JP5150150B2 - 細胞培養用基質およびその製造方法 - Google Patents
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Description
すなわち、本発明は、鉄架橋アルギン酸ゲルを含む細胞培養用基質に関する。本発明において、鉄架橋アルギン酸ゲルは薄膜状であることが好ましく、膜状の鉄架橋アルギン酸ゲルの厚さは、1μm〜1mmであることが好ましい。
また、本発明は、薄膜状に乾燥させたアルギン酸のアルカリ金属塩に、鉄イオン水溶液を加える細胞培養用基質の製造方法に関する。
さらに、本発明は、前記細胞培養用基質を乾燥させて得られる細胞培養用乾燥基質、および前記細胞培養用基質を用いた複合培養上皮に関する。
本発明の細胞培養用基質が薄膜状である場合には、柔軟性に優れるために、基質と下層組織との間の相互作用を良好に保つことができ、分解や吸収に起因する副産物の量を少なくすることが可能であるという理由から、上皮細胞および繊維芽細胞を増殖させそのまま移植に用いることができる。例えば、本発明の細胞培養用基質上にヒト表皮細胞およびヒト繊維芽細胞を培養し、移植用の複合培養皮膚を得ることができる。
これらの利点により、本発明の細胞培養用基質は、皮膚組織工学、生物医学的用途、臨床応用において使用することができる。
なお、以下の実施例中、特に断りのない限り、薬品として試薬グレードの薬品を用いた。
6−ウェル組織培養プレートの各ウェルに、セルロース製のシート(BEMCOT(登録商標)、小津産業株式会社)を切り出すことにより作製したフレーム(直径約30mmのリング)を置いた。次いで、1%(w/v)アルギン酸ナトリウム水溶液3mL(MVG(α−L−グルロン酸高含有)、FMC Biopolymer製)を各ウェルに加え、60℃で一晩乾燥させた。乾燥後、各ウェルに500mMのCaCl2 3mLまたは500mMのFeCl3 3mLを加え、30分間、室温で放置し、アルギン酸を架橋した。得られたゲルフィルムを脱イオン水で洗浄し、アルギン酸と反応していないイオンを除いた。洗浄後、ゲルフィルムを10mlの脱イオン水に浸し、pHを測定したところ3.6であった。さらに、ゲルフィルムを70%(v/v)エタノールで殺菌した。殺菌後、ゲルフィルムをイーグル最小必須培養液(E−MEM、日水製薬株式会社)内で、37℃、5%CO2雰囲気下、72時間保存し、安定させた。E−MEMは、24時間毎に交換した。72時間保存後、イーグル最小必須培溶液中のゲルフィルム周辺のpHは7.4であった。得られたゲルフィルムの厚さは、カルシウム架橋ゲルフィルムおよび鉄架橋ゲルフィルムともに30μmであった。図1に鉄架橋ゲルフィルムの写真を示す。
(接触角)
ゲルフィルムの濡れ性を、気泡法により測定した。具体的には、脱イオン水中に沈めたサンプルと気泡との静的接触角を、FACE接触角メーター(Image processing type CA−X、協和界面科学株式会社)を用いて測定した(Cheng X, Canavan HE, Stein MJ, Hull JR, Kweskin SJ, Wagner MS, Somorijai GA, Castner DG, Ratner BD, Surface chemical and mechanical properties of plasma-polymerized N-isopropylacrylamide, Langmuir. 21 (2005) 7833-7841)。カルシウム架橋ゲルフィルムおよび鉄架橋ゲルフィルム(それぞれ合計3枚)について、それぞれ5回の測定を行った。
ゲルフィルムを6−ウェル組織培養プレート中で、E−MEM、10%(v/v)ウシ胎仔血清(FBS、Tissue Culture Biologicals)含有E−MEM、または、FBSを用いて、37℃で2時間インキュベーションした。インキュベーション後、ゲルフィルムを脱イオン水で洗浄し、プレートに移した。100mMクエン酸ナトリウム3mLを加え、室温で数分間、浸漬することにより、ゲルフィルムを溶解した。溶液を回収し、溶液に含まれているタンパク質を、10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)にて分離した。タンパク質を銀染色法(和光銀染色キット、和光純薬工業株式会社)により視覚化した。
ゲルフィルムへの細胞の接着性および増殖評価には、正常ヒト皮膚繊維芽細胞(NHDF、Cambrex Bio Science Walkersville,Inc、10〜20代継代)を用いた。まず、細胞を、10%(v/v)FBSを含有するE−MEM内で増殖させた。次いで、細胞を、6−ウェル組織培養プレート内のカルシウム架橋アルギン酸ゲルフィルムおよび鉄架橋アルギン酸ゲルフィルム上に、50,000cells/wellの密度で播種し、37℃、5%CO2条件下で15日間培養した。10%(v/v)FBSを含有するE−MEMを、1または2日毎に取り替えた。細胞を、位相差顕微鏡を用いて観察し、また、細胞計数を、4時間、3日、6日、9日、12日、および15日後に実施した。ゲルフィルムに接着した細胞を計数するために、ゲルフィルムをプレートに移し、Ca2+およびMg2+非含有リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、0.25%(w/v)トリプシン(Becton Dickinson)および0.02%(w/v)エチレンジアミン四酢酸を含むPBSを用いた酵素処理(37℃、10分間)に続いて、10%(v/v)FBSを含むE−MEM中に再懸濁し、激しく撹拌することにより細胞をゲルフィルムから剥がした。細胞懸濁液に含まれる細胞数を、コールターカウンターを用いて測定した。カルシウム架橋ゲルフィルムおよび鉄架橋ゲルフィルム(それぞれ合計3枚)について、同様の評価を行った。
細胞を鉄架橋アルギン酸ゲルフィルム上、または組織培養プレート上にて、コンフルエントになるまで10%(v/v)FBSを含有するE−MEM中にて培養した。その後、鉄架橋アルギン酸ゲルフィルムを別のプレートに移し、PBSにて洗浄した後、50mMクエン酸三ナトリウム二水和物を3ml加え室温にて数分静置してフィルムを溶解した。溶解液に10%(v/v)FBSを含有するE−MEM7mlを加え撹拌し、懸濁液を得た後、この懸濁液の一部を採取しトリプシン処理して(細胞−細胞間接着を切断して)細胞数をカウントした。残りの懸濁液から遠心分離により細胞を回収し、細胞を10%(v/v)FBSを含有するE−MEMに再懸濁後、さらにもう一度遠心分離により細胞を回収し、適当な濃度になるよう10%(v/v)FBSを含有するE−MEMに再懸濁し、組織培養プレート上に播種した。一方、組織培養プレート上にて培養した細胞はトリプシン処理(37℃、10分)により回収し、遠心分離後、細胞数をカウントし、その後適当な濃度になるよう10%(v/v)FBSを含有するE−MEMに再懸濁し、組織培養プレート上に播種した。
同細胞数で組織培養プレート上に播種した、鉄架橋アルギン酸ゲルフィルム上からクエン酸ナトリウム処理により回収した繊維芽細胞および組織培養プレート上からトリプシン処理により回収した繊維芽細胞を、24時間後に回収しカウントした。具体的には、組織培養プレートをPBSで洗浄し、トリプシン溶液を用いた酵素処理(37℃、10分間)により、細胞をプレートから剥がした。その後、10%(v/v)FBSを含むE−MEM中に再懸濁し、細胞懸濁液に含まれる細胞数を、コールターカウンターを用いて測定した。細胞播種数を100%としたときの相対値で評価した。
Claims (6)
- アルギン酸のアルカリ金属塩に鉄イオン水溶液を加え、薄膜状の鉄架橋アルギン酸ゲルを得る工程を有する、哺乳類の細胞培養用基質の製造方法。
- 鉄架橋アルギン酸ゲルの厚さが1μm〜1mmである請求項1記載の細胞培養用基質の製造方法。
- アルギン酸のアルカリ金属塩が、薄膜状に乾燥させたアルギン酸のアルカリ金属塩である請求項1又は2記載の細胞培養用基質の製造方法。
- 請求項1〜3いずれかに記載の細胞培養用基質の製造方法により細胞培養用基質を得る工程、及び、前記細胞培養用基質を乾燥させる工程を有する、哺乳類の細胞培養用乾燥基質の製造方法。
- 請求項1〜3いずれかに記載の細胞培養用基質の製造方法により得た細胞培養用基質上で哺乳類の細胞を培養する工程を有する、細胞が接着した細胞培養用基質の製造方法。
- 請求項1〜3いずれかに記載の細胞培養用基質の製造方法により得た細胞培養用基質上で哺乳類の細胞を培養する工程、及び、キレート剤を用いて前記細胞培養用基質を除去し、前記細胞を回収する工程を有する、細胞の製造方法。
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