CN110790951A - 一种原位交联的γ-聚谷氨酸水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种原位交联的γ‑聚谷氨酸水凝胶及其制备方法和应用，制备方法包括将含有半胱胺分子修饰的γ‑聚谷氨酸聚合物的PBS缓冲溶液和含有甲基丙烯酸缩水甘油酯分子修饰的γ‑聚谷氨酸聚合物的PBS缓冲溶液混合成型，即得。本发明通过半胱胺分子上的巯基基团和GMA分子上的碳碳双键之间的迈克尔加成反应，将γ‑聚谷氨酸交联在一起，形成三维网络结构的水凝胶，具有生物相容性好、可生物降解、可原位注射成型等优点，实施条件温和可调控，可应用于医用敷料及组织工程材料等领域。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种原位交联的γ-聚谷氨酸水凝胶多孔支架及其制备方法和在组织工程中的应用。具体是通过半胱胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的聚谷氨酸原位交联的方法得到水凝胶多孔支架材料。
背景技术
组织工程的出现为软组织损伤的修复与重建开辟了新的途径。水凝胶作为一种具有湿、软特性的三维网络多孔支架材料，拥有仿似细胞外基质的3D微环境、与天然软骨组织的粘弹性特征相似、能够保持正常细胞表型、可微创注射操作和能够高度匹配任意缺损部位等多方面优势，被视为一种比较理想的关节软骨等人体组织替代材料，广泛地应用于组织工程领域，如：细胞载体、生长因子/活性药物载体、创面修复和组织工程支架等。
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种水溶性高分子，由D-谷氨酸或L-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基形成γ-酰胺键结合而成的阴离子聚合物，主链上含有大量游离羧基，可发生交联、螯合、衍生化等反应，其侧链存在大量游离羧基，易于修饰，相对分子质量在10万～100万之间，是一种酸性氨基酸聚合物，可通过化学合成法、提取法和微生物发酵法获得，具有高生物相容性、可降解、无毒、保湿等特点，而且其与蛋白质二级结构相似等优良特性使聚谷氨酸在蛋白质结构模拟、生物医学领域应用方面被认为是最具应用潜力的生物材料之一。
目前，水凝胶材料的成型方式主要包括化学交联、辐射交联、光引发聚合和物理交联四种方式。但现有技术的成型方式往往不够温和，或者交联成型后的水凝胶会带有一定的细胞毒性，存在生物相容性差或机械强度不足等问题。
发明内容
针对上述现有技术的问题，本发明一种原位成型的γ-聚谷氨酸水凝胶及其制备方法和应用，本发明通过迈克尔加成反应，将聚谷氨酸交联在一起，形成的水凝胶成型后可作为多孔支架，具有反应条件温和、生物相容性好、可原位注射成型等特点，可以广泛的应用组织工程材料等领域。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种原位交联的γ-聚谷氨酸水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备半胱胺分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-SH)；
(2)制备甲基丙烯酸缩水甘油酯分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-GMA)；
(3)分别配置第一原液和第二原液，所述第一原液的溶质为步骤(1)得到的所述半胱胺分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物，溶剂为PBS缓冲液，所述第二原液的溶质为步骤(2)得到的甲基丙烯酸缩水甘油酯分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物，溶剂为PBS缓冲液；将所述第一原液和所述第二原液混合成型，即得所述原位交联的γ-聚谷氨酸水凝胶。
优选的，步骤(1)包括如下步骤：
(1-1)向含有γ-聚谷氨酸的水溶液或含有γ-聚谷氨酸的缓冲溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺后活化；
(1-2)将半胱胺盐酸盐加入到步骤(1-1)活化后的体系中，反应18～32h后于水中透析，即得所述半胱胺分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物。
步骤(2)所述甲基丙烯酸缩水甘油酯分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物可采用现有技术制备得到，也可采用如下步骤制备得到：
向γ-聚谷氨酸的水溶液中加入甲基丙烯酸缩水甘油酯，并调节pH＝4.5～5，于50～65℃下反应6～10h后于水中透析后即得所述甲基丙烯酸缩水甘油酯分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物。
优选的，步骤(1-1)所述的含有γ-聚谷氨酸的水溶液的pH为4～6。
优选的，步骤(1-1)所述的含有γ-聚谷氨酸的缓冲溶液为含有γ-聚谷氨酸的MES缓冲液。
优选的，所述的MES缓冲液浓度为0.05～0.2M，pH为4～6。
优选的，步骤(1-1)所述的活化的时间为15～120min。
优选的，步骤(1-1)所述的活化的温度为18～37℃。
优选的，步骤(1-2)所述的透析的时间为3～7天。
优选的，步骤(1-2)还包括透析后冷冻干燥的步骤。
优选的，步骤(2)所述的透析的时间为3～7天。
优选的，步骤(2)还包括透析后冷冻干燥的步骤。
优选的，步骤(1-1)或步骤(2)中，所述γ-聚谷氨酸的分子量为10万～200万道尔顿。
优选的，步骤(1-1)中，所述含有γ-聚谷氨酸的水溶液或含有γ-聚谷氨酸的缓冲溶液的浓度为10～30g/L。
优选的，步骤(1-1)中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1～3:1；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与γ-聚谷氨酸中羧基的摩尔比为1～3:1。
优选的，步骤(2)中，甲基丙烯酸缩水甘油酯与γ-聚谷氨酸中羧基的摩尔比为1～3:1。
优选的，步骤(3)中所述的混合成型的时间为10～30min，在采用紫外光照射的条件下，所述的混合成型时间为30～120秒。
优选的，步骤(3)中，所述第一原液中，所述半胱胺分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物的质量浓度为5％～15％；所述第二原液中，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物的质量浓度为5％～15％。
优选的，步骤(3)中所述的PBS缓冲液的浓度为0.01～0.15M，pH为7.0～7.8。
优选的，步骤(3)中所述第一原液和所述第二原液的用量满足：半胱胺分子上的巯基与甲基丙烯酸缩水甘油酯上的双键的摩尔比为1:0.2～3。
所述制备方法的反应式为：
(1)
(2)
(3)
本发明还提供由上述方法制得的原位交联的γ-聚谷氨酸水凝胶。
本发明还提供由上述方法制得的原位交联的γ-聚谷氨酸水凝胶在组织工程材料领域中的应用。
所述应用包括：制备医用敷料和细胞支架。
本发明的有益效果在于：
迈克尔加成反应可在人体生理条件下快速进行，不需要任何引发剂、催化剂和有机溶剂，不产生任何有害的毒副产物，并且具有较高的化学选择性，是一种理想的用于生物医用材料的化学交联反应。
本发明以安全无毒、可生物降解材料γ-聚谷氨酸为主体材料，分别在其分子侧链修饰半胱胺基团和甲基丙烯酸缩水甘油酯基团，利用温和无害的迈克尔加成反应原位成胶，可匹配复杂深层组织伤口。同时天然γ-聚谷氨酸具有与天然蛋白质相似的二级结构，模拟组织细胞基质中的蛋白成分仿生构建组织工程多孔支架，使之能够有效促进损伤后组织的再生与重建。该水凝胶材料有效解决了传统化学交联类水凝胶具有一定细胞毒性的缺陷，且具有一定的机械强度、生物相容性好、操作条件温和等优点，在医用敷料、药物载体和细胞支架等领域具有广阔的市场应用前景。
附图说明
图1为γ-PGA-SH和γ-PGA-GMA成胶的照片，γ-PGA-SH和γ-PGA-GMA混合后成胶示意图。
图2为所述原位交联的γ-聚谷氨酸水凝胶的扫描电镜图片(SEM)。
图3为γ-PGA-SH和γ-PGA-GMA细胞毒性实验结果图。
图4为所述原位交联的γ-聚谷氨酸水凝胶作为多孔支架用于3T3细胞三维培养实验结果图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详述的本发明。
实施例1
(1)将γ-聚谷氨酸(γ-PGA，分子量为10万道尔顿)溶解于MES缓冲液(pH＝4.8，0.1M)，γ-PGA的质量浓度为10g/L，搅拌混合均匀；然后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在18℃条件下搅拌活化30min。加入半胱胺盐酸盐(CSA·HCl)，室温搅拌反应18h；各物质的摩尔比如下，EDC:γ-PGA(-COOH)＝1:1，EDC:NHS＝1:1，γ-PGA(-COOH):CSA·HCl＝1:1。得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到半胱胺分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-SH)，CSA的接枝率为25％。
(2)将γ-聚谷氨酸(γ-PGA，分子量为10万道尔顿)溶解于去离子水中，γ-PGA的质量浓度为10g/L，搅拌混合均匀；然后加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，pH＝4.5，60℃搅拌反应8h；各物质的摩尔比如下，GMA:γ-PGA(-COOH)＝1:1。得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到甲基丙烯酸缩水甘油酯分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-GMA)，GMA的接枝率为13.7％。
(3)用PBS缓冲液(0.05M，pH＝7.5)分别配置水凝胶的第一原液和第二原液，第一原液溶质为半胱胺分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-SH)，第二原液溶质为甲基丙烯酸缩水甘油酯分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-GMA)。第一原液中，γ-PGA-SH的浓度为5wt％；第二原液中，γ-PGA-GMA的浓度为8wt％。将第一原液和第二原液按照半胱胺分子上的巯基与甲基丙烯酸缩水甘油酯上的双键的摩尔比为1:1(SH:GMA＝1:1)的用量分别加入双头注射器的AB管中，缓慢推出得到γ-PGA水凝胶，成胶时间25min。
实施例2
(1)将γ-聚谷氨酸(γ-PGA，分子量为30万道尔顿)溶解于MES缓冲液(pH＝6.0，0.2M)，γ-PGA的质量浓度为20g/L，搅拌混合均匀；然后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在35℃条件下搅拌活化15min。加入半胱胺盐酸盐(CSA·HCl)，室温搅拌反应20h；各物质的摩尔比如下，EDC:γ-PGA(-COOH)＝1.2:1，EDC:NHS＝3:1，γ-PGA(-COOH):CSA·HCl＝1:1.2。得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析5天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到半胱胺分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-SH)，CSA的接枝率为35％。
(2)将γ-聚谷氨酸(γ-PGA，分子量为70万道尔顿)溶解于去离子水中，γ-PGA的质量浓度为10g/L，搅拌混合均匀；然后加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，pH＝4.7，50℃搅拌反应6h；各物质的摩尔比如下，GMA：γ-PGA(-COOH)＝2:1。得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析5天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到甲基丙烯酸缩水甘油酯分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-GMA)，GMA的接枝率为20.3％。
(3)用PBS缓冲液(0.1M，pH＝7.0)分别配置水凝胶的第一原液和第二原液，第一原液溶质为半胱胺分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-SH)，第二原液溶质为甲基丙烯酸缩水甘油酯分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-GMA)。第一原液中，γ-PGA-SH的浓度为10wt％；第二原液中，γ-PGA-GMA的浓度为5wt％。将第一原液和第二原液按照SH:GMA＝1:0.2的用量分别加入双头注射器的AB管中，缓慢推出得到γ-PGA水凝胶，同时用紫外光照射，成胶时间120秒。
实施例3
(1)将γ-聚谷氨酸(γ-PGA，分子量为100万道尔顿)溶解于去离子水中，制成pH＝4的溶液，γ-PGA的质量浓度为30g/L，搅拌混合均匀；然后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温条件下搅拌活化120min。加入半胱胺盐酸盐(CSA·HCl)，室温搅拌反应32h；各物质的摩尔比如下，EDC:γ-PGA(-COOH)＝3:1，EDC:NHS＝2:1，γ-PGA(-COOH):CSA·HCl＝1:1.5。得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析7天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到半胱胺分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-SH)，CSA的接枝率为46％。
(2)将γ-聚谷氨酸(γ-PGA，分子量为200万道尔顿)溶解于去离子水中，γ-PGA的质量浓度为10g/L，搅拌混合均匀；然后加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，pH＝5，65℃搅拌反应10h；各物质的摩尔比如下，GMA:γ-PGA(-COOH)＝3:1。得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析7天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到甲基丙烯酸缩水甘油酯分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-GMA)，GMA的接枝率为24.6％。
(3)用PBS缓冲液(0.15M，pH＝7.3)分别配置水凝胶的第一原液和第二原液，第一原液溶质为半胱胺分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-SH)，第二原液溶质为甲基丙烯酸缩水甘油酯分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-GMA)。第一原液中，γ-PGA-SH的浓度为15wt％；第二原液中，γ-PGA-GMA的浓度为15wt％。将第一原液和第二原液按照SH:GMA＝1:3的用量分别加入双头注射器的AB管中，缓慢推出得到γ-PGA水凝胶，同时用紫外光照射，成胶时间60秒。
实施例4
(1)将γ-聚谷氨酸(γ-PGA，分子量为200万道尔顿)溶解于去离子水中，制成pH＝6的溶液，γ-PGA的质量浓度为15g/L，搅拌混合均匀；然后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温条件下搅拌活化60min。加入半胱胺盐酸盐(CSA·HCl)，室温搅拌反应25h；各物质的摩尔比如下，EDC:γ-PGA(-COOH)＝1:1，EDC:NHS＝1:1，γ-PGA(-COOH):CSA·HCl＝1:1。得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到半胱胺分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-SH)，CSA的接枝率为31％。
(2)将γ-聚谷氨酸(γ-PGA，分子量为70万道尔顿)溶解于去离子水中，γ-PGA的质量浓度为20g/L，搅拌混合均匀；然后加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，pH＝4.5，60℃搅拌反应8h；各物质的摩尔比如下，GMA:γ-PGA(-COOH)＝2:1。得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到甲基丙烯酸缩水甘油酯分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-GMA)，GMA的接枝率为13.7％。
(3)用PBS缓冲液(0.01M，pH＝7.5)分别配置水凝胶的第一原液和第二原液，第一原液溶质为半胱胺分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-SH)，第二原液溶质为甲基丙烯酸缩水甘油酯分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-GMA)。第一原液中，γ-PGA-SH的浓度为10wt％；第二原液中，γ-PGA-GMA的浓度为8wt％。将第一原液和第二原液按照SH:GMA＝1:2的用量分别加入双头注射器的AB管中，缓慢推出得到γ-PGA水凝胶，成胶时间30min。
实施例5
(1)将γ-聚谷氨酸(γ-PGA，分子量为70万道尔顿)溶解于MES缓冲液(pH＝4.0，0.05M)，γ-PGA的质量浓度为10g/L,搅拌混合均匀；然后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温条件下搅拌活化30min。加入半胱胺盐酸盐(CSA·HCl)，室温搅拌反应24h；各物质的摩尔比如下，EDC:γ-PGA(-COOH)＝1:1，EDC:NHS＝1:1，γ-PGA(-COOH):CSA·HCl＝1:1。得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到半胱胺分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-SH)，CSA的接枝率为43％。
(2)将γ-聚谷氨酸(γ-PGA，分子量为70万道尔顿)溶解于去离子水中，γ-PGA的质量浓度为10g/L，搅拌混合均匀；然后加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，pH＝4.7，60℃搅拌反应8h；各物质的摩尔比如下，GMA:γ-PGA(-COOH)＝3:1。得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到甲基丙烯酸缩水甘油酯分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-GMA)，GMA的接枝率为28.5％。
(3)用PBS缓冲液(0.01M，pH＝7.4)分别配置水凝胶的第一原液和第二原液，第一原液溶质为γ-PGA-SH，第二原液溶质为γ-PGA-GMA。第一原液中，γ-PGA-SH的浓度为8wt％；第二原液中，γ-PGA-GMA的浓度为8wt％。将第一原液和第二原液按照摩尔比SH:GMA＝1:1的用量分别加入双头注射器的AB管中，缓慢推出得到γ-PGA水凝胶，成胶时间10min。
实施例6
步骤(1)和步骤(2)与实施例5相同。
(3)用PBS缓冲液(0.01M，pH＝7.6)分别配置水凝胶的第一原液和第二原液，第一原液溶质为γ-PGA-SH，第二原液溶质为γ-PGA-GMA。第一原液中，γ-PGA-SH的浓度为11wt％；第二原液中，γ-PGA-GMA的浓度为11wt％。将第一原液和第二原液按照摩尔比SH:GMA＝1:1的用量分别加入双头注射器的AB管中，缓慢推出得到γ-PGA水凝胶，成胶时间19min。
实施例7
步骤(1)和步骤(2)与实施例5相同。
(3)用PBS缓冲液(0.01M，pH＝7.8)分别配置水凝胶的第一原液和第二原液，第一原液溶质为γ-PGA-SH，第二原液溶质为γ-PGA-GMA。第一原液中，γ-PGA-SH的浓度为13wt％；第二原液中，γ-PGA-GMA的浓度为13wt％。将第一原液和第二原液按照摩尔比SH:GMA＝1:1的用量分别加入双头注射器的AB管中，缓慢推出得到γ-PGA水凝胶，成胶时间15min。
实施例8
步骤(1)和步骤(2)与实施例5相同。
(3)用PBS缓冲液(0.01M，pH＝7.4)在37℃条件下分别配置水凝胶的第一原液和第二原液，第一原液溶质为γ-PGA-SH，第二原液溶质为γ-PGA-GMA。第一原液中，γ-PGA-SH的浓度为11wt％；第二原液中，γ-PGA-GMA的浓度为11wt％。将第一原液和第二原液按照摩尔比SH:GMA＝1:1的用量分别加入双头注射器的AB管中，缓慢推出得到γ-PGA水凝胶，成胶时间20min。将得到的水凝胶冻干后对内部截面进行扫描电镜表征，其扫描电镜图片如图2所示。
实施例9
步骤(1)和步骤(2)与实施例5相同。
(3)用PBS缓冲液(0.01M，pH＝7.4)在37℃条件下分别配置水凝胶的第一原液和第二原液，第一原液溶质为γ-PGA-SH，第二原液溶质为γ-PGA-GMA。第一原液中，γ-PGA-SH的浓度为11wt％；第二原液中，γ-PGA-GMA的浓度为11wt％。将第一原液和第二原液按照摩尔比SH:GMA＝1:1的用量分别加入双头注射器的AB管中，缓慢推出得到γ-PGA水凝胶，同时采用365nm的紫外光照射，成胶时间1min。
实施例10：细胞毒性评价实验
采用死活染色评价γ-聚谷氨酸水凝胶的细胞相容性，实验对象为小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3)。具体实验步骤为：(1)将NIH 3T3细胞培养在含10％胎牛血清和1％双抗的高糖DMEM培养基中，置于37℃、CO2培养箱中直到细胞汇合率达80％后，用胰蛋白酶消化后离心，并用培养基调整细胞密度为1×104cell/mL的细胞悬液；(2)然后接种该细胞悬液到48孔板中，每孔100μL，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中培养24小时贴壁后；(3)吸出原有的培养液，分别加入500μL不同的γ-PGA-SH聚合物和γ-PGA-GMA聚合物前驱体溶液和空白对照液(即新鲜完全培养基)，每组共3个平行样本；(4)分别在24h，48h，72h三个时间点每孔按照每毫升加入20μL的比例加入AO/EB染色工作液，37℃恒温培养箱中放置5min后于荧光倒置显微镜下观察荧光染色的细胞。染色后的细胞在荧光显微镜下，可见四种细胞形态：活细胞(VN)，核染色质着绿并呈正常结构；早期凋亡细胞(VA)，核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；晚期凋亡细胞(NVA)，核染色质着橘红色并呈正常结构。
细胞相容性实验结果如图3所示，仅有极少量晚期凋亡细胞(NVA)，其余都表现为活细胞(VN)。
注①：染色工作液配置：将吖啶橙(AO)溶液和溴化乙锭(EB)溶液按体积比1:1混合成工作液，现用现配。本实验AO、EB溶液浓度分别为100μg/ml，所含稳定剂不影响实验效果。
实施例11
γ-PGA水凝胶3T3细胞三维培养：用PBS(0.01M，pH＝7.4)配置水凝胶前体液(11％wtγ-PGA-SH和11％wtγ-PGA-GMA)，经过0.22μm滤膜除菌。无菌条件下，按照1×107cell/mL的细胞最终密度与聚合物溶液混匀，在直径1cm的模具中充分进行迈克尔加成反应形成块状水凝胶。随后，将水凝胶置于24孔板中加入1ml新鲜培养基培养，24h后换液，不同时间点间取出水凝胶样品用上述的AO-EB染色工作液染色2-6h，用荧光共聚焦显微镜观察水凝胶内三维培养细胞的生长情况。
由荧光共聚焦显微照片所示，3T3细胞封装在γ-聚谷氨酸水凝胶中培养24h后均具有较高的细胞活性，在支架中的细胞形态大多呈圆形并在三维网络结构中均匀分布。存活的细胞呈现出强的绿色荧光，代表死细胞的红色荧光则相对较少，说明制备的γ-聚谷氨酸水凝胶支架均具有良好的细胞相容性并有望成为细胞培养的新型支架材料。
综上表明，我们提供了一种利用γ-聚谷氨酸(γ-PGA)通过迈克尔加成反应来构建的仿生水凝胶支架材料不仅具有一定强度的机械性能，也具有优良的细胞相容性，有望包载细胞来构建组织工程支架，用于促进受损组织的再生与重建，因此在医用敷料、药物载体和细胞支架等领域具有广阔的市场应用前景。
Claims (10)
1.一种原位交联的γ-聚谷氨酸水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备半胱胺分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物；
(2)制备甲基丙烯酸缩水甘油酯分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物；
(3)分别配置第一原液和第二原液，所述第一原液的溶质为步骤(1)得到的所述半胱胺分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物，溶剂为PBS缓冲液，所述第二原液的溶质为步骤(2)得到的甲基丙烯酸缩水甘油酯分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物，溶剂为PBS缓冲液；将所述第一原液和所述第二原液混合成型，即得所述原位交联的γ-聚谷氨酸水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括如下步骤：
(1-1)向含有γ-聚谷氨酸的水溶液或含有γ-聚谷氨酸的缓冲溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺后活化；
(1-2)将半胱胺盐酸盐加入到步骤(1-1)活化后的体系中，反应18～32h后于水中透析，即得所述半胱胺分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1-1)所述的含有γ-聚谷氨酸的水溶液或含有γ-聚谷氨酸的缓冲溶液的pH为4～6。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1-1)中，所述含有γ-聚谷氨酸的水溶液或含有γ-聚谷氨酸的缓冲溶液的浓度为10～30g/L。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1-1)中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1～3:1；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与γ-聚谷氨酸中羧基的摩尔比为1～3:1。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括如下步骤：
向γ-聚谷氨酸的水溶液中加入甲基丙烯酸缩水甘油酯，并调节pH＝4.5～5，于50～65℃下反应6～10h后于水中透析后即得所述甲基丙烯酸缩水甘油酯分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述第一原液中，所述半胱胺分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物的质量浓度为5％～15％；所述第二原液中，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物的质量浓度为5％～15％。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述第一原液和所述第二原液的用量满足：半胱胺分子上的巯基与甲基丙烯酸缩水甘油酯上的双键的摩尔比为1:0.2～3。
9.权利要求1-8所述制备方法制得的原位交联的γ-聚谷氨酸水凝胶。
10.权利要求1-8所述制备方法制得的原位交联的γ-聚谷氨酸水凝胶在组织工程材料领域中的应用。
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