JP5709015B2 - 角膜移植用シート - Google Patents
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Description
1)培養角膜内皮細胞を移植する際に内皮細胞のもつ機能・形態を損なうことなく移植することが可能。
2)実質への生着性が良好でありシートの脱落が起きない、又は、速やかに生分解されるためシートが前房内に脱落しないため移植した角膜内皮への傷害も起きない。
3)移植後の透明性・生体適合性も良好であり、炎症反応等が無く、角膜透明性も維持されている。
すなわち、本発明は、ゼラチンハイドロゲルに角膜内皮細胞を含んでなる角膜移植用シートに関する。
本発明で用いられる角膜内皮細胞は、患者由来の細胞から調製されたものであることが好ましい。
1.1 ゼラチンハイドロゲルとは
本発明にかかる「ゼラチンハイドロゲル」とは、ゼラチンに化学反応、熱脱水処理、放射線、紫外線、あるいは電子線照射等を与えることによりゼラチン分子間に架橋を形成させて得られるハイドロゲルのことである。
ゼラチンの架橋度は、所望の生体内分解性や含水率、生体吸収性のレベルに応じて適宜選択することができる。架橋は、ゼラチンを構成するコラーゲンのどの部分を架橋するものであってもよいが、特にカルボキシル基と水酸基、カルボキシル基とε−アミノ基、ε−アミノ基同士を架橋することが好ましい。こうして架橋を導入することにより、複合体は所望の機械的強度特性を有するようになる。また、架橋の導入率によって、生体内での分解速度(残存期間)も制御することができる。一般に、ゼラチン及び架橋剤の濃度、架橋時間が増大するとともにハイドロゲルの架橋度は増加し、生体吸収性は低くなる。
ゼラチンハイドロゲルの分解性は、前述した架橋度とシートの厚さによって調整することができる。分解性は動物体内、例えば前眼部であれば、14日〜1年以上の範囲でコントロールが可能である。本発明では分解性が早すぎると角膜内皮細胞の足場としての役割が果たせず、角膜内皮細胞の生着が不良になると考えられる。そこで分解性としては14日〜6ヶ月、特に1〜3ヶ月程度で設定することが好ましい。又は、ゼラチンハイドロゲルの実質への生着性が良好であり脱落が起きなければ、分解時間を1年以上のほぼ生分解が起きない期間に設定することも考えられる。
本発明のゼラチンハイドロゲルシートはいずれの形状にも成型可能であるが、培養角膜内皮細胞移植用キャリアへの適用のため、本発明においてはシート上に成型する。シートの厚さは、角膜内皮移植への適用を考慮すると、10〜200μm程度が好ましく、30〜100μm程度がより好ましい。
本発明のゼラチンハイドロゲルは、優れた透明性を有し、従来キャリアとして用いられているアテロコラーゲン等に比較して、その透明度は格段に高い。また、ゼラチンハイドロゲルは、患部に適用後においても、その透明性を維持しうる。
2.1 ドナーあるいは患者由来の角膜内皮細胞
本発明で用いられる角膜内皮細胞は、角膜内皮細胞層に含まれる細胞を包括したものであり、角膜内皮幹細胞、角膜内皮前駆細胞をも含む。また角膜内皮細胞は、患者以外のドナー、例えばヒト輸入アイバンク角膜の角膜内皮を用いてもよいし、移植を受ける患者由来の角膜内皮細胞を用いてもよい。拒絶反応を防止する点では患者由来の細胞を用いることが望ましいが、前述のように角膜内皮細胞は生体内では増殖しないため、患者健常眼から角膜内皮細胞を採取することは技術的には可能であるが、現実的には困難である。
角膜内皮細胞は、角膜内皮幹細胞、角膜内皮幹細胞以外の組織幹細胞あるいは胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞から誘導された角膜内皮細胞を利用してもよい。用いられる角膜内皮幹細胞や人工多能性幹細胞の調製方法は特に限定されないが、治療を必要とする患者自身に由来する細胞であることが好ましい。
本発明の角膜移植用シートは、前述のゼラチンハイドロゲルシートをコラーゲン(タイプIあるいはタイプIV)でコーティングし、その上に角膜内皮細胞を播種して培養する
ことにより作製される。
ゼラチンハイドロゲル上へのコラーゲンのコーティングは、細胞接着性及び角膜内皮機能の改善を目的として行う。用いるコラーゲンはタイプIあるいはタイプIVが好ましく、抗原性を除去したアテロコラーゲンであることが好ましい。コラーゲンコーディングは、常法にしたがって、コラーゲンを希塩酸(pH3.0)で10倍希釈しゼラチンハイドロゲル上に薄く塗り広げ、乾燥させることで実施できる。コーティングしたシートは、使用前にPhosphate−Buffered Salines(PBS)(Invitrogen)で洗浄することが好ましい。
ゼラチンハイドロゲルシート上での培養は、接着細胞の培養に通常用いられる培地を用いて行うことができる。例えば、DMEM培地、BME培地、α MEM培地、Dulbecco MEM培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、McCoy’s培地、ウイリアムスE培地、及びこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であればいずれも用いることができる。
上記の培地を含むゼラチンハイドロゲルに、角膜内皮細胞を500〜4500cells/mm2の播種密度、好ましくは1500〜3500cells/mm2の播種密度で播種し、36℃〜38℃、好ましくは36.5℃〜37.5℃で、1%〜25%O2、1%〜15%CO2の条件下で培養する。培養日数は、細胞がコンフルエントになってから少なくとも3日以上、好ましくは7日以上であることがよい。最終的に得られるゼラチンハイドロゲル内の細胞密度は、2000cells/mm2以上、好ましくは2500cells/mm2以上、より好ましくは3000cells/mm2以上である。
本発明の角膜移植用シートは、ゼラチンハイドロゲルを支持体としているため、単層で厚さ10μm程度しかない角膜内皮細胞層の強度と操作性を格段に向上させる。シート上の角膜内皮細胞は、バリア機能を示すタイトジャンクションタンパクZO−1を発現し、細胞のシートへの接着性は良好である。シートは、トリプシンやディスパーゼ等の酵素処理を施すことなく培養容器から剥離可能であるため、細胞のデスモソーム構造が維持され、角膜内皮細胞層本来の構造と強度が維持される。
豚皮もしくは牛骨よりアルカリ処理によってコラーゲンから抽出した(分子量98,000等電点5.0)。ゼラチンの10WT%水溶液を調整した。これをプラスチックシャーレに流し込み室温で数日放置することで水を蒸発させ、ゼラチンシートを得た。これを160℃0.01Torrで72時間熱脱水処理を行い、ゼラチン分子間を化学架橋した。得られたゼラチンシートは、含水率97%、厚さ:100μm、であった。なお、厚さは目的に応じて、30μm〜で調整可能である。
上記のようにして調製したゼラチンハイドロゲルシート(48時間架橋)と、アテロコラーゲンシート(株式会社高研)の透明度を目視で比較した(図1)。さらに、ゼラチンハイドロゲルシートの架橋時間を変えて(6〜48時間)、その光透過率を比較した。表1に示すように、いずれの架橋時間においても、ゼラチンハイドロゲルの光透過率はアテロコラーゲンより高かった。
ゼラチンハイドロゲルシートの力学特性をアテロコラーゲンと比較評価した。
架橋時間の異なる(6〜48時間架橋)ゼラチンハイドロゲルシート、及びアテロコラーゲンシートの引っ張り試験に対する強度(図2A及びB)とブレークポイント(図2C)を測定するとともに、弾性係数(Elastic modulus)を算出した(図2D)。
ゼラチンハイドロゲルシートは架橋時間依存的に引っ張り強度が増加し、逆に弾性係数は低下する傾向が認められた。また、ゼラチンハイドロゲルシートは、いずれの架橋時間についても、アテロコラーゲンと同等かそれ以上の強度及び弾性を有することが確認された。
ゼラチンハイドロゲルシート(48時間架橋)の物質透過性をアテロコラーゲンシートと比較評価した。物質透過性は、常法にしたがいアルブミンとグルコースに対する拡散係数を求めることで評価した。
1.角膜内皮細胞の調製
家兎眼球より強角膜片を作成し、デスメ膜を剥離した。デスメ膜は、0.25%Trypsin−EDTAと37℃10分インキュベートして、細胞を単離した。2ng/ml bFGF(R&D systems)及び10%血清(Japan bio serum)入りのDMEM培地(Low glucose、日研生物医学研究所)を添加し、300g x 5min遠心分離し、上清を吸引し、残った細胞塊を同様の培地に懸濁させた。
実施例1で調製したゼラチンハイドロゲルシートをコラーゲンタイプIもしくはタイプIV(新田ゼラチン)にてコーティングした。コーティング方法としては、3.0mg/mlコラーゲン溶液原液(pH3.0)を、実施例1で作製したゼラチンハイドロゲルシート上に、セルスクレイパー等を用いて直接塗布する方法と、希塩酸で10倍に希釈したコラーゲン溶液中にゼラチンハイドロゲルシートを浸漬する方法で、ともにクリーンベンチ内で30分以上置き静置させることでコーティングした。コーティングしたシートは、使用前にPhosphate−Buffered Salines(PBS)(Invitrogen)で3回洗浄した。
コラーゲンを塗布したゼラチンハイドロゲルを支持体として培養した角膜内皮細胞シートと、アテロコラーゲンを支持体として培養した角膜内皮細胞シートの透明度を目視で比較した。培養後のアテロコラーゲンは白濁し、透明性が低下しているのに比較して、ゼラチンハイドロゲルシートは培養による透明性の低下は認められなかった(図5)。
ゼラチンハイドロゲル上に培養した角膜内皮細胞は内皮ポンプマーカーNa+/K+−ATPase(図6A)およびタイトジャンクションマーカーであるZO−1(図6B)を発現していた。また走査顕微鏡観察により、内皮細胞に特有の微絨毛が細胞表面に観察された(図6C)。以上のことからゼラチンハイドロゲルシートは角膜内皮細胞の足場として正常な生育をサポートすることが示された。
家兎水晶体摘出術(超音波乳化吸引術)後、デスメ膜を剥離した。その後8mmトレパンにて打ち抜いたゼラチンハイドロゲルシートのみを前房内に移植した。
移植後28日目では、前房内に移植したシートの透明性及び角膜透明性は共に保たれており、虹彩が透見可能であった。また、炎症や浮腫等も認められなかった。
術後28日目にて安楽死させ、眼球摘出後10%中性緩衝ホルマリン液にて化学固定を行った。その後ヘマトキシリン&エオジン染色により角膜組織を観察した(図7(a)移植前、(b)移植後)。角膜組織とゼラチンハイドロゲルシートは良好に接着しており、ゼラチンハイドロゲルによる炎症細胞の遊走・浸潤は認められず、角膜透明性も良好であった。移植前ゼラチンハイドロゲルシートの厚さは約192.7±3.2μm(N=9)であったのに対して、移植後28日目では163.8μm(N=9)に減少し、良好な分解性が確認された。
実施例2の方法に基づき、家兎由来角膜内皮細胞をゼラチンハイドロゲル上で培養し、移植用の培養角膜内皮細胞シートを作製した。作製した培養角膜内皮細胞シートを、角膜内皮を完全に除去した家兎水疱性角膜症モデルに移植を行った。移植後、パキメーターを用いた角膜厚測定及び前眼部観察を行った。
移植後28日目では、前房内に移植したシートの透明性及び角膜透明性は共に良好で、虹彩が透見可能である。前眼部スリット観察により炎症や浮腫等は認められず、またシートの脱落も認められなかった。
移植後7日及び21日における移植眼、非移植眼、正常眼の角膜厚を比較した結果、ゼラチンシートをキャリアに用いて移植した培養角膜内皮細胞は、術後21日において機能しており、角膜厚及び透明性の改善が認められた(図8)。
Claims (15)
- 厚さ10〜200μmのゼラチンハイドロゲルに角膜内皮細胞を含んでなる、角膜移植用シート。
- ゼラチンハイドロゲルが、厚さ30〜100μmである、請求項1に記載の角膜移植用シート。
- ゼラチンハイドロゲルの含水率が92〜99%である、請求項1又は2に記載の角膜移植用シート。
- ゼラチンハイドロゲル内の細胞密度が2000cells/mm2以上である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の角膜移植用シート。
- ZO−1陽性の角膜内皮細胞を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の角膜移植用シート。
- ゼラチンハイドロゲルが、ゼラチンを加熱架橋処理して作製されたものである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の角膜移植用シート。
- ゼラチンハイドロゲルが、移植後生体内で分解されることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の角膜移植用シート。
- ゼラチンハイドロゲルが、移植後、1〜6ヶ月に生体内で分解消失することを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の角膜移植用シート。
- ゼラチンハイドロゲルが、生分解せずに実質組織に生着することを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の角膜移植用シート。
- 角膜内皮細胞が患者由来の細胞である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の角膜移植用シート。
- コラーゲンでコーティングをしたゼラチンハイドロゲルシート上に、角膜内皮細胞を播種して培養することにより得られる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の角膜移植用シート。
- コラーゲンでコーティングをしたゼラチンハイドロゲルシート上に、角膜内皮細胞を播種して培養することを特徴とする、角膜移植用シートの製造方法。
- コラーゲンをゼラチンハイドロゲルシート表面上に塗布する工程を含む、請求項12に記載の方法。
- 角膜内皮細胞がコンフルエントになってから7日目以降に、角膜内皮細胞を含むゼラチンハイドロゲルシートを培養容器から剥離することを特徴とする、請求項12又は13に記載の方法。
- 得られた角膜移植用シートにおけるゼラチンハイドロゲル内の細胞密度が2000cells/mm2以上であることを特徴とする、請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
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