CN107652453B - 接枝rgd短肽温敏可注射水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶及其制备方法和应用。该可注射水凝胶主要由聚合后具有温敏性的单体、含有羧基基团的单体、RGD短肽先后通过共聚反应、脱水酯化反应、无铜点击化学制备短肽功能化聚合物，经过与细胞共混，制得含有细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶。利用可注射水凝胶的温敏特性，达到溶胶‑凝胶的相转变，以及短肽的生物活性及其配体识别位点特征，促进细胞在可注射水凝胶支架内部的黏附、增殖和基因的特异性表达。本发明的可注射水凝胶具有优异的促细胞黏附、增殖特性、可控的温敏性、可逆的可注射性、细胞可释放功能。可用于可注射细胞支架、药物控释、组织再生修复、肿瘤治疗等领域。

Description

接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于高分子化学、生物医用材料和组织工程技术领域，具体涉及接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
可注射水凝胶是指在注射前为流动液态，注射到体内，可原位凝胶化的水凝胶。作为一种新型的生物医用材料，可注射水凝胶具有许多其他生物材料无法比拟的优点：1)可通过非侵入方式移植到体内，避免高创性外科手术；2)活细胞、蛋白质、药物或者其他生物活性物质可通过与凝胶前体混合，实现均匀包裹；3)与预成型支架相比，与周围组织衔接紧密，可用于填充任何形状的缺损，修复形状复杂的组织，大大降低植入对机体组织的侵入性，且能与各种治疗药物混合。由此避免了外科手术的高度创伤性，简化治疗过程、减少病人痛苦、降低医疗费用。因此在生物活性分子控释、细胞包埋以及组织支架材料等方面有着广泛的应用前景。
根据形成原理，可注射水凝胶可分为化学交联水凝胶和物理交联水凝胶两大类。化学交联水凝胶可分为交联剂交联、辐射交联、光引发交联等类型；物理交联水凝胶可分为温敏性水凝胶和分子自组装水凝胶等类型。由于温敏性可注射水凝胶在水中经过简单的相转变(溶胶-凝胶转变)形成水凝胶，不需要任何化学反应，因而在体内更简单、更安全、且具有可逆性。
目前用于药物凝胶剂型及组织工程的温敏性可注射水凝胶主要有聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇(PEG-PPG-PEG)、聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯(PCL-PEG-PCL)等类型的嵌段共聚物，这类嵌段共聚物分子链由于同时具有疏水性基团和亲水性基团，在温度变化时，亲疏水性主导作用发生转变，在较低温度(低临界相转变温度)以下呈溶胶状，在注射体内后随温度升高，发生溶胶-凝胶转变。中国专利CN102827446A公开了一种温度响应型可注射水凝胶及其制备方法和用途，该可注射水凝胶主要由胆固醇-聚乙二醇-胆固醇(CHOL-PEG-CHOL)三嵌段化合物与氨基化β-环糊精接枝醛化葡聚糖加水混合溶胀制备而成，特征在于具有一定的强度、韧性和自修复性，与传统技术相比改善了凝胶性能的可控性以及进一步提高了凝胶的生物相容性。中国专利CN105664245A公开了一种可注射型超分子水凝胶及其制备方法，主要由明胶、含有氨基和/或环氧键的硅烷偶联剂和β-环糊精通过主客体化学制备，该超分子水凝胶具有可调控的力学性能，可注射性以及促软骨再生修复能力，同时能够极好地粘附于组织而不易流失，具有很好的临床应用前景。但这两种可注射水凝胶仍然不具有仿细胞外基质特性，后者所用硅烷偶联剂也具有一定的细胞毒性，且制备过程也相对复杂。为此，寻求一种具有仿细胞外基质、生物相容性良好、温敏性可控且具有可逆特性的可注射水凝胶，一直是科研工作者们追求的热点。
对于仿细胞外基质组织工程材料，Hubbell[J.A.Hubbell，Bioactivebiomaterials[J].Current Opinion in Biotechnology，1999，10(2)：123-129.]认为关键在于生产具有生物活性的材料，而传统的可注射水凝胶目前所见多是将具有生物活性物质直接加入可注射水凝胶中进行物理混合，或者是添加生物活性良好的天然物质，如壳聚糖、胶原蛋白、透明质酸等，而很少有将生物活性因子或者介导细胞与外环境直接作用的物质接枝到生物材料上，从而使材料大分子链上含细胞活性分子。对于这一类物质，早在1984年，Pierschbacher等[M.D.Pierschbacher，E.Ruoslahti，Cell attachment activity offibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule[J].Nature，1984，309(5963)：30-33.]首次报道在整合素(介导细胞与其外环境之间的跨膜受体称为整合素)结合配体的过程中，有这么一种特殊的RGD序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，简称RGD序列)是其结合配体最常见的识别位点。因此，若能将含有RGD这一特殊序列的短肽接枝到材料上，则能够有效促进细胞在生物材料表面的黏附，提高生物材料的细胞相容性。Smith等[E.Smith，J.Yang，L.McGann，et al.RGD-grafted thermoreversiblepolymers to facilitate attachment of BMP-2 responsive C2Cl2 cells[J].Biomaterials，2005，26(35)：7329-7338.]在热可逆生物材料N-异丙基丙烯酰胺与N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺无规共聚物(简称P(NIPAM-co-NASI))表面，通过氨基与琥珀酰亚胺的置换反应接枝了含RGD短肽，研究发现小鼠成肌细胞(C2Cl2)对RGD接枝的P(NIPAM-co-NASI)表面的黏附显著高于未接枝RGD的P(NIPAM-co-NASI)表面，但是仅仅停留在材料的二维表面研究细胞的黏附作用，未深入到细胞生存的三维环境中。中国专利CN104307049A公开了一种仿细胞外基质可注射的原位水凝胶及其制备方法与应用，主要是由巯基化明胶、巯基化多糖、或含RGD的细胞粘附肽通过聚乙二醇双丙烯酸酯发生交联反应来制备，制备可注射水凝胶具有良好的生物相容性、调控细胞行为的作用，但因其明胶、多糖需要巯基化修饰导致制备工艺复杂，含天然高分子导致温敏可控性不好，且由于迈克尔(Michael)加成反应之后导致可注射性不可逆，而不能得到广泛应用。
因此，若能提供一种简单无毒高效的合成方法，制备一种在大分子链上接枝细胞活性因子(RGD短肽)的高聚物，兼具优良的生物相容性、可控的温敏性能且可逆的可注射性，可有效促进水凝胶内细胞特异性黏附及基因的特异激活，以满足其在组织工程中的应用。
发明内容
基于上述技术问题，本发明提供一种接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶及其制备方法和应用。本发明的可注射水凝胶在大分子链上接枝了具有生物活性的识别位点，可有效促进细胞的黏附和增殖，及其特定基因的表达，聚合后的大分子具有可控的温敏性和可逆的可注射性，使得所制备的水凝胶随温度变化可发生溶胶-凝胶相转变，从而分离出所培养的细胞。此外，可通过非侵入性方式注射到体内，避免高创伤性外科手术。本材料制备方法简易，无生物毒性，生物相容性好，在组织工程领域有着广泛的应用前景。
为实现本发明的目的，提供以下方案：
一种含有细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶，其制备方法如下，首先由聚合后具有温敏性的单体M1、含有羧基基团的单体M2、引发剂M3与催化剂M4通过共聚反应制备含羧基官能团共聚物A；再由共聚物A、烯类单体M5、有机溶剂M6、有机合成脱水剂、亲核酰化催化剂与沉淀剂M7通过脱水酯化反应制备双键功能化聚合物B；再由双键功能化聚合物B与生物短肽M8通过无铜点击化学制备短肽功能化聚合物C；最后经过与细胞共混，制得含有细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶。
所述的聚合后具有温敏性的单体M1为甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-正丙基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、N-乙烯基己内酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺中的任意一种。
所述含有羧基功能团的单体M2为丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸、丁烯酸、甲基丁烯酸、戊烯酸、己烯酸、庚烯酸中的任意一种或任意两种的混合物。
所述的引发剂M3为过硫酸钾、过硫酸铵中的任意一种。
所述的催化剂M4为四甲基乙二胺、亚硫酸钠中的任意一种。
所述的烯类单体M5为丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、丙烯酸羟丁酯、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯中的任意一种或任意两种的混合物。
所述的有机溶剂M6为二氯甲烷、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙酸丁酯中的任意一种。
所述的有机合成脱水剂为二环己基碳二亚胺，所述的亲核酰化催化剂为4-二甲氨基吡啶。
所述的沉淀剂M7为乙醚、正己烷、石油醚、苯、乙酸乙酯、苯甲酸丁酯、四氯化碳、丙醚、正戊烷中的任意一种。
所述的生物短肽M8为c(RGDfC)、RGDC、CRGDFGPDC、c(RGDyC)、GRGDSPC中的任意一种。
本发明的一种含有细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶的制备方法具体如下：
1)含羧基官能团共聚物A的制备：25℃下将聚合后具有温敏性的单体M1、含有羧基基团的单体M2依次加入到去离子水中搅拌溶解，配成质量浓度为4-12wt％的溶液，置于4℃冰水浴中搅拌，通入氮气20-40min，每隔10-15min依次加入引发剂M3，催化剂M4，取出后密封，置于20-30℃水浴中反应12-24h，将M1与M2的共聚物置于透析袋中透析3-6d，每8-12h更换一次去离子水，取出后冷冻干燥8-12h，得到共聚物A干燥粉末；
2)双键功能化聚合物B的制备：将步骤1)制得的共聚物A搅拌溶解在有机溶剂M6中，浓度为0.5-2wt％，每隔5-8min依次加入烯类单体M5和亲核酰化催化剂4-二甲氨基吡啶，活化20-30min后，滴加有机合成脱水剂二环己基碳二亚胺，20-30℃反应12-24h，将聚合物溶液浓缩至8-12mL，加入到沉淀剂M7中进行沉淀，得到固体，并将其常温搅拌溶于去离子水中，置于透析袋中透析3-6d，每8-12h更换一次去离子水，取出后冷冻干燥8-12h，得到双键功能化聚合物B干燥粉末；
3)无铜点击化学制备短肽功能化聚合物C：将步骤2)制得的共聚物B溶解于HEPES缓冲溶液中，共聚物B的浓度为0.5-3wt％，通入氮气20-40min，加入生物短肽M8粉末搅拌至溶解，在20-30℃条件下反应2-3h，置于透析袋中透析3-6d，每8-12h更换一次去离子水，冷冻干燥8-12h，得到短肽功能化的聚合物C；
4)包含细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶的制备：将步骤3)制得的聚合物C进行灭菌，将其溶解在0.001-0.01M氯化钙和0.137M氯化钠的溶液中配成无菌盐溶液，其中聚合物C的浓度为4-10wt％，取2-5mL的细胞分散溶液，与2-5mL的聚合物C盐溶液混合，即制得包含细胞的接枝RGD短肽的温敏可注射水凝胶。
所述的步骤1)中单体M2的质量占单体M1与单体M2总质量的1-8％；引发剂M3和催化剂M4的质量分别占单体总质量的0.5-1.5％和0.1-0.3％；步骤2)中共聚物A在有机溶剂M6中的浓度为0.5-2wt％；烯类单体M5的用量为所加共聚物A质量的2-10％；亲核酰化催化剂4-二甲氨基吡啶和有机合成脱水剂二环己基碳二亚胺的量均为所加共聚物A质量的4-8％，使用时配置成质量分数为0.1-1wt％M6的溶液，沉淀剂M7用量为溶液浓缩后体积的8-12倍；步骤3)中的生物短肽M8的质量为共聚物B的质量的0.5-2％。
所述的步骤1)、步骤2)和步骤3)中透析袋的截留分子量为5000、7000、14000、25000中的任意一种。
所述的步骤2)中浓缩方法为自然干燥、常压蒸馏、减压蒸馏、旋转蒸发、搅拌浓缩中的任意一种。
所述的步骤3)中HEPES缓冲溶液的pH为7.2-7.4，配置的浓度为10-50mmol/L。
所述的步骤4)中灭菌方法为紫外照射灭菌、钴辐射灭菌、高压蒸汽灭菌中的任意一种。
所述的步骤4)中聚合物C的盐溶液中所加入的氯化钙是为水凝胶的凝聚反应提供交联剂，氯化钠是为了将水凝胶溶液的离子强度调节至接近生理条件，以避免细胞/凝胶混合过程中离子压强对细胞膜的破坏。
所述的步骤4)中细胞分散溶液密度为50000-200000/mL。
所述的可注射水凝胶的成胶温度、成胶速度、生物相容性和细胞毒性通过单体M1与M2的比例、烯类单体M5的用量，接枝的生物短肽的种类、质量、透析的时间调控。
所述的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶的应用在可注射细胞支架、药物控释、组织再生修复、肿瘤治疗等领域。
相比普通的可注射水凝胶，本发明有如下优点：
1.本发明所采用的制备方法主要涉及高分子化学合成方法，特别是利用生理条件下的巯基-烯“点击”反应，原位制备了温敏可注射水凝胶，其结构和性能通过调节投料比、反应参数和单体种类等，可制得不同分子量大小、不同响应温度和响应速率的可注射水凝胶。
2.本发明制备的可注射水凝胶具有温敏特性，当温度高于其低临界相转变温度时，聚合物会凝胶化，成三维固状，当温度低于其低临界相转变温度时，水凝胶会去凝胶化，由此可分离所要培养的细胞等物质。
3.本发明的可注射水凝胶由于分子链上接枝有生物活性的位点，在用于三维细胞培养过程中，可有效促进细胞的黏附和增殖，且接枝短肽时使用的方法是基于无铜点击化学方法，操作简易，对短肽的结构破坏降到最低，不含有毒物质，使得在医用领域的安全性进一步提升。
4.本发明所制备的可注射水凝胶通过非侵入性方式注射到体内，避免了高创伤性外科手术、简化了治疗过程，达到了减少病人痛苦、降低医疗费用目的。
具体实施方法
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述具体实施方案仅用于说明本发明而不限制本发明的范围，其他任何未违背本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1)含羧基官能团共聚物A的制备：25℃下将N-羟甲基丙烯酰胺和丙烯酸按照质量比为98∶2的比例依次加入到去离子水中，配成浓度为6wt％的溶液，置于4℃冰水浴中搅拌，并通入氮气30min，之后每隔10min依次加入过硫酸铵和四甲基乙二胺(其中过硫酸铵的质量为单体总质量的1.1％，四甲基乙二胺的质量为单体总质量的0.2％)，取出后密封，置于28℃水浴中反应14h，取出并将其置于透析袋中透析3d，每8h更换一次去离子水，取出后冷冻干燥10h，得到共聚物A干燥粉末；
2)双键功能化聚合物B的制备：将步骤1)制得的共聚物A溶解在二甲基亚砜中，配成浓度为0.5wt％的溶液，每隔5min相继加入丙烯酸羟丁酯和4-二甲氨基吡啶(其中丙烯酸羟丁酯的质量为共聚物A的5％，4-二甲氨基吡啶的质量为共聚物A的6％)，活化30min，滴加有机合成脱水剂二环己基碳二亚胺(质量为共聚物A的6％)，26℃反应16h，将聚合物溶液搅拌浓缩至10mL，加到10倍乙醚中进行沉淀，得到固体，并将其常温搅拌溶于20mL去离子水中，置于透析袋中透析3d，每8h更换一次去离子水，取出后冷冻干燥10h，得到双键功能化聚合物B干燥粉末；
3)无铜点击化学制备短肽功能化聚合物C：将步骤2)制得的共聚物B溶解于HEPES缓冲溶液中，配成浓度为2wt％的溶液(HEPES的pH为7.2，浓度为15mmol/L)，通入氮气20min，加入c(RGDfC)(质量为共聚物B的2％)，在25℃条件下反应2.4h，置于透析袋中透析3d，每8h更换一次去离子水，冷冻干燥10h，得到短肽功能化的聚合物C；
4)包含细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶的制备：将步骤3)制得的聚合物C进行紫外照射灭菌，将其溶解在0.01M氯化钙和0.137M氯化钠的溶液中配成无菌盐溶液，其中聚合物C的浓度为4wt％，取2mL的细胞分散溶液，与2mL的聚合物C盐溶液混合，即制得包含细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶。
实施例2
1)含羧基官能团共聚物A的制备：25℃下将N-乙烯基己内酰胺和戊烯酸按照质量比为97∶3的比例依次加入到去离子水中，配成浓度为5wt％的溶液，置于4℃冰水浴中搅拌，并通入氮气20min，之后每隔11min依次加入过硫酸钾和亚硫酸钠(其中过硫酸铵的质量为单体总质量的1.4％，四甲基乙二胺的质量为单体总质量的0.28％)，取出后密封，置于20℃水浴中反应24h，取出并将其置于透析袋中透析4d，每9h更换一次去离子水，取出后冷冻干燥8h，得到共聚物A干燥粉末；
2)双键功能化聚合物B的制备：将步骤1)制得的共聚物A溶解在四氢呋喃中，配成浓度为1wt％的溶液，每隔6min相继加入甲基丙烯酸羟乙酯和4-二甲氨基吡啶(其中甲基丙烯酸羟乙酯的质量为共聚物A的8％，4-二甲氨基吡啶的质量为共聚物A的7％)，活化25min，滴加有机合成脱水剂二环己基碳二亚胺(质量为共聚物A的7％)，20℃反应24h，将聚合物溶液减压蒸馏至8mL，加到9倍石油醚中进行沉淀，得到固体，并将其常温搅拌溶于20mL去离子水中，置于透析袋中透析4d，每9h更换一次去离子水，取出后冷冻干燥8h，得到双键功能化聚合物B干燥粉末；
3)无铜点击化学制备短肽功能化聚合物C：将步骤2)制得的共聚物B溶解于HEPES缓冲溶液中，配成浓度为2.2wt％的溶液(HEPES的pH为7.25，浓度为20mmol/L)，通入氮气25min，加入RGDC(质量为共聚物B的1.8％)，在20℃条件下反应3h，置于透析袋中透析4d，每9h更换一次去离子水，冷冻干燥8h，得到短肽功能化的聚合物C；
4)包含细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶的制备：将步骤3)制得的聚合物C进行高压蒸汽灭菌，将其溶解在0.008M氯化钙和0.137M氯化钠的溶液中配成无菌盐溶液，其中聚合物C的浓度为6wt％，取3mL的细胞分散溶液，与3mL的聚合物C盐溶液混合，即制得包含细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶。
实施例3：
1)含羧基官能团共聚物A的制备：25℃下将N-正丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸按照质量比为96∶4的比例依次加入到去离子水中，配成浓度为8wt％的溶液，置于4℃冰水浴中搅拌，并通入氮气25min，之后每隔12min依次加入过硫酸钾和四甲基乙二胺(其中过硫酸钾的质量为单体总质量的1.2％，四甲基乙二胺的质量为单体总质量的0.25％)，取出后密封，置于22℃水浴中反应20h，取出并将其置于透析袋中透析5d，每10h更换一次去离子水，取出后冷冻干燥12h，得到共聚物A干燥粉末；
2)双键功能化聚合物B的制备：将步骤1)制得的共聚物A溶解在二氯甲烷中，配成浓度为1.8wt％的溶液，每隔7min相继加入丙烯酸羟丙酯和4-二甲氨基吡啶(其中丙烯酸羟丙酯的质量为共聚物A的4％，4-二甲氨基吡啶的质量为共聚物A的6％)，活化30min，滴加有机合成脱水剂二环己基碳二亚胺(质量为共聚物A的6％)，22℃反应22h，将聚合物溶液自然干燥浓缩至11mL，加到8倍正己烷中进行沉淀，得到固体，并将其常温搅拌溶于20mL去离子水中，置于透析袋中透析5d，每10h更换一次去离子水，取出后冷冻干燥12h，得到双键功能化聚合物B干燥粉末；
3)无铜点击化学制备短肽功能化聚合物C：将步骤2)制得的共聚物B溶解于HEPES缓冲溶液中，配成浓度为2wt％的溶液(HEPES的pH为7.3，浓度为30mmol/L)，通入氮气30min，加入GRGDSPC(质量为共聚物B的2％)，在24℃条件下反应2.5h，置于透析袋中透析5d，每10h更换一次去离子水，冷冻干燥12h，得到短肽功能化的聚合物C；
4)包含细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶的制备：将步骤3)制得的聚合物C进行高压蒸汽灭菌，将其溶解在0.006M氯化钙和0.137M氯化钠的溶液中配成无菌盐溶液，其中聚合物C的浓度为5wt％，取5mL的细胞分散溶液，与5mL的聚合物C盐溶液混合，即制得包含细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶。
实施例4
1)含羧基官能团共聚物A的制备：25℃下将N，N-二乙基丙烯酰胺和丁烯酸按照质量比为95∶5的比例依次加入到去离子水中，配成浓度为10wt％的溶液，置于4℃冰水浴中搅拌，并通入氮气35min，之后每隔15min依次加入过硫酸铵和亚硫酸钠(其中过硫酸铵的质量为单体总质量的0.8％，亚硫酸钠的质量为单体总质量的0.2％)，取出后密封，置于30℃水浴中反应12h，取出并将其置于透析袋中透析6d，每12h更换一次去离子水，取出后冷冻干燥9h，得到共聚物A干燥粉末；
2)双键功能化聚合物B的制备：将步骤1)制得的共聚物A溶解在N，N-二甲基乙酰胺中，配成浓度为0.5wt％的溶液，每隔5min相继加入甲基丙烯酸羟丙酯和4-二甲氨基吡啶(其中甲基丙烯酸羟丙酯的质量为共聚物A的3％，4-二甲氨基吡啶的质量为共聚物A的5％)，活化22min，滴加有机合成脱水剂二环己基碳二亚胺(质量为共聚物A的5％)，28℃反应12h，将聚合物溶液旋蒸至8mL，加到11倍乙酸乙酯中进行沉淀，得到固体，并将其常温搅拌溶于20mL去离子水中，置于透析袋中透析6d，每12h更换一次去离子水，取出后冷冻干燥9h，得到双键功能化聚合物B干燥粉末；
3)无铜点击化学制备短肽功能化聚合物C：将步骤2)制得的共聚物B溶解于HEPES缓冲溶液中，配成浓度为2.5wt％的溶液(HEPES的pH为7.4，浓度为50mmol/L)，通入氮气35min，加入CRGDFGPDC(量为共聚物B的1.8％)，在30℃条件下反应2h，置于透析袋中透析6d，每12h更换一次去离子水，冷冻干燥9h，得到短肽功能化的聚合物C；
4)包含细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶的制备：将步骤3)制得的聚合物C进行钴辐射灭菌，将其溶解在0.004M氯化钙和0.137M氯化钠的溶液中配成无菌盐溶液，其中聚合物C的浓度为8wt％，取4mL的细胞分散溶液，与4mL的聚合物C盐溶液混合，即制得包含细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶。
实施例5
1)含羧基官能团共聚物A的制备：25℃下将N-异丙基丙烯酰胺和衣康酸按照质量比为94∶6的比例依次加入到去离子水中，配成浓度为8wt％的溶液，置于4℃冰水浴中搅拌，并通入氮气40min，之后每隔12min依次加入过硫酸铵和四甲基乙二胺(其中过硫酸铵的质量为单体总质量的1.5％，四甲基乙二胺的质量为单体总质量的0.3％)，取出后密封，置于26℃水浴中反应16h，取出并将其置于透析袋中透析4d，每9h更换一次去离子水，取出后冷冻干燥11h，得到共聚物A干燥粉末；
2)双键功能化聚合物B的制备：将步骤1)制得的共聚物A溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，配成浓度为1.5wt％的溶液，每隔8min相继加入丙烯酸羟乙酯和4-二甲氨基吡啶(其中丙烯酸羟乙酯的质量为共聚物A的8％，4-二甲氨基吡啶的质量为共聚物A的7％)，活化25min，滴加有机合成脱水剂二环己基碳二亚胺(质量为共聚物A的7％)，24℃反应20h，将聚合物溶液旋蒸至10mL，加到12倍四氯化碳中进行沉淀，得到固体，并将其常温搅拌溶于20mL去离子水中，置于透析袋中透析4d，每9h更换一次去离子水，取出后冷冻干燥11h，得到双键功能化聚合物B干燥粉末；
3)无铜点击化学制备短肽功能化聚合物C：将步骤2)制得的共聚物B溶解于HEPES缓冲溶液中，配成浓度为6wt％的溶液(HEPES的pH为7.35，浓度为45mmol/L)，通入氮气40min，加入c(RGDyC)(质量为共聚物B的1.8％)，在26℃条件下反应2.2h，置于透析袋中透析4d，每9h更换一次去离子水，冷冻干燥11h，得到短肽功能化的聚合物C；
4)包含细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶的制备：将步骤3)制得的聚合物C进行紫外照射灭菌，将其溶解在0.005M氯化钙和0.137M氯化钠的溶液中配成无菌盐溶液，其中聚合物C的浓度为6wt％，取3mL的细胞分散溶液，与2mL的聚合物C盐溶液混合，即制得包含细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶。

Claims (9)

1.一种含有细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶，其制备方法如下，首先由聚合后具有温敏性的单体M1、含有羧基基团的单体M2、引发剂M3与催化剂M4通过共聚反应制备含羧基官能团共聚物A；再由共聚物A、烯类单体M5、有机溶剂M6、有机合成脱水剂、亲核酰化催化剂与沉淀剂M7通过脱水酯化反应制备双键功能化聚合物B；再由双键功能化聚合物B与生物短肽M8通过无铜点击化学制备短肽功能化聚合物C；最后经过与细胞共混，制得含有细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶；所述的聚合后具有温敏性的单体M1为甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-正丙基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、N-乙烯基己内酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺中的任意一种；所述含有羧基功能团的单体M2为丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸、丁烯酸、甲基丁烯酸、戊烯酸、己烯酸、庚烯酸中的任意一种或任意两种的混合物；所述的引发剂M3为过硫酸钾、过硫酸铵中的任意一种；所述的催化剂M4为四甲基乙二胺、亚硫酸钠中的任意一种；所述的烯类单体M5为丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、丙烯酸羟丁酯、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯中的任意一种或任意两种的混合物；所述的有机溶剂M6为二氯甲烷、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙酸丁酯中的任意一种；所述的有机合成脱水剂为二环己基碳二亚胺，所述的亲核酰化催化剂为4-二甲氨基吡啶；所述的沉淀剂M7为乙醚、正己烷、石油醚、苯、乙酸乙酯、苯甲酸丁酯、四氯化碳、丙醚、正戊烷中的任意一种；所述的生物短肽M8为c(RGDfC)、RGDC、CRGDFGPDC、c(RGDyC)、GRGDSPC中的任意一种。
2.一种含有细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶的制备方法，包括下列步骤：
1)含羧基官能团共聚物A的制备：25℃下将聚合后具有温敏性的单体M1、含有羧基基团的单体M2依次加入到去离子水中搅拌溶解，配成质量浓度为4-12wt％的溶液，置于4℃冰水浴中搅拌，通入氮气20-40min，每隔10-15min依次加入引发剂M3，催化剂M4，取出后密封，置于20-30℃水浴中反应12-24h，将M1与M2的共聚物置于透析袋中透析3-6d，每8-12h更换一次去离子水，取出后冷冻干燥8-12h，得到共聚物A干燥粉末；
2)双键功能化聚合物B的制备：将步骤1)制得的共聚物A搅拌溶解在有机溶剂M6中，浓度为0.5-2wt％，每隔5-8min依次加入烯类单体M5和亲核酰化催化剂4-二甲氨基吡啶，活化20-30min后，滴加有机合成脱水剂二环己基碳二亚胺，20-30℃反应12-24h，将聚合物溶液浓缩至8-12mL，加入到沉淀剂M7中进行沉淀，得到固体，并将其常温搅拌溶于去离子水中，置于透析袋中透析3-6d，每8-12h更换一次去离子水，取出后冷冻干燥8-12h，得到双键功能化聚合物B干燥粉末；
3)无铜点击化学制备短肽功能化聚合物C：将步骤2)制得的共聚物B溶解于HEPES缓冲溶液中，共聚物B的浓度为0.5-3wt％，通入氮气20-40min，加入生物短肽M8粉末搅拌至溶解，在20-30℃条件下反应2-3h，置于透析袋中透析3-6d，每8-12h更换一次去离子水，冷冻干燥8-12h，得到短肽功能化的聚合物C；
4)包含细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶的制备：将步骤3)制得的聚合物C进行灭菌，将其溶解在0.001-0.01M氯化钙和0.137M氯化钠的溶液中配成无菌盐溶液，其中聚合物C的浓度为4-10wt％，取2-5mL的细胞分散溶液，与2-5mL的聚合物C盐溶液混合，即制得包含细胞的接枝RGD短肽的温敏可注射水凝胶。
3.根据权利要求2所述的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的步骤1)中单体M2的质量占单体M1与单体M2总质量的1-8％；引发剂M3和催化剂M4的质量分别占单体总质量的0.5-1.5％和0.1-0.3％；步骤2)中共聚物A在有机溶剂M6中的浓度为0.5-2wt％；烯类单体M5的用量为所加共聚物A质量的2-10％；亲核酰化催化剂4-二甲氨基吡啶和有机合成脱水剂二环己基碳二亚胺的量均为所加共聚物A质量的4-8％，使用时配置成质量分数为0.1-1wt％M6的溶液，沉淀剂M7用量为溶液浓缩后体积的8-12倍；步骤3)中的生物短肽M8的质量为共聚物B的质量的0.5-2％。
4.根据权利要求2所述的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的步骤1)、步骤2)和步骤3)中透析袋的截留分子量为5000、7000、14000、25000中的任意一种。
5.根据权利要求2所述的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的步骤2)中浓缩方法为自然干燥、常压蒸馏、减压蒸馏、旋转蒸发、搅拌浓缩中的任意一种。
6.根据权利要求2所述的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的步骤3)中HEPES缓冲溶液的pH为7.2-7.4，配置的浓度为10-50mmol/L。
7.根据权利要求2所述的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的步骤4)中灭菌方法为紫外照射灭菌、钴辐射灭菌、高压蒸汽灭菌中的任意一种。
8.根据权利要求2所述的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的步骤4)中聚合物C的盐溶液中所加入的氯化钙是为水凝胶的凝聚反应提供交联剂，氯化钠是为了将水凝胶溶液的离子强度调节至接近生理条件，以避免细胞/凝胶混合过程中离子压强对细胞膜的破坏；所述的步骤4)中细胞分散溶液密度为50000-200000/mL。
9.根据权利要求2所述的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的可注射水凝胶的成胶温度、成胶速度、生物相容性和细胞毒性通过单体M1与M2的比例、烯类单体M5的用量，接枝的生物短肽的种类、质量、透析的时间调控。
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