JP2024038337A - 神経再生、骨形成、及び血管新生を刺激するためのヒドロゲル - Google Patents

神経再生、骨形成、及び血管新生を刺激するためのヒドロゲル Download PDF

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Abstract

【課題】本発明は、神経再生、骨形成、及び血管新生の促進に有用なヒドロゲルに関する。【解決手段】本発明の第1の態様は、i)少なくとも1つのアルケニル化残基を含むエラスチン様ポリペプチド、及びii)神経細胞及び/又は内皮細胞を動員することができるペプチド、特にIKVAVペプチドを含むヒドロゲルに関する。【選択図】なし

Description

本発明は、神経再生、骨形成、及び血管新生の促進に有用なヒドロゲルに関する。
再生医療及び組織工学の分野では、骨組織再生という面に関して、今日でも末梢神経系はほとんど考慮されていない。しかし、生物学的、実験的、臨床的なデータは、骨再構築の主要なイベント、すなわち骨の血管新生、骨の神経支配、と骨の新形成との間に相互作用があることを示している。
本発明者らのチームによって得られた最近の生物学的データ(Silvaら、Cell Death and Disease、2017年12月、13;8(12):3209頁)は、感覚ニューロン及び間葉系細胞の二次元共培養モデルによって、これらの二つの細胞タイプ間のコミュニケーションが及ぼす骨形成への影響を実証した。しかし、骨再生に特化した新しい革新的な材料の開発を視野に入れて、実験的にも治療的にもこれらの観察結果を実用化することを可能にする、三次元材料やマトリックスは現在のところ存在しない。
このような状況において、本発明者らは、ニューロン、特に感覚ニューロンを動員することができ、他の細胞タイプ、より詳細には骨形成細胞及び内皮細胞を収容することができる新規なヒドロゲルを開発した。
WO2017021334
Silvaら、Cell Death and Disease、2017年12月、13;8(12):3209頁 Petitdemangeら、Biomacromolecules、2017年2月、13;18(2):544～550頁 Petitdemangeら、Bioconjug Chem.、2017年5月、17;28(5):1403～1412頁 Gilbertら、J Biomed Mater Res 1990、24、1221頁 Wangら、Biochim Biophys Acta 1978、544、555頁 Malinら、Nat Protoc、2007、2、152頁 O'Brienら、Eur J Biochem、2000、267、5421頁
本発明の第1の態様は、
i)少なくとも1つのアルケニル化残基を含むエラスチン様ポリペプチド、及び
ii)神経細胞及び/又は内皮細胞を動員することができるペプチド、特にIKVAVペプチド
を含むヒドロゲルに関する。
特定の一実施形態によれば、本発明に記載のヒドロゲルは、
i)少なくとも1つのアルケニル化残基、特にアルケニル化メチオニンを含むエラスチン様ポリペプチド、
ii)神経細胞及び/又は内皮細胞を動員することができるペプチド、特にIKVAVペプチド、及び
iii)架橋ポリマー、特にチオール末端基を有する架橋ポリマー
を含む。
特定の一実施形態によれば、エラスチン様ポリペプチドは、配列VPGMGの少なくとも1つの出現を含むポリペプチドである。非限定的な方法では、エラスチン様ペプチドは、特に、MGTELAAASEFTHMW[VPGMG]20(ELP20)、MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]5(ELPM20)又はMW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]10(ELPM40)ポリペプチドであり得る。
特定の一実施形態によれば、ペプチドはIKVAVペプチド、特に式Cys-{β-Ala}-Ile-Lys-Val-Ala-Val-{β-Ala}-CysのIKVAVペプチドである。
別の変形では、架橋ポリマー、特にチオール末端基を有する架橋ポリマーは、マルチアームポリマーである。より詳細には、架橋ポリマーは、4アームのポリ(エチレングリコール)、特にチオール末端基を有する4アームのポリ(エチレングリコール)、特に10～30kDaの間の平均分子量を有する4アームのポリ(エチレングリコール)PEG、より詳細には10～30kDaの間の平均分子量を有するチオール末端基を有する4アームを含む4アームのPEGであってもよい。4アームのポリ(エチレングリコール)、特にチオール末端基を有する4アームのポリ(エチレングリコール)は、特に20kDaの平均分子量を有することができる。本発明の文脈では、平均分子量は、質量分子量である。
特定の一実施形態では、チオール末端基を有する架橋ポリマー、アルケニル化メチオニン残基を含むエラスチン様ポリペプチド、及びIKVAVペプチドは、等モルのチオール/アルケン比でヒドロゲル中に存在する。
別の特定の実施形態によれば、ヒドロゲルの濃度は、密度(w/v)で5～15%の間、特に7～8%(w/v)の間である。
別の実施形態では、ヒドロゲルの貯蔵弾性率G'は、1～5の間、好ましくは1～1.5kPaの間である。
本発明に記載のヒドロゲルはまた、少なくとも1つの生物学的活性剤、特に少なくとも1つの成長因子を含んでもよい。
本発明の別の態様は、医薬として使用するための、本出願に記載のヒドロゲルに関する。
別の態様によれば、本発明は、骨の再生方法に使用するための、本出願に記載のヒドロゲルに関する。
更に、本発明は、本出願で定義されたヒドロゲル中で細胞を培養することを含むインビトロ細胞培養方法にも関する。
A)ヒドロゲルの成分及び製造方法の概略図、B)ELPM40+PEGヒドロゲルを示す写真の図である。バー=1mm。 37℃、様々な最終濃度におけるELPM40+PEGヒドロゲルのレオロジー特性の図である。各濃度の弾性率(G')を図に示す。 (A)ELPM40+PEG、(B)ELPM40+25%IKVAV、(C)ELPM40+25%VKAIV、(D)ELPM40+50%IKVAV、(E)ELPM40+50%VKAIVのヒドロゲルの細孔構造を示す、走査型電子顕微鏡の図である。F)細孔サイズの定量化:25%の接着ペプチド組成物は、他の組成物よりも小さい細孔を有する。 プロテイナーゼK(0.5U/mL)で7時間インキュベートした後の溶液中の遊離アミンの定量による、ヒドロゲルの分解のインビトロ分析の図である。 内皮細胞(EC)、骨髄間葉系間質細胞(BMSC)及び感覚ニューロン(SN)の代謝活性を示す図である。すべてのヒドロゲル組成物によって、3種類の細胞の付着及び培養が可能になった。 (A)ELPM40+PEG、(B)ELPM40+25%IKVAV、(C)ELPM40+25%VKAIV、(D)ELPM40+50%IKVAV及び(E)ELPM40+50%VKAIV中での培養後の7日における内皮細胞の形態の図である。すべての組成物において、細胞はヒドロゲル内に侵入して移動し、様々な構造を形成することができた。 (A)ELPM40+PEG、(B)ELPM40+25%IKVAV、(C)ELPM40+25%VKAIV、(D)ELPM40+50%IKVAV及び(E)ELPM40+50%VKAIVに関連するBMSCの図である。細胞は、すべてのヒドロゲル組成物でスフェロイド形態を示す。(F)ELPM40+50%IKVAVヒドロゲルに浸漬された細胞の詳細は、2つの連結した核(白い矢印で示されている)を示し、細胞がゲル内で増殖できることを示唆する。 (A)ELPM40+PEG、(B)ELPM40+25%IKVAV、(C)ELPM40+25%VKAIV、(D)ELPM40+50%IKVAV及び(E)ELPM40+50%VKAIVで培養した感覚ニューロンの形態及び拡散の図である。バーは100μm。(F)すべてのヒドロゲル組成物について測定した神経突起の平均長。 様々なヒドロゲルと組み合わせて、骨形成培地で7日間培養したBMSCにおける遺伝子発現の図である。対照として使用したELPM40+PEG組成物に対して、発現を相対的に示す。 ELPM40+PEG、ELPM40+25%IKVAV、ELPM40+25%VKAIV、ELPM40+50%IKVAV及びELPM40+50%VKAIV組成物中で内皮細胞を7日間培養した後のTek遺伝子発現の図である。 11日後及び26日後のELPM40+50%IKVAV及びELPM40+50%VKAIV組成物の皮下評価の図である。(A)組織学的切片を分析して、i)炎症能(HE)、ii)血管新生を誘導する能力(CD31免疫組織化学)、及びiii)神経支配(チューブリンβIII免疫組織化学(β3T))を決定した。バー=HE及びCD31については50μm。CD31及びβ3T染色の倍率を示し、バー=20μm。(B)ELPM40+50%IKVAV及びELPM40+50%VKAIV組成物の移植領域の周囲に形成された血管の定量化。
本発明は、神経再生、骨形成、及び血管新生を促進することができる生体適合性ヒドロゲルに関する。このヒドロゲルは、少なくとも1つのアルケニル化メチオニン残基を含むエラスチン様ポリペプチド、及び神経細胞及び/又は内皮細胞を動員することができるペプチド、特にIKVAVペプチドを含むことを特徴とする。より詳細には、本発明に記載のヒドロゲルは、i)少なくとも1つのアルケニル化メチオニン残基を含むエラスチン様ポリペプチド、及びii)神経細胞及び/又は内皮細胞を動員することができるペプチド、特にIKVAVペプチド、及びiii)架橋ポリマー、特にチオール末端基を有する架橋ポリマーを含むことを特徴とする。
本発明に記載のヒドロゲルは、特に、チオール末端基を有する架橋ポリマーを用いて形成することができる。本発明の文脈では、「チオール末端基を有する架橋ポリマー」という用語は、ヒドロゲルを形成する前、すなわちエラスチン様ペプチドと接触させる前に、少なくとも1つの遊離SHチオール機能を有するポリマーを意味することが意図される。特定の一実施形態によれば、チオール/アルケン比が等モルである場合、又はチオール/アルケン比が1より大きい場合(アルケンよりも多くのチオールを有する)、ヒドロゲル中のチオール末端基を有するポリマーは、ELPとの反応後、もはや遊離SHチオール機能を有さない。別の実施形態によれば、チオール/アルケン比が1より小さい場合(チオールが欠損又はアルケンが過剰)、ヒドロゲル中のチオール末端基を有するポリマーは、ELPとの反応後に遊離SHチオール機能を有することができる。前記ポリマーは、細胞に対して毒性がないという意味で、生体適合性ヒドロゲルの形成を可能にするポリマーから選択される。また、有利には、細胞に栄養を供給し、細胞の生存を可能にするために、酸素及び栄養、二酸化炭素並びに代謝老廃物の拡散を可能にする。ヒドロゲル溶液のポリマーは、細胞外マトリックスタンパク質のような天然由来のものであってもよく、又はポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリ(オキサゾリン)(POx)若しくはポリ(サルコシン)(PSar)のような合成由来のものであってもよい。一実施形態によれば、架橋ポリマーは、より詳細にはマルチアームポリマー、特に直鎖状ポリマー又は少なくとも3本のアーム、より詳細には少なくとも4本のアームを有するマルチアームポリマーであり、前記マルチアーム直鎖状ポリマーは、その末端の各々にチオール基を含むことができる。したがって、架橋ポリマーは、より詳細にはマルチアームポリマー、特に直鎖状ポリマー又は少なくとも3本のアーム、より詳細には少なくとも4本のアームを有するマルチアームポリマーであってもよく、前記マルチアーム直鎖状ポリマーはその末端の各々にチオール基を含む。特定の一実施形態によれば、マルチアームポリマーは、4アームのポリマーであり、特に、その各アームの末端にチオール基を含むことができる。特に、直鎖状であるか、又は3本若しくは4本のアーム、又は4本以上のアーム、より詳細には4本のアームを含むポリ(エチレングリコール)(又はPEG)タイプのポリマーについて述べてもよい。一実施形態によれば、使用は、直鎖状であるか、又は3本若しくは4本のアーム、又は4本以上のアーム、より詳細には4本のアームを含むポリ(エチレングリコール)(又はPEG)タイプのポリマーであり、直鎖状PEGの各末端はチオール基を含むか、又はマルチアームPEGの各アームはそれぞれの末端にチオール基を含む。一実施形態では、ヒドロゲルは、その末端にチオール基を含む4アームのPEGを含み、前記PEGの平均分子量は、1～100kDaの間、より詳細には10～30kDaの間であり、PEGは、更により詳細には20kDaの平均分子量を有する。
本発明に記載のヒドロゲルの第2の成分は、少なくとも1つのアルケニル化メチオニン残基を含むエラスチン様ポリペプチド(ELP)である。このタイプのポリペプチド、遺伝子工学によってそれらを製造するための方法、及びそれらの精製は、特に国際出願WO2017021334及びPetitdemangeら(Biomacromolecules、2017年2月、13;18(2):544～550頁)及びPetitdemangeら(Bioconjug Chem.、2017年5月、17;28(5):1403～1412頁)の文献を参照することができる当業者に知られている。本発明の文脈において、「アルケニル化メチオニン残基」という用語は、メチオニン残基の側鎖が、アルケン基を含む基、すなわち2つの炭素原子間に少なくとも1つの二重結合を含む基、に共有結合していることを意味する。好ましくは、「アルケン基」という用語は、メチオニン残基に結合した基の中に-CH=CH2基が存在することを表す。特定の一実施形態によれば、メチオニン基は、式(I):
の基に結合している。
一実施形態によれば、式(I)の基によるアルケニル化ELPの合成は、Petitdemangeら(Bioconjug Chem.、2017年5月、17;28(5):1403～1412頁)に記載された手順にしたがって、アリルグリシジルエーテルを使用したメチオニン側鎖における化学選択的チオアルキル化によって実行されうる。
一実施形態によれば、本発明の文脈で使用されるアルケニル化ELPは、メチオニン残基がアルケニル化されているアミノ酸配列VPGMGの少なくとも1つの出現を含む。
一実施例では、アルケニル化ELPは、式(II)
Z-[VPGXG]n-OH (II)
の構造を有し、式中、
Zは、1～20個のアミノ酸を含むペプチドであり、
Xはグリシン残基、バリン残基又はアルケニル化メチオニン残基、特に式(III):
のアルケニル化メチオニン残基を表し、
nは1～200の間の整数であり、より詳細には10～200の間の整数であり、更により詳細には15～50の間の整数であり、特に20～40の間の整数であり、及び
位置Xにおけるバリン/アルケニル化メチオニンのモル比が0:1～10:1の間、より詳細には1:1～5:1の間であり、前記モル比がより詳細には3:1である。
一実施形態によれば、Xは、グリシン残基又はアルケニル化メチオニン残基、特に式(III)のアルケニル化メチオニン残基を表す。
好ましい別の実施形態によれば、Xは、バリン残基又はアルケニル化メチオニン残基、特に式(III)のアルケニル化メチオニン残基を表す。
一実施形態によれば、nは、30～50の間、特に35～45の間を構成する整数であり、nは、より詳細には35、36、37、38、39、40、41、42、43、44又は45に等しい。より詳細には、nは40に等しい。
特定の一実施形態によれば、Zは、アミノ末端のアミノ酸残基がメチオニンであるペプチドである。
特定の一実施形態によれば、Zは、アミノ酸配列IKVAVを含まない。
別の実施形態によれば、[VPGXG]nユニットのすぐ上流のZに含まれるアミノ酸は、MWジペプチドに相当する。Zは、特に、MWジペプチドから構成されるか、又はこのジペプチドを含むことができる。例示のために、以下に記載するELP20ペプチドは、MWジペプチドが配列MGTELAAASEFTHMWのC末端にある配列Zを含む。
一実施形態によれば、用いられるELPは、式Z-[VPGXG]nのペプチドであり、式中、Xはアルケニル化メチオニンである。
別の実施形態によれば、用いられるELPは、式Z-[VPGXG]nのペプチドであり、式中、位置Xにおけるバリン/アルケニル化メチオニンのモル比が0:1～10:1の間、より詳細には1:1～5:1の間であり、前記モル比は、より詳細には3:1である。
別の実施形態によれば、用いられるELPは、式Z-[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]x、特にMW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]xのペプチドであり、式中、xは2～15の間、より詳細には5～10の間に含まれる整数である。
一実施形態によれば、用いられるELPは、WO2017021334に記載のペプチドMGTELAAASEFTHMW[VPGMG]20(ELP20)、ペプチドMW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]5(ELPM20)、又はペプチドMW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]10(ELPM40)から選択されるペプチドに由来し、前記ペプチドは、少なくとも1つのアルケニル化メチオニン残基を含む。
一実施形態によれば、ELPは、以下の構造:
を有し、
より詳細には、構造MW[VPGVGVPGMaG(VPGVG)2]10(ELP-M(アルケン)-40)であり、式中、Maは上記式(III)のアルケニル化メチオニン残基を表す。
上記のすべてのELPの一変形実施形態によれば、前記ELPのアミノ末端メチオニンは、アルケニル化メチオニン、特に上記式(III)のアルケニル化メチオニンである。例示として、ELPは、特に以下の構造:
を有することができる。
一実施形態では、この構造は、以下の式:
にしたがって代替的に表すことができる。
ヒドロゲルの成分iii)は、神経細胞及び/又は内皮細胞を動員することができるペプチドである。内皮細胞を動員することができるペプチドとして、フィブロネクチン由来のペプチドREDV、RGD及びGRGDSP、ラミニン由来のペプチドIKLLI、IKVAV、PDSGR及びYIGSR、並びにコラーゲンタイプI由来のペプチドDGEAを特に挙げることができる。神経細胞を動員することができるペプチドとして、ラミニン由来のペプチドYIGSR、RNIAEIIKDI及びIKVAVを特に挙げることができる。特定の一実施形態によれば、神経細胞及び/又は内皮細胞を動員することができるペプチドは、IKVAVペプチド、すなわちラミニンA由来のアミノ酸配列IKVAVを含むペプチドである。特定の一実施形態では、本発明のヒドロゲルに含まれる神経細胞及び/又は内皮細胞を動員することができるペプチドは、ペプチド、特に配列IKVAVを含むペプチドであり、その各末端にシステイン残基を含む。システイン残基は、アミノ酸配列IKVAVに直接共有結合されるか、又はスペーサーによって結合されうる。特定の一実施形態によれば、システイン残基は、神経細胞及び/又は内皮細胞を動員することができるペプチド、特にIKVAVペプチドに、スペーサー、特にペプチドスペーサー又は擬似ペプチドスペーサーを介して結合される。スペーサーは、特に、アミノ酸又はアミノ酸配列(特にジペプチド又はトリペプチド)、特にβアミノ酸、より詳細にはβ-Alaアミノ酸でありうる。したがって、特定の一実施形態によれば、神経細胞及び/又は内皮細胞を動員することができるペプチドは、式Cys-{スペーサー}-Ile-Lys-Val-Ala-Val-{スペーサー}-CysのIKVAVペプチド、特に式Cys-{β-Ala}-Ile-Lys-Val-Ala-Val-{β-Ala}-Cysのペプチドである。
ヒドロゲルの成分の量は、得られたヒドロゲルが神経再生、骨形成及び/又は血管新生を促進することを条件として、大きく変化しうる。特定の一実施形態によれば、様々な成分は、10:1～1:10の間、特に5:1～1:5の間、特に2:1～1:2の間のチオール/アルケンモル比を考慮する量である。特定の一実施形態によれば、チオール/アルケン比は、等モルである(すなわち、1:1のモル比に相当する)。チオール基は、架橋ポリマー及び/又は神経細胞及び/又は内皮細胞を動員することができるペプチド、特に上述したようなIKVAVペプチド上に存在することが理解されるべきである。したがって、ヒドロゲルは、上記で定義された比率を考慮しながら、その各成分の可変量を含むことができる。例えば、IKVAVペプチドによって担持されるチオール基は、IKVAVペプチド及び架橋ポリマーによって提供される全チオール基の10～75mol%の間、より詳細には20～60mol%の間、特にIKVAVペプチド及び架橋ポリマーによって提供される全チオール基の25～50mol%の間で表すことができる。特定の一実施形態によれば、IKVAVペプチドによって担持されるチオール基は、IKVAVペプチド及び架橋ポリマーによって提供される全チオール基の25mol%を表す。別の特定の実施形態によれば、IKVAVペプチドによって担持されるチオール基は、IKVAVペプチド及び架橋ポリマーによって提供される全チオール基の50mol%を表す。
ヒドロゲルの成分の割合は、細胞、特に神経細胞、骨細胞又は内皮細胞、特に神経細胞の発達に適したレオロジー特性を有するヒドロゲルを得るようにも選択される。したがって、本発明により、発達が促進されなければならない細胞のタイプに、ヒドロゲルの構造を非常に細かく調整することができる。一実施形態によれば、ヒドロゲルの剛性は、以下の範囲、1kPa<G'<5kPa、特に1kPa<G'<1.5kPaに含まれる貯蔵弾性率G'パラメータに相当する。
別の特定の実施形態によれば、ヒドロゲルの濃度は、密度(w/v)で約5～約15%の間、特に約7～約8%(w/v)の間であり、この密度は、より詳細には約7.5%(w/v)に等しい。
更に、本発明に記載のヒドロゲルは、微細孔性を有し、特に5～20μmの間、より詳細には10～17μmの間の範囲の平均サイズの孔を含むことができる。
特定の一実施形態によれば、本発明のヒドロゲルは、1つ又は複数の他の要素、他の機能を標的とするための他のペプチド配列、又は成長因子のような生理活性剤、特に神経再生、骨形成及び/又は血管新生を更に刺激するためのものを含んでいてもよい。しかし、特定の一実施形態によれば、ヒドロゲルは、成長因子を欠いているか、又はヒドロゲルの総質量に対して0～10質量%、ヒドロゲルの質量に対して、より詳細には0～5質量%、更により詳細には0～1質量%、特に0～0.1質量%の量でしか成長因子を含んでいない。以下に見られるように、ヒドロゲルはまた、細胞治療用担体として使用することができる。したがって、上記で定義したようなヒドロゲルはまた、治療上の目的の細胞、例えば幹細胞、特に目的の系統に向かって誘導された幹細胞、造血幹細胞、骨髄又は脂肪組織由来の間葉系間質幹細胞、神経系幹細胞、又は細胞コミュニケーションプロセスを刺激するための異なる系統の細胞の混合物を含むことができる。特定の一実施形態では、細胞は、ヒト胚性幹細胞を除外した幹細胞である。細胞は、前記ヒドロゲルの形成後にヒドロゲルに導入され、細胞をヒドロゲルと接触させ、十分な時間(特に、少なくとも1、2、3、4、5、6、又は少なくとも7日間)培養することによって、細胞はヒドロゲルでコロニー形成することができる。
本発明に記載のヒドロゲルはまた、ヒドロゲルの骨形成能を増加させるために、ミネラル成分、特にヒドロキシアパタイト又はリン酸カルシウムのナノ粒子を(特に10～40%(w/v)の間の量で)含むことができる。
本発明のヒドロゲルは、これらの様々な成分i)～iii)と、成長因子等の任意の他の要素とを混合することにより製造されうる。成分i)～iii)及びこれらの成分i)～iii)の量は、その使用者が対処する問題に適した物理的特性及び支持体特性を有するヒドロゲルを調製するために選択される。有利には、架橋によるヒドロゲルの形成は、温度やpHの変更等の刺激の作用下で、又は架橋剤、特に感光性架橋剤(又は光開始剤)を用いて行われる。説明のために、特に混合物中に0.5%(w/v)の密度で使用され、紫外-可視光(λ=305～405nm、特に305nm)によって活性化された、Irgacure 2959化合物のような光開始剤による光重合の誘導を特に挙げてもよい。別の変形では、光開始剤は、特に、リチウムフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィネート(LAP)及びリボフラビンから選択することができる。LAP濃度は、混合物中に0.005%～0.5%(w/v)の範囲であり、その光開始は、365～475nmの間の波長で誘引されうる。
一態様によれば、本発明は、以下のステップ、
(a)
i)少なくとも1つのアルケニル化メチオニン残基を含むエラスチン様ポリペプチド及び
ii)神経細胞及び/又は内皮細胞を動員することができるペプチド、特にIKVAVペプチド、及び
必要に応じて(iii)チオール末端基を有する架橋ポリマー;及び
iv)重合開始剤、特に光開始剤(及び必要に応じて1つ又は複数の成長因子のような別の成分)
を混合するステップ、及び
b)重合を活性化させるために、刺激、特に光照射、特に紫外線照射を適用するステップ
を含む方法によって入手可能な、又は得られたヒドロゲルに関する。
有利には、上記に示されるように、ヒドロゲルのレオロジー特性を非常に細かく定義することができる。更に、本発明者らは、本発明に記載のヒドロゲルが分解可能であり、細孔構造を有することを示すことができた。最後に、本発明者らは、このヒドロゲルが、非常に異なる細胞タイプ、すなわち、ニューロン、間葉系細胞、骨細胞、内皮細胞又はそれらの前駆細胞の培養に適していること、これらの細胞がヒドロゲルの構造内で移動可能であること、及び細胞毒性効果を有さないことを実証することができた。したがって、組織再生に適したツールの開発に有用なすべての有利な特性を兼ね備えている。
したがって、本発明に記載のヒドロゲルは、様々な細胞タイプのインビトロ培養を効果的に支持することができる。その結果、特定の一実施形態によれば、本発明は、骨再生を目的とした様々な細胞、特に神経細胞、骨細胞又は内皮細胞をインビトロで収容可能な新規の三次元支持体に関する。したがって、本発明は、当業者に、細胞を有利な環境で成長させるだけでなく、様々な細胞タイプの相互作用を互いに研究することを可能にする、特に有利な三次元細胞培養システムを提供する。このパラメータは、様々な細胞タイプ間の複雑な対話を必要とし得る再生現象を研究するために重要である。本発明の支持体は、特に、骨形成細胞及び内皮細胞を収容するために使用することができ、及び、上記で定義したように支持体中で細胞を培養することを含むインビトロ細胞培養法において、血管新生、骨形成及び神経再生効果を研究するために使用することができる。本発明に記載の支持体の使用は、更に、細胞の成長、静止状態の誘導、細胞死の誘導、タンパク質分泌の誘導、若しくは他の分子の誘導、若しくはイオンの誘導(特にカルシウムイオン、カリウムイオン)、又は特定の遺伝子の発現等の1つ又は複数のパラメータ及び細胞応答に対するその効果を決定するために、成長因子又は生物学的効果を有するか、又は生物学的効果を有する可能性がある他の任意の薬剤(候補薬剤)のような薬剤を培養に添加することを含むことができる。
別の態様によれば、本発明のヒドロゲルは、治療方法、特にインプラントとして使用される。ヒドロゲルは、特に、再生医療の治療方法において使用される。特に、組織、特に骨組織の神経支配を刺激するために使用することができ、特に骨工学において使用することができる。有利には、本発明に記載のヒドロゲルは、特に再生の状況では、神経再生を促進する。より詳細には、本発明に記載のヒドロゲルは、有利には、感覚神経系の動員及び刺激、より詳細には骨の再生を促進するために使用することができる。本発明に記載のヒドロゲルは、組織の血管化及び神経支配を最適化又は回復するためにも用いることができる。
別の実施形態によれば、ヒドロゲルは、細胞治療用担体として使用することができる。したがって、上記で定義したようなヒドロゲルは、治療上の目的の細胞、例えば幹細胞、特に目的の系統に向かって誘導された幹細胞、造血幹細胞、骨髄又は脂肪組織由来の間葉系間質幹細胞、神経系幹細胞、又は異なる系統の細胞の混合物を用いてあらかじめコロニー形成される。このようなヒドロゲルは、細胞又は組織の再生による治療方法に用いることができる。
本発明に記載のヒドロゲルは、インプラントシステムを改変するために、その生体適合性及びその統合を改善するためにも使用されてもよい。
ELP-M(アルケン)-40ペプチドの製造
Petitdemangeらの論文(Biomacromolecules、2017年2月、13;18(2):544～550頁、doi:10.1021/acs.biomac.6b01696.Epub 2017 Jan 27.PubMed PMID:28075561)は、MX[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]10ペプチド(ELPM40)の発現ベクターの構築、大腸菌(E. coli)での発現、細菌ライセートからの単離、精製、特徴付けについて記載している。
アリルグリシジルエーテルを用いたELPM40ペプチドのメチオニン側鎖の化学選択的チオアルキル化による、
の構造を有するELP-M(アルケン)-40ペプチドの製造方法は、Petitdemangeら(Bioconjug Chem.、2017年5月、17;28(5):1403～1412頁、doi:10.1021/acs.bioconjchem.7b00082.Epub 2017 Apr 18.PubMed PMID:28381088)に記載されている。
実験の節の残りの部分では、ELP-M(アルケン)-40ペプチドを示すためにELPM40という用語を使用する。
複合ヒドロゲルの開発
ヒドロゲルの製造
製造されたヒドロゲルは、ELPM40ペプチド、チオール末端基を有するPEG(SH-PEG、20kDa.JenKem社、米国)及びCys-{β-Ala}-Ile-Lys-Val-Ala-Val-{β-Ala}-Cys(IKVAV)接着ペプチド又はランダム化されたバージョンのCys-{β-Ala}-Val-Lys-Ala-Ile-Val-{β-Ala}-Cys(VKAIV)を、等モルのチオ/アルケン比で含有する。光重合は、Irgacure 2959光開始剤(0.5% w/v)を用いて、305nmの波長を持つ紫外光を8分間照射し、チオール-エン反応を行った。このようにして得られたヒドロゲルの略図を図1に示す。
ELPとPEGの様々な質量比を、最適な剛性、及び感覚ニューロンの付着、及び神経突起の伸長を得るために試験した。簡単に言えば、SH-PEGを様々な割合で接着ペプチドに置換した。試験した組成物は以下の通りである。
(i)ELPM40+PEG、チオール基の100%(mol)がSH-PEGで表される、
(ii)ELPM40+25%IKVAV又はVKAIV、チオール基の25%(mol)が接着ペプチドで表される、
(iii)ELPM40+50%IKVAV又はVKAIV、チオール基の50%(mol)が接着ペプチドで表される。
レオロジー特性
ヒドロゲルのレオロジー特性を、PBSに24時間浸漬した後、弾性係数(G')と損失係数(G'')の周波数依存性を測定することにより評価した。周波数掃引は、ELPM40+PEG組成物の様々なヒドロゲル濃度、すなわち5%、7.5%、10%、15%(w/v)で実施した。測定は37℃で行った。
弾性率がヒドロゲルの最終濃度に比例して増加することを示すことができた(図2)。
走査型電子顕微鏡による構造解析
走査型電子顕微鏡による解析を行い、様々な濃度で製造されたヒドロゲルの細孔径を決定し、その構造を可視化した。
すべてのヒドロゲル組成物は、細孔構造を有し(図3A～図3E)、細孔サイズは10.49±1.61μm(ELPM40+25%IKVAV)から16.39±2.81μm(ELPM40+50%IKVAV)までの範囲である。25%の接着ペプチドを含むヒドロゲル組成物は、他の条件で得られた組成物と比較して、より小さい細孔サイズを有する(図3F)。
ヒドロゲルのインビトロでの分解解析
15μLのヒドロゲルを、1mM EDTA、5mM CaCl2及び0.5%(v/v) Triton X-100(pH 8.0)を含む50mM Tris塩基緩衝液の150μLのプロテイナーゼK溶液(0.5U/mL)(Amresco社、#0706)中、37℃で7時間インキュベートした。アミノ酸1000個あたりの遊離アミン基の数(n/1000)で表される遊離アミン基の含有量は、Gilbertら、J Biomed Mater Res 1990、24、1221頁に記載されている手順にしたがって、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)を用いて決定した。遊離アミン基の含有量は、トリニトロフェニルリジンのモル吸光係数14600L/mol/cmを用いて計算した(Wangら、Biochim Biophys Acta、1978、544、555頁)。
プロテイナーゼKでインキュベートした後、溶液中の遊離1級アミンがすべてのヒドロゲル組成物で検出され(図4)、これは、架橋プロセスがインビトロでの分解特性を妨げなかったことを示している。これは、生物医学的用途を有する材料にとって重要な特性である。様々な細胞タイプがヒドロゲルの構造内に入り込み、その中で移動することが可能でなければならない。最も一般的な細胞の移動メカニズムは、遅い速度でヒドロゲル構造を消化するプロテアーゼの分泌であり、それによって細胞によるヒドロゲルのコロニー化が可能になる。
初代細胞を用いた生物学的評価
細胞の単離と培養
初代感覚ニューロン(SN)は、Malinら、Nat Protoc、2007、2、152頁に記載されている手順にしたがって、6週齢～10週齢のWistarラットの後根神経節(DRG)から得た。
骨髄由来間葉系間質細胞(BMSC)を6～10週齢のWistarラットから単離した。簡潔に言うと、動物の大腿骨と脛骨を摘出し、その端を切断して骨髄を露出させた。骨を1.5mLのチューブに移し、次いで1500×gで30秒間遠心分離して骨髄を取り出した。得られたペレットを、10%(v/v)のウシ胎仔血清(PANTM-Biotech社、Aidenbach、Germany)と1%(v/v)のペニシリン/ストレプトマイシンを添加した低グルコース含量のDMEM(Gibco社)に再懸濁し、16G及び21Gの針を4～6回通過させた。次に、大腿骨及び脛骨から得られた内容物を75cm2のフラスコに播種し、加湿したインキュベーター(37℃、5%CO2)で培養した。培養液は、非付着細胞を除去するために週に2回交換した。付着細胞は、90%の培養密度まで培養した後、より大きな表面積を有する容器に移した。この細胞は、継代P3まで使用した。BMSCをヒドロゲルと合わせる際に、10-9Mのデキサメタゾン(Sigma-Aldrich社)、10mMのβ-グリセロリン酸(Sigma-Aldrich社)、及び50μg/mLのアスコルビン酸(Sigma-Aldrich社)を添加した上述の培地に相当する骨形成培地で培養した。
骨髄由来の内皮幹細胞(EC)は、Cell Biologics社(カタログ番号RA-6221)から入手した。細胞をEGM-2 MV培地(Lonza-Verviers社、France)中で、キットのすべてのサプリメント及び5%(v/v)のウシ胎仔血清(Gibco Life Technologies社、Karlsruhe、Germany)を含むゼラチン(2%)でコーティングされたプレート上で培養し、5%のCO2を含む湿潤雰囲気下、37℃でインキュベートした。90%の培養密度に達した時、細胞をゼラチン(2%)でコーティングした別のプレート上に移した。
組織工学上の利点があるため、3つの細胞タイプ:i)骨芽細胞分化能を有するBMSC、(ii)血管新生における主要な役割を有するEC、及び(iii)神経組織の付着能力を実証し、ヒドロゲル中での神経突起の成長を可能にするための感覚ニューロンを本発明のヒドロゲル上で研究した。
各細胞タイプは、本発明のヒドロゲル中で培養する前に特徴づけられた。
ヒドロゲル中の各細胞タイプの細胞代謝活性
細胞の代謝活性は、レサズリンの使用に基づく試験を用いて決定した(O'Brienら、Eur J Biochem、2000、267、5421頁)。簡潔に言うと、細胞を、96ウェルプレートに20000細胞/cm2の密度で7.5%(w/v)のヒドロゲル中に播種した。レサズリン(0.01mg/mL)を含む細胞培地150μLを各ウェルに添加し、マイクロプレートを37℃で3時間インキュベートした。次いで、上清100μLを別の96ウェルマイクロプレートに移し、蛍光を測定した(exc=530nm、em=590nm、Victor X3、Perkin Elmer社)。代謝活性は、4日目及び7日目に測定した(n=5)。
図5は、得られた結果を示す。ヒドロゲルによって、細胞毒性がなく、試験した様々な初代細胞の付着及び培養が可能になった。ECについては、ELPM40+25%IKVAVヒドロゲルでは、対応するランダムペプチド対照と比較して、代謝活性が大きかった。SNについては、ELPM40+50%IKVAVヒドロゲルは、ELPM40+PEG組成物と比較して、より大きな代謝活性を誘導した。
PEGに連結された別のELP配列を含むヒドロゲルは、マウスの皮下に移植しても炎症反応を誘発しないことが他の実験でも示された。
細胞を含むヒドロゲルの共焦点顕微鏡観察
BMSC、EC及びSN細胞を20000細胞/cm2の濃度でヒドロゲル中に播種し、7日間培養した。
培養後、SNを4%(w/v)のホルムアルデヒドで4℃、30分間固定し、0.1%(v/v)のtriton X-100を4℃で30分間透過させ、1%(w/v)のBSAで1時間ブロッキングした。細胞の検出には抗βIIIチューブリン一次抗体を用いた。BMSC及びECについては、アクチンフィラメントをAlexa Fluor 568と結合したファロイジンで標識した。SNの形態は共焦点顕微鏡(SPE、Leica Microsystems社)を用いて可視化した。神経突起の長さは、ImageJソフトウェアを用いて、「simple neurite tracer」ツールを用いて定量化した。神経細胞体から可視末端までのパスをトレースすることによって神経突起を測定し、次いで、長さをμmに変換した。
培養7日後、ECはヒドロゲルに侵入し、そこに安定した分岐構造を形成した(図6)。これらの構造は、血管化した組織への酸素と栄養素の送達に重要である。ELPM40+50%IKVAVヒドロゲル、及びランダムペプチドを含む2つの組成物において、分岐構造が形成されていることを観察することができた。接着ペプチドのランダム配列は、IKVAVペプチドと同様の接着機能を有していないが、ランダムペプチドを含むヒドロゲル組成物では、ELPM40+50%IKVAV組成物と比較して、形態学的な違いは観察されなかった。この現象は、リジン残基による正電荷の増加によるものである可能性がある。
BMSCをヒドロゲルに結合させると、すべての組成物でスフェロイド状の凝集体に成長した(図7)。我々の研究は、ELPM40+50%IKVAV組成物について、いくつかのBMSCがヒドロゲルの構造に入り、分岐を形成したことを示している。いくつかの細胞は二核性であり、二つの核の間に個別の接続があり、細胞がゲル内で分裂できることを示唆していた(図7F)。
SNに関しては、細胞はヒドロゲル組成物によって異なる挙動を示した(図8)。ELPM40+PEGでは、細胞はより大きな凝集体を形成し、神経突起はヒドロゲルの構造中に分散するのではなく、細胞体を取り囲んでいた(図8A)。IKVAV配列がヒドロゲル組成物に添加されると、神経突起は拡散することができる。ELPM40+50%のIKVAV組成物では、細胞は、他の組成物と比較して、神経突起の広大で分岐した複雑なネットワークを有する、より分散した分布を採用した(図8D)。神経突起の長さの測定は、この形態学的観察を立証する。実際に、ELPM40+50%IKVAV組成物中で培養したSNは、より長い神経突起を形成することができた(図8F)。
重要なことは、本研究で使用した培地には成長因子(特にNGF)が含まれていないことで、これはヒドロゲルが神経突起の構造と拡張に与える具体的な影響を分析するためであるからである。その結果、ELPM40+50%IKVAV組成物の平均神経突起長は266.44±63.95μmであり、これは、培地にNGFを添加した2次元で実施した他の研究で測定されたものと同等であった。
ヒドロゲル中のBMSCに発現した骨特異的マーカーの分子解析
RNeasy(登録商標)Plus Micro Kit(Qiagen社、Hilden、Germany)を用いて、製造業社のプロトコールにしたがってBMSCから全RNAを抽出した。4ウェルから得られた100ngの全RNAを、Maxima Reverse Transcriptaseキット(Thermo Scientific(商標)、Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA、USA)を用いて、製造業社のプロトコールにしたがってcDNAに逆転写した。RT-PCR反応は、CFX Connect(商標)Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad Laboratories社、Hercules、CA、USA)を用いて実行し、CFX Manager(商標)ソフトウェア、バージョン3.0(Bio-Rad Laboratories社)を用いて解析した。使用したプライマーは以下の通りである(配列番号1～12)、Runx2 F: 5’CCTTCCCTCCGAGACCCTAA 3'及びR: 5’ATGGCTGCTCCCTTCTGAAC 3'、Sp7 F: 5’TGCTTGAGGAAGAAGCTCACTA 3'及びR: 5’GGGGCTGAAAGGTCAGTGTA 3'、Ctnnb1 (βcat) F: 5’GAAAATGCTTGGGTCGCCAG 3'及びR: 5’CGCACTGCCATTTTAGCTCC 3'、Bsp1 (Opn) F: 5’GAGTTTGGCAGCTCAGAGGA 3'及びR: TCTGCTTCTGAGATGGGTCA 3'、Smad1 F: 5’ATGGACACGAACATGACGAA 3'及びR: 5’GCACCAGTGTTTTGGTTCCT 3'、Rplp0 F: 5’CACTGGCTGAAAAGGTCAAGG 3'及び5’GTGTGAGGGGCTTAGTCGAA 3'、及びTek F: 5’CCACAGATAGAGGATTTGCCAG 3'及びR: 5’AAGTCATTTGGTTGGAGCACTG 3'。
閾値サイクル(Ct)値を用いて発現を定量化し、2-DDCt法にしたがってmRNA発現レベルを算出した。
ヒドロゲル組成物がBMSCの骨形成分化を助けることができるかどうかを調べるために、骨形成シグナル伝達経路の引き金となる遺伝子(Smad1とβcat)と同様に、初期分化の骨形成マーカー(Runx2及びSp7)と後期分化の骨形成マーカー(Opn)のグループを解析した。更に、骨修復過程の鍵となる因子であり、血管新生を誘導するvegfaと骨芽細胞分化を誘導するbmp2をそれぞれ解析した(図9)。
骨形成培地で7日間培養した後、ELPM40+PEGと比較してELPM40+50%IKVAV組成物ではRunx2及びSp7発現の増加が観察され、ELPM40+50%IKVAV組成物ではランダムペプチド対照と比較してOpn発現が増加している(図9)。骨形成分化を誘発し得るシグナル伝達経路を分析したところ、Smad1及びβcatの発現は、ELPM40+PEGと比較してELPM40+50%IKVAV組成物において増加しており、2つのシグナル伝達経路がこれらのヒドロゲルに関連したBMSCの分化において役割を果たしていることが示唆された。したがって、これらの結果は、ELPペプチドがBMSC骨形成を促進する非常に良好な基質であり得ることを示している。更に、本研究で試験したすべての遺伝子の発現レベルは、IKVAVペプチドの濃度に対して用量依存的に増加した。骨形成分化の様々な段階で直接的に引き金となって作用する遺伝子の過剰発現は、骨形成系統へのBMSCの分化におけるELPM40+50%IKVAV組成物の役割を支持するものである。Vegfa血管新生因子の発現は、ELPM40+PEG又はELPM40+50%VKAIVと比較して、ELPM40+50%IKVAV組成物で増加した。Bmp2発現は、ELPM40+25%IKVAVの存在下で増加した。興味深いことに、研究したすべての遺伝子の発現は、ELPM40+PEG組成物と比較してELPM40+50%IKVAV組成物で増加し、この増加はIKVAV濃度に比例した。
本発明のヒドロゲルの血管新生促進能を決定するために、ラット骨髄初代内皮細胞を様々なヒドロゲル組成物中で培養した。培養7日後、血管形成中に役割を果たすTekの発現を評価した(図10)。PEG又はランダムVKAIVペプチドを含む組成物と比較して、50%のIKVAVを含む組成物では、Tekの過剰発現が観察された(p<0.05)。
最終的に、ELPM40+50%IKVAV又はVKAIV組成物を皮下に移植した(図11)。どちらも、多核巨細胞の非存在によって示されるように、主要な炎症シグナルを誘発しなかった。移植部位周辺の血管を定量したところ、移植26日後にIKVAVを含む組成物ではVKAIVペプチドを含む組成物と比較してより高い血管密度が観察され、血管密度は時間の経過とともに増加した。これらの結果は、インビトロで得られたデータ及び内皮細胞遺伝子の発現によって支持され、IKVAVを50%含む組成物におけるTekの発現の増加を示している。
結論として、ELP-M(アルケン)-40、SH-PEG及びIKVAV接着配列を含む合成ペプチドに基づく機能性ヒドロゲルを製造した。これらのヒドロゲルは、細かく適応可能なレオロジー特性を有するという利点を有している。本研究の必要性から、選択されたヒドロゲルは、SNの成長に適した質量濃度を有している。更に、これらのゲルはインビトロで分解可能であり、細孔構造を有している。
生物学的評価の結果、本発明のヒドロゲルはEC、BMSC及びSN細胞の培養を助け、7日間の培養後、これらの細胞はヒドロゲル構造体内を移動することができ、ヒドロゲルの細胞毒性は観察されないことが示された。血管新生能に関しては,接着ペプチドを50%含有する組成物中でECは安定した分岐構造を形成することができた。骨形成能に関しては、すべての組成物においてBMSCの形態はスフェロイド組織型であり、ELPM40+50%IKVAV組成物中で培養した場合、骨形成分化に重要な遺伝子のセットが過剰に発現していた。最後に、神経再生能に関しては、ELPM40+50%IKVAV組成物で培養したSNは、より複雑な神経突起ネットワークとより長い神経突起長を示し、後者は神経突起拡張を促進することが知られている成長因子であるNGFを添加した培地で行った他の神経突起培養で得られたものと同程度であった。
他の細胞因子又は成長因子の存在なしに血管新生、骨形成及び神経再生を可能にする最初に開発された支持体である特定のヒドロゲルに基づいた提案された戦略が、生物医学的用途のための有利な特性を示すことを、本出願で提示されたデータは示している。

Claims (15)

  1. i)少なくとも1つのアルケニル化残基を含むエラスチン様ポリペプチド、及び
    ii)神経細胞及び/又は内皮細胞を動員することができるペプチド
    を含むヒドロゲル。
  2. iii)ヒドロゲルの形成前に、チオール末端基を有する架橋ポリマー
    も含む、請求項1に記載のヒドロゲル。
  3. ペプチドii)がIKVAVペプチド、特に式Cys-{β-Ala}-Ile-Lys-Val-Ala-Val-{β-Ala}-Cysのペプチドである、請求項1又は2に記載のヒドロゲル。
  4. エラスチン様ポリペプチドが、VPGMG配列の少なくとも1つの出現を含むポリペプチドであることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載のヒドロゲル。
  5. エラスチン様ポリペプチドがMGTELAAASEFTHMW[VPGMG]20(ELP20)ポリペプチド、MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]5(ELPM20)ポリペプチド又はMW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]10(ELPM40)ポリペプチドであることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載のヒドロゲル。
  6. チオール末端基を有する架橋ポリマーがマルチアームポリマーであることを特徴とする請求項2から5のいずれか一項に記載のヒドロゲル。
  7. 架橋ポリマーが、チオール末端基を有する4アームのポリ(エチレングリコール)であり、特に質量平均分子量が10～30kDaの間、特に質量平均分子量が20kDaであることを特徴とする、請求項2から6のいずれか一項に記載のヒドロゲル。
  8. チオール末端基を有する架橋ポリマー、アルケニル化メチオニン残基を含むエラスチン様ポリペプチド、及びIKVAVペプチドが、等モルのチオール/アルケン比で存在することを特徴とする、請求項2から7のいずれか一項に記載のヒドロゲル。
  9. ヒドロゲルの濃度が、密度(w/v)で5～15%の間、特に7～8%(w/v)の間であることを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載のヒドロゲル。
  10. ヒドロゲルの貯蔵弾性率G'が1～1.5kPaの間であることを特徴とする、請求項1から9のいずれか一項に記載のヒドロゲル。
  11. 少なくとも1つの生物学的活性剤、特に少なくとも1つの成長因子も含む、請求項1から9のいずれか一項に記載のヒドロゲル。
  12. 請求項1から11のいずれか一項に記載のヒドロゲルを含むことを特徴とする、目的の細胞を収容可能な三次元支持体。
  13. 医薬として使用するための、請求項1から11のいずれか一項に記載のヒドロゲル又は請求項12に記載の支持体。
  14. 骨の再生方法に使用するための請求項1から11のいずれか一項に記載のヒドロゲル又は請求項12に記載の支持体。
  15. 請求項1から11のいずれか一項に規定のヒドロゲル中、又は請求項12に記載の支持体中で細胞を培養することを含むインビトロ細胞培養方法。
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