同様に、イ
ンキュベーター内にて１４日間培養後、ＣＨＤ−Ｋｌの
付着している粒子をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で２回洗
浄した。さらに、その粒子を２％グルクルアルデヒドに
入れ４℃で３時間放置して細胞を固定した。次に、過剰
のグルタルアルデヒドをのぞくために水洗し、水溶性メ
タクリル樹脂に徐々に置換してゆき、１００％樹脂置換
後６０℃、１２時間で樹脂を固化した。超ミクロトーム
にて１声の切片を作成後、トルイジンブルー染色を行な
うことにより細胞のみ染色した。このようにして作成し
た切片を光学顕微鏡で観察したところＣｌｌ０−Ｋｌ細
胞が粒子内部に進入して付着繁殖充填している状態を確
認した。

実施例２ 実施例１と同様の方法で調製したアルギン酸カルシウム
粒子を滅菌前に１４５メツシユのふるいにかけ、１００
声径以下の粒子のみ分取した後、１２１℃、２０分間の
オートクレーブ滅菌を施した。次に、単に撹拌式培養に
従って細胞と粒子を併せることによってミクロキャリア
培養を開始した。この場合、磁気駆動テフロンコーティ
ング撹拌翼を備えた２５０ｍ／のガラス製スピナーボト
ル（直径６．５ｃｍ）中において、実施例１と同様の細
胞と培地を用いた。撹拌速度は約６Ｏｒｐｍであった。

１４日間の培養期間中、培養液を２回交換したが培養の
後、粒子を取り出し、実施例１で述べた後処理を施し、
切片作成後、細胞染色を行なって光学顕微鏡で観察した
ところ、粒子の内部にＣ’ＨＤ−Ｋｌ細胞が増殖充填さ
れていることを８８忍した。

実施例３ ３０℃に冷却したシリコーンオイル（信越シリコーン側
社製ＫＦ９６　）を用意し、滅菌処理済みのコラーゲン
Ｉ溶液であるＣｅｌｌ−ｍａｔｒｉｘ　　Ｉ　−Ａ　（
新田ゼラチン■社製）を孔径１００側のシリンジで、シ
リコーンオイル中に押し出したところ、糸状に凍結した
。シリコーンオイルの温度を一７℃に上昇させ、３０分
間放置した後、−７℃の１０％アンモニア水溶液中に投
入し、−７℃に１時間保ったのち、コラーゲン糸状体を
取り出した。

また、シリンジとは別にスリット幅１００μＩｎ、スリ
ット長１５ｃｍのグイから上記のコラーゲン溶液の押し
出し実験を行ない、同様の処理でコラーゲンフィルムを
得た。

水洗後、光学顕微鏡で糸とフィルムを観察したところ、
糸径は１２０陶、フィルム厚も１２０ａｎで、ともに１
０〜４０ＩＩｍの孔径の孔が表面から均一に開孔してい
ることが認められた。

また、ＳＥＭで観察したところ、膜で隔てられた径１０
〜４０陶の空胞が集合した形状の糸とフィルムであるこ
とを確認した。高倍率での観察により、空胞間を隔てる
膜が部分的に開通した二東話孔構造を形成している様子
が明らかになった連続割断面のＳＥＭ観察により、糸、
フィルム共に内部の空胞も１０〜４０声径が多く、隔膜
の厚さは約１声であだ。

この糸とフィルムを７０％エタノールに１日浸潰滅菌処
理した後滅菌水で十分に洗浄した。これらの試料を実施
例１と同様に細胞培養試験に供した後、後処理をして切
片を細胞染色し、光学顕微鏡観察したところ、糸とフィ
ルムの内部にまでＣｌｌ０−Ｋｌ細胞が増殖充填してい
ることを６１１４ｎした。

実施例４ 実施例１のアルギン酸カルシウム粒子を凍結乾燥し、 島原製作所■ボアサイザ’−９３００を用い、水銀ボロ
シメトリーにより細孔分布を求めた。気孔率（ε）は粒
子的水銀侵入体積（υＳ　：ｃ＋ｒｆ／ｇ）とセルロー
スの比容積（υｃ：ｃ＋＋ｆ／ｇ）より下記式により計
算した。

孔径２声以上の範囲で気孔率９６％、比表面積は同範囲
で４０ｍ’／ｇであった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、高分子物質（セルロースおよび修飾されたセルロー
   スを除く）の膜で隔てられた径が約２μｍより大きい多
   数の空胞を有し、該空胞は隣接した空胞間を隔てる膜の
   開口部によりたがいに連通した連続孔構造を形成してい
   ることを特徴とする細胞培養用多孔担体。