CN112999418B - 医用水凝胶组合物、医用水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种医用水凝胶组合物、医用水凝胶及其制备方法，医用水凝胶组合物包括第一组分、第二组分以及第三组分；其中，所述第一组分包括修饰有醛基的透明质酸或其衍生物；所述第二组分包括水溶性壳聚糖或其衍生物；所述第三组分包括含有氨基的天然物质和海藻酸盐；其中，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物、所述水溶性壳聚糖或其衍生物、所述含有氨基的天然物质以及所述海藻酸盐的质量比为0.1～1:0.1～1:1～10:0.5～2。医用水凝胶组合物所用材料为水溶性天然高分子，生物相容性好，可以与细胞良好复合，降解产物安全无毒，不存在过敏反应或者毒性反应的潜在危险。

Description

医用水凝胶组合物、医用水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种医用水凝胶组合物，医用水凝胶及其制备方法，特别涉及一种水凝胶生物墨水及其制备方法和应用，更具体地，本发明涉及一种长期、高保真的体内生物墨水体系及其制备方法和应用，属于生物医用材料领域。
背景技术
三维生物打印技术已经能够制作各种高保真度(打印成品与设计的一致性程度)的组织工程支架，实现组织缺陷的精确修复，特别是在硬组织修复领域，目前已有3D打印的骨组织支架应用到临床，如3D打印金属髋臼杯等。然而，在软组织工程，特别是深部软组织领域，如大脑深处、血管、肌肉等方面，由于水凝胶的收缩/膨胀行为，所打印支架存在变形，缺乏长期的高保真打印结构，这仍然是限制软组织3D打印支架向临床转化的主要障碍。收缩行为往往导致支架对组织缺损的填充不够完全，且使水凝胶内部网络过于密集，无法进行有效的营养和氧气输送。膨胀行为会导致缺损部位的高张力，致使组织修复迟缓，以及持续的内部机械载荷导致支架结构破碎。
到目前为止，大多数报道试图通过改善生物墨水的粘弹性或在体内直接进行光敏生物打印来实现软组织的精确修复。然而，仅仅提高打印保真度并不一定能保证结构体的长期的体内保真度。此外，在这些结构中，因为高交联度、光引发剂等因素影响，封装的细胞通常缺乏长期的细胞活力。为了解决这一障碍，有必要寻找一种生物墨水，可以实现长期体内保真度、长期细胞存活率和适用于体温打印的生物墨水。
由于良好的生物相容性、易于使用和价格低廉等因素，明胶(GEL)和海藻酸盐(ALG)是目前研究最多、最成熟、最有望向临床转化的生物墨水系统，因此，对该生物墨水系统进行改进是实现上述要求的一种经济实用的途径。在此体系中，所得凝胶受到钙离子浓度的影响较大，在体内环境下，钙离子无法进行有效补充，钙离子浓度的降低致使水凝胶不断溶解，导致结构体坍缩。收缩行为通常通过增加明胶比例来抵消。然而，过量的明胶使结构过于致密而无法进行物质交换，不利于细胞存活。同时，上述凝胶的温度敏感性也限制了其只能在低温环境下打印成型，限制了应用场景。
透明质酸(HA)和壳聚糖都是常见的生物相容性天然高分子，比GEL具有更强的吸水和保水性。这两种多糖均以醛基透明质酸(AHA)和N-羧甲基壳聚糖(CMC)的形式被广泛用于制备基于席夫碱键合的可注射细胞负载水凝胶。但过大的吸水率以及席夫碱的动态交联性能，使得该类水凝胶在水环境下进行过度的膨胀直至碎裂。
引用文献1公开了一种动态交联双网络水凝胶及其制备方法与应用。所述动态交联双网络水凝胶由主网络和次网络于水性介质中经穿插缠结形成；主网络为动态的共价键交联聚合物；次网络为离子键交联聚合物；共价键交联聚合物由聚合物A与聚合物B经共价键交联形成；离子键交联聚合物由聚合物C与离子化合物经离子键交联形成。但是该动态交联双网络水凝胶所采用人工合成材料，其生物相容性受到极大限制，很难作为包载细胞的水凝胶用于3D打印。
引用文献2公开了一种基于天然高分子且强度和成胶时间可调的水凝胶细胞支架，水凝胶细胞支架的制备方法包括如下步骤：(1)制备氧化海藻酸钠：使海藻酸钠与高碘酸钠发生氧化反应得到部分链段含醛基的氧化海藻酸钠；(2)测定步骤(1)所得氧化海藻酸钠的醛基含量；(3)检测明胶中的氨基含量；(4)分别配制浓度为15wt％的明胶溶液和浓度为4wt％的羧甲基壳聚糖溶液；(5)将步骤(4)所得的明胶水溶液和羧甲基壳聚糖水溶液混合；(6)在所述明胶和羧甲基壳聚糖中总氨基量与所述氧化海藻酸钠中醛基量等摩尔的条件下，使步骤(5)所得明胶水溶液和羧甲基壳聚糖水溶液的混合溶液与步骤(1)中所得氧化海藻酸钠混合反应。但是该水凝胶细胞支架仅利用了醛基和氨基产生的席夫碱反应，成胶后结合位点数量固定，随着水解作用会逐渐断链，无法实现长期体内保真度，另外，其固定成胶时间也不适用于3D打印使用。
引用文献3公开了一种可注射水凝胶材料及其制备方法、应用。所述可注射水凝胶材料由A组分和B组分采用双联注射工艺等体积注射原位生成；所述A组分为羧甲基壳聚糖，所述B组分由双醛化多糖与辅助交联剂、醛基化造影剂反应得到。但是该可注射水凝胶材料利用了原位发生的席夫碱反应成胶，其溶胶-凝胶转变是在双组分接触后才开始的，对于3D打印来说，其成胶时间过于缓慢，无法良好赋型，其不适用于3D打印使用。
引用文献：
引用文献1：CN108864494A
引用文献2：CN111704729A
引用文献3：CN110404083A
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术中存在的技术问题，例如：无法实现长期体内保真度以及长期细胞存活率，另外，其不适用于3D打印使用，尤其不适用在34-40℃的温度下打印等，本发明首先提供了一种医用水凝胶组合物和医用水凝胶。本发明的医用水凝胶组合物制备得到的医用水凝胶通过两种不同凝胶网络的水凝胶体系进行共混，抵消了各自的收缩/膨胀性能，通过调节参比，也降低了医用水凝胶体系的温度敏感性，使其可以在体温条件下打印成型。
进一步地，本发明的医用水凝胶的粘弹性、可打印性，长期水环境下打印的结构的稳定性和保真度异，且长期的细胞生存能力和扩散能力较强。
进一步地，本发明还提供了一种医用水凝胶的制备方法，该制备方法简单易行，原料易于获取，适合大批量生产。
用于解决问题的方案
本发明提供一种医用水凝胶组合物，其包括第一组分、第二组分以及第三组分；其中，所述第一组分包括修饰有醛基的透明质酸或其衍生物；所述第二组分包括水溶性壳聚糖或其衍生物；所述第三组分包括含有氨基的天然物质和海藻酸盐；其中，
所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物、所述水溶性壳聚糖或其衍生物、所述含有氨基的天然物质以及所述海藻酸盐的质量比为0.1～1:0.1～1:1～10:0.5～2。
根据本发明的医用水凝胶组合物，其中，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物中，醛基的含量为10％～50％，优选为20～40％，更优选为23.85％～31.05％。
根据本发明的医用水凝胶组合物，其中，所述含有氨基的天然物质包括蛋白质或其衍生物、明胶或其衍生物、胶原或其衍生物中的一种或两种以上的组合；优选为明胶或其衍生物。
根据本发明的医用水凝胶组合物，其中，所述水溶性壳聚糖或其衍生物的数均分子量为100000-200000Da，羧化度为80-90％；和/或，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物的数均分子量为1000-1500kDa。
本发明还提供一种医用水凝胶，其由本发明所述的医用水凝胶组合物的第一组分、第二组分以及第三组分反应后形成；优选地，所述医用水凝胶由所述第一组分、所述第二组分以及所述第三组分在缓冲溶液中反应后形成。
根据本发明所述的医用水凝胶，其中，所述医用水凝胶包括修饰有醛基的透明质酸或其衍生物与水溶性壳聚糖或其衍生物交联形成的第一凝胶体系；以及
含有氨基的天然物质与海藻酸盐形成的第二凝胶体系。
本发明还提供一种根据本发明的医用水凝胶的制备方法，其中，包括以下步骤：
将修饰有醛基的透明质酸或其衍生物溶于缓冲溶液中，得到第一反应液；
将水溶性壳聚糖或其衍生物溶于缓冲溶液中，得到第二反应液；
将含有氨基的天然物质与海藻酸盐混合并溶于缓冲溶液中，得到第三反应液；
将第二反应液与第三反应液混合后再与第一反应液混合，得到医用水凝胶。
根据本发明所述的制备方法，其中，所述第一反应液中，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物的质量体积浓度为2～6％；和/或，所述第二反应液中，所述水溶性壳聚糖或其衍生物的质量体积浓度为0.5～5％；和/或，所述第三反应液中，所述含有氨基的天然物质的质量体积浓度为5-15％，所述海藻酸盐的质量体积浓度为0.5～5％。
根据本发明所述的制备方法，其中，所述第一反应液、第二反应液、第三反应液的至少一种中含有细胞和/或生长因子，优选所述第一反应液中包含有细胞和/或生长因子。
本发明还提供一种医用水凝胶试剂盒，其包括本发明所述的医用水凝胶组合物以及用于溶解医用水凝胶组合物的各组分的缓冲溶液。
根据本发明的医用水凝胶试剂盒，其中，所述医用水凝胶组合物的第一组分、第二组分以及第三组分是分开储存的；
优选地，所述第二组分中的水溶性壳聚糖或其衍生物和海藻酸盐是分开储存的。
本发明还提供一种成型体，其使用本发明所述的医用水凝胶经3D打印制备得到；优选地，利用可溶性盐对所述成型体进行交联。
本发明又提供一种根据本发明所述的成型体的用途，其中，所述成形体用于制备细胞负载支架、体外活细胞模型、组织修复支架、医用载体中的用途。
发明的效果
本发明的医用水凝胶组合物和医用水凝胶至少具有以下效果之一：
1)医用水凝胶组合物所用材料为水溶性天然高分子，生物相容性好，可以与细胞良好复合，降解产物安全无毒，不存在过敏反应或者毒性反应的潜在危险；
2)医用水凝胶中的医用水凝胶组合物的用量较少，含水量大，通透性好，便于营养物质和新陈代谢废物的传递；
3)本发明的医用水凝胶对于温度敏感性较低，所得类组织体在34-40℃环境下成型可得到满足临床上的拉伸、卷曲等高强度操作；
4)医用水凝胶组合物在制备医用水凝胶时交联反应条件温和，不损伤细胞；
5)医用水凝胶存在稳定的交联键，使得打印制得的类组织体具有较高的保真度，在30天仍保持形状，为组织修复提供支架；
6)本发明的医用水凝胶配制过程简单，即配即用，降低了配液难度，降低了人员培训成本。
附图说明
图1示出了医用水凝胶组合物在制备医用水凝胶时交联位点示意图；
图2示出了医用水凝胶的FTIR测试结果；
图3示出了医用水凝胶的成胶强度测试结果；
图4示出了医用水凝胶的可打印性测试结果；
图5示出了医用水凝胶在水环境下的保真度测试结果；
图6A和图6B示出了医用水凝胶的细胞相容性测试结果；
图7示出了医用水凝胶的细胞增殖测试结果。
具体实施方式
以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方案、具体例子而进行，但本发明不限定于这些实施方案、具体例子。需要说明的是：
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中，如没有特殊声明，则“多”、“多种”、“多个”等中的“多”表示2或以上的数值。
本说明书中，所述“基本上”、“大体上”或“实质上”表示于相关的完美标准或理论标准相比，误差在5％以下，或3％以下或1％以下。
本说明书中，如没有特别说明，则“％”均表示质量百分含量。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
<第一方面>
本发明的第一方面提供一种医用水凝胶组合物，其包括第一组分、第二组分以及第三组分；其中，所述第一组分包括修饰有醛基的透明质酸或其衍生物；所述第二组分包括水溶性壳聚糖或其衍生物；所述第三组分包括含有氨基的天然物质和海藻酸盐；其中，
所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物、所述水溶性壳聚糖或其衍生物、所述含有氨基的天然物质以及所述海藻酸盐的质量比为0.1～1:0.1～1:1～10:0.5～2。
其中，所述第一组分、第二组分和第三组分均可以是分离的，在使用时将第一组分、第二组分和第三组分混合。优选地，所述第三组分中的含有氨基的天然物质和海藻酸盐也是分离的，在使用之前几个小时或使用时将含有氨基的天然物质和海藻酸盐混合。
在实际应用的过程中，所述第一组分、第二组分以及第三组分均是分开储存的，使用前或使用时再分别溶解于缓冲溶液之后再进行混合。所述第三组分中的含有氨基的天然物质和海藻酸盐也可以分别单独储存，使用前或使用时再分别溶解于缓冲溶液之后再进行混合；当然也可以先进行混合，再将其溶于缓冲溶液中。本发明对所述的医用水凝胶组合物中的各组分的储存方式没有限制，所属技术领域人员可以根据需要，选择具体的储存方式，均在本发明的范围之内。
本发明的第一组分包括修饰有醛基的透明质酸或其衍生物。对于修饰有醛基的透明质酸或其衍生物，本发明对于醛基的修饰方式不作特别限定，可以是本领域常用的一些修饰方式，例如：在透明质酸上接枝醛基、取代获得醛基或者开环氧化得到醛基等。具体地，在本发明中，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物中，醛基的含量为10％～50％，优选20％～40％，更优选为23.85％～31.05％，例如：15％、25％、30％、35％、45％等。当醛基的含量为10％～50％时，有利于与水溶性壳聚糖或其衍生物发生反应，具有优异的成胶性能。
为了保证较好的凝胶强度，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物的数均分子量为1000～1500kDa。对于修饰有醛基的透明质酸或其衍生物的来源，本发明不作特别限定，可以是本领域常用的制备方法制备得到。例如：利用氧化剂对透明质酸或其衍生物进行氧化得到。
本发明的所述第二组分包括水溶性壳聚糖或其衍生物。对于水溶性壳聚糖或其衍生物，包括但不限于取代化壳聚糖(例如：羧甲基壳聚糖(CMC)、羟丙基壳聚糖(HPCS))、壳聚糖盐类(例如：壳聚糖盐酸盐、壳聚糖季铵盐、壳聚糖乳酸盐、壳聚糖谷氨酸盐等)、壳聚糖硫酸酯、壳聚糖寡糖、类透明质酸壳聚糖等，以及上述水溶性壳聚糖作为接枝原料的水溶性共聚物。
进一步，在本发明中，为保证较好的凝胶强度，所述水溶性壳聚糖的数均分子量100～200kDa。
本发明的所述第三组分包括含有氨基的天然物质和海藻酸盐。对于含有氨基的天然物质，在本发明中不作特别限定，只要其含有氨基即可。具体地，所述含有氨基的天然物质包括蛋白质或其衍生物、明胶或其衍生物、胶原或其衍生物中的一种或两种以上的组合，优选为明胶或其衍生物。
对于海藻酸盐，在本发明中不作特别限定，可以是本领域常用的一些海藻酸盐，例如海藻酸钠、海藻酸钾等。本发明通过使用海藻酸盐，其与含有氨基的天然物质(例如：明胶或其衍生物等)之间具有静电引力作用，能够使含有氨基的天然物质通过静电引力吸附于凝胶网络中，形成较为稳定的凝胶态。
在本发明中，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物、所述水溶性壳聚糖或其衍生物、所述含有氨基的天然物质以及所述海藻酸盐的质量比为0.1～1:0.1～1:1～10:0.5～2，当所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物、所述水溶性壳聚糖或其衍生物、所述含有氨基的天然物质以及所述海藻酸盐的质量比为0.1～1:0.1～1:1～10:0.5～2时，凝胶时间是最合适的，3D打印效果最好。
本发明的医用水凝胶组合物所使用的材料为水溶性天然高分子，生物相容性好，可以与细胞良好复合，降解产物安全无毒，不存在过敏反应或者毒性反应的潜在危险。
<第二方面>
本发明的第二方面提供一种医用水凝胶，其由本发明第一方面所述的医用水凝胶组合物的第一组分、第二组分、第三组分反应后形成；优选地，所述医用水凝胶由所述第一组分、所述第二组分以及所述第三组分在缓冲溶液中反应后形成。
对于缓冲溶液，本发明不作特别限定，可以是本领域常用的生物缓冲溶液，优选使用pH值为7.2～7.4的缓冲溶液。例如：磷酸盐缓冲溶液等(PBS缓冲溶液)等。
具体地，所述医用水凝胶包括修饰有醛基的透明质酸或其衍生物与水溶性壳聚糖或其衍生物交联形成的第一凝胶体系；以及
含有氨基的天然物质与海藻酸盐形成的第二凝胶体系。
本发明公开一种长期的体内高保真度医用水凝胶体系，该医用水凝胶通过两种不同凝胶网络的水凝胶体系进行共混，抵消了各自的收缩/膨胀性能，通过调节参比，也降低了医用水凝胶体系的温度敏感性，使其可以在体温条件下打印成型。
本发明的第一凝胶体系是由席夫碱共价键作为主要交联基团的凝胶体系，具体地，是指由修饰有醛基的透明质酸或其衍生物与水溶性壳聚糖或其衍生物通过席夫碱共价键交联形成的凝胶体系。在此第一凝胶体系中，修饰有醛基的透明质酸或其衍生物与水溶性壳聚糖或其衍生物的氨基通过席夫碱反应形成动态交联的共价键，从而获得第一凝胶体系。
本发明的第二凝胶体系，其可以是由静电作用形成的凝胶体系。具体地，是由含有氨基的天然物质和海藻酸盐经静电作用形成的水凝胶体系。本发明的第二凝胶体系，还可以是静电作用形成的第二凝胶体系。具体地，是由含有氨基的天然物质和海藻酸盐经静电作用形成的第二凝胶体系。
在本发明的双相凝胶体系中，修饰有醛基的透明质酸或其衍生物与水溶性壳聚糖上的氨基形成席夫碱反应，成胶强度最高，但可逆性较差；含有氨基的天然物质和海藻酸盐形成的静电作用较弱，可逆性好。在本发明的医用水凝胶体系中，席夫碱反应形成酰亚胺结构是主要成胶位点，静电相互作用起到了增强作用。通过互补的方式，从而可以获得本发明的具有高保真以及长期稳定性的医用水凝胶。
进一步地，在本发明中，还可以利用可溶性盐对所述医用水凝胶进行进一步的交联，所述可溶性盐优选为水溶性铝盐、钠盐、钙盐和铁盐中的一种或多种，更优选为钙盐，例如氯化钙等。本发明通过使用可溶性盐对医用水凝胶进行进一步的处理以增加成胶强度，从而能够使医用水凝胶能够用于强度要求较高的领域。
具体地，本发明的海藻酸盐与可溶性盐中的阳离子(例如钙离子)相遇后能够迅速发生离子交换，海藻酸盐与可溶性盐中的阳离子(例如钙离子)经螯合作用形成凝胶，在此过程中，含有氨基的天然物质通过静电引力吸附于凝胶网络中，从而形成较为稳定的凝胶态。
本发明的医用水凝胶由于第一凝胶体系和第二凝胶体系以及海藻酸盐与可溶性盐的阳离子的离子螯合作用，因此，具有较弱的温度依赖性。通过传统的室温打印和37℃的体内模拟打印即可制作得到完整的组织体(成型体)。
<第三方面>
本发明的第三方面提供了一种根据本发明第二方面的医用水凝胶的制备方法，其包括以下步骤：
将修饰有醛基的透明质酸或其衍生物溶于缓冲溶液中，得到第一反应液；
将水溶性壳聚糖或其衍生物溶于缓冲溶液中，得到第二反应液；
将含有氨基的天然物质与海藻酸盐混合并溶于缓冲溶液中，得到第三反应液；
将第二反应液与第三反应液混合后再与第一反应液混合，得到医用水凝胶。
本发明通过先将第二反应液与第三反应液混合，搅拌后便于形成均一且具有初步强度的半凝胶，初步强度可使胶体中成分不发生分相；然后再与第一反应液混合，搅拌时随着修饰有醛基的透明质酸或其衍生物的分散，逐步形成具有不可逆强度的、均一、稳定的胶体。
在一些具体的实施方案中，所述第一反应液中，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物的质量体积浓度为2～6％，例如2.5％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％等；和/或，所述第二反应液中，所述水溶性壳聚糖或其衍生物的质量体积浓度为0.5～5％，例如1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％等；和/或，所述第三反应液中，所述含有氨基的天然物质的质量体积浓度为5-15％，例如6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％等，所述海藻酸盐的质量体积浓度为0.5～5％，例如1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％等。
在一些具体的实施方案中，所述第一反应液、第二反应液、第三反应液的至少一种中含有细胞和/或生长因子优选所述第一反应液中包含有细胞和/或生长因子。优选地，为避免相变过程对细胞的潜在伤害，优选所述第一反应液中包含有细胞和/或生长因子。
具体地，适用于本发明的细胞可以是任何可行的生物活细胞。例如可以是任何一种脊椎动物细胞、哺乳动物细胞、人的细胞或其组合，其类型取决于所生产的细胞构建体、组织或器官的类型。例如所述细胞可以包括并不限于为收缩性细胞或肌肉细胞、结缔组织细胞、骨髓细胞、内皮细胞、皮肤细胞、上皮细胞、乳腺细胞、血管细胞、血细胞、淋巴细胞、神经细胞、胃肠道细胞、肝细胞、胰腺细胞、肺细胞、气管细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、肾细胞、生殖细胞、脂肪细胞、间皮细胞、间质细胞、内胚层源细胞、中胚层源细胞、外胚层源细胞及其组合。
具体地，所述细胞可以单独冻存在液氮罐中，需要时解冻复苏，复苏后用缓冲溶液洗涤2-4次，离心去除缓冲溶液，用细胞培养基重悬并计数，进而添加至第三反应液中。
对于生长因子，所述生长因子包括但不限于神经生长因子、表皮生长因子、骨骼生长因子、造血生长因子、内皮生长因子、胶质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、多肽生长因子中的一种或任意几种。
本发明通过将生长因子引入医用水凝胶中，优点在于可以给医用水凝胶中的细胞提供营养。在运用3D打印技术打印出支架，生长因子可以促进水凝胶支架上的细胞分化、增值，加速组织重建。
本发明的医用水凝胶存在至少二个成胶位点，修饰有醛基的透明质酸或其衍生物与水溶性壳聚糖或其衍生物的席夫碱键合、含有氨基的天然物质与海藻酸盐的静电相互作用。
本发明的医用水凝胶可用于包括但不限于活细胞、生长因子、体内/表皮封堵剂、体内/表皮粘合剂等功能性组分的递送介质。具体地，本发明的医用水凝胶可以在生物打印(例如3D生物打印)、体外细胞培养、体内组织修复、水凝胶覆盖与封堵、体内含细胞凝胶注射等方面中的应用。
<第四方面>
本发明的第四方面提供了一种医用水凝胶试剂盒，其包括本发明第一方面所述的医用水凝胶组合物以及用于溶解医用水凝胶组合物的各组分的缓冲溶液。
根据本发明的医用水凝胶试剂盒，所述医用水凝胶组合物的第一组分、第二组分以及第三组分均是分开储存的；优选地，所述第三组分中的含有氨基的天然物质和海藻酸盐是分开储存的。
<第五方面>
本发明的第五方面提供了一种成型体，所述成型体包括使用本发明的第二方面的医用水凝胶经3D打印制备得到。
进一步地，在本发明中，还可以利用可溶性盐对所述成型体进行进一步的交联，所述可溶性盐优选为水溶性铝盐、钠盐、钙盐和铁盐中的一种或多种，更优选为钙盐，例如氯化钙等。本发明通过使用可溶性盐对成型体进行进一步的处理以增加成胶强度，从而能够使成型体保持更长效的结构稳定性。
具体地，本发明的海藻酸盐与可溶性盐中的阳离子(例如钙离子)相遇后能够迅速发生离子交换，海藻酸盐与可溶性盐中的阳离子(例如钙离子)经螯合作用形成凝胶，在此过程中，含有氨基的天然物质通过静电引力吸附于凝胶网络中，从而形成较为稳定的凝胶态。
本发明的成型体由于第一凝胶体系和第二凝胶体系以及海藻酸盐与可溶性盐的阳离子的离子螯合作用，因此，具有较弱的温度依赖性。通过传统的室温打印和37℃的体内模拟打印即可制作得到完整的组织体(成型体)。
进一步，本发明的医用水凝胶通过生物3D打印、直接挤出、体内3D打印、体内挤出等方式制得的类组织体或水凝胶，可保持30天以内的尺寸稳定性和保真度，线性膨胀率不超过10％。
进一步地，所述成形体用于制备细胞负载支架、体外活细胞模型、组织修复支架、医用载体中的用途。所述医用载体可以是植入药物、造影剂、示踪剂、生物制剂时的医用载体。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
实施例中，用稀HCL将去离子水的PH调节到6.0，称取1.5g透明质酸溶于150mL pH为6.0的去离子水中，磁力搅拌1天使其充分溶解。然后加入16.5mL，0.25mol/L的高碘酸钠溶液，40℃磁力搅拌3h后加入30mL乙二醇终止反应，将反应液移至截留分子量为14000的透析袋中，将透析袋置入去离子水中透析3天，每8h换水一次。而后将透析后的反应液冷冻干燥即得AHA。经羟胺基法显色滴定分析，如上制备的AHA中，醛基的含量为27.45±3.60％。修饰有醛基的透明质酸的数均分子量为1000-1500kDa。
透明质酸(Mn＝1000-1500kDa，1604073，山东福瑞达医药集团有限公司，中国)
壳聚糖(Mn＝100000-200000Da，羧化度：83.42％，C832672，上海麦克林生化科技有限公司，中国)
明胶(记作GEL：V900863，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，中国)
海藻酸钠(记作ALG：A0682，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，中国)
羧甲基壳聚糖(CMC)、羟丙基壳聚糖(HPCS)：上海麦克林生化科技有限公司，中国，数均分子量为100-200kDa；
明胶、胶原：GELITA嘉利达有限公司，德国。
实施例1
将0.4g的修饰有醛基的透明质酸(AHA)溶于10mL无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)中，4℃环境下搅拌过夜，形成4％(w/v)的)的第一反应液，记作AHA溶液；
将0.15g的羧甲基壳聚糖(CMC)溶于10mL无菌的PBS中，37℃环境下搅拌直至溶解，形成1.5％(w/v)的第二反应液，记作CMC溶液；
将1g的明胶(GEL)和0.2g的海藻酸钠(ALG)同时溶于10mL无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)中，37℃环境下搅拌直至溶解，形成第三反应液，记作：GEL-ALG溶液；
将CMC溶液和GEL-ALG溶液按照体积比2：1混合，并采用巴氏消毒法，在70℃和4℃分别放置30min为一个循环，执行3个循环用以杀菌，形成无菌的第一混合液，记作：GEL-ALG/CMC溶液；
通过0.22μm微孔滤膜过滤AHA溶液除菌；
将GEL-ALG/CMC溶液和AHA溶液按照3：1的体积比混合均匀，静待5min成胶即得所述医用水凝胶，记作GEL-ALG/CMC/AHA生物墨水；
所得生物墨水中，AHA的终浓度1％(w/v)、GEL的终浓度5％(w/v)、ALG的终浓度0.375％(w/v)、CMC的终浓度1％(w/v)。
实施例2
将0.4g的修饰有醛基的透明质酸(AHA)溶于10mL无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)中，4℃环境下搅拌过夜，形成4％(w/v)的)的第一反应液，记作AHA溶液；
将0.15g的羧甲基壳聚糖(CMC)溶于10mL无菌的PBS中，37℃环境下搅拌直至溶解，形成1.5％(w/v)的第二反应液，记作CMC溶液；
将1g的明胶(GEL)和0.2g的海藻酸钠(ALG)同时溶于10mL无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)中，37℃环境下搅拌直至溶解，形成第三反应液，记作：GEL-ALG溶液；
将CMC溶液和GEL-ALG溶液按照体积比2：1混合，并采用巴氏消毒法，在70℃和4℃分别放置30min为一个循环，执行3个循环用以杀菌，形成无菌的第一混合液，记作：GEL-ALG/CMC溶液；
通过0.22μm微孔滤膜过滤AHA溶液除菌，并加入细胞含量为1.5×106/mL的NIH/3T3细胞；
将GEL-ALG/CMC溶液和AHA溶液按照3：1的体积比混合均匀，静待5min成胶即得所述医用水凝胶，记作GEL-ALG/CMC/AHA生物墨水；
所得生物墨水中，AHA的终浓度1％(w/v)、GEL的终浓度5％(w/v)、ALG的终浓度0.375％(w/v)、CMC的终浓度1％(w/v)；
实施例3
在本实施例中，在AHA溶液中加入1.5×106/mL的L929细胞，并加入100μg/mL的成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)0.5mL，其余与实施例1操作方法相同。
实施例4
在本实施例中，将0.2g的修饰有醛基的透明质酸(AHA)溶于10mL无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)中，4℃环境下搅拌过夜，形成2％(w/v)的)的第一反应液，记作AHA溶液；其余操作与实施例1相同。
实施例5
在本实施例中，将0.3g的羧甲基壳聚糖(CMC)溶于10mL无菌的PBS中，37℃环境下搅拌直至溶解，形成3％(w/v)的第二反应液，记作CMC溶液；其余操作与实施例1相同。
对比例1
将1g的明胶(GEL)和0.2g的海藻酸钠(ALG)同时溶于10mL无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)中，37℃环境下搅拌直至溶解形成高粘度溶胶，将此溶胶置于3％氯化钙溶液中处理10min，记作：GEL-ALG生物墨水。其中，在对比例1中，为使对比例1与3D打印示例进行横向对比，且保证对比例1中的成胶条件多于实施例1，增加了3％氯化钙交联的步骤。
对比例2
取1.5×106/mL的NIH/3T3细胞1mL，加入含有10mL HG-DMEM培养基(培养基含有10％FBS和1％双抗)的90mm培养皿中，在5％CO2，37℃环境的细胞培养箱中进行培养，记为：2D组。
性能测试
1、3D打印
对实施例1以及对比例1的生物墨水进行3D打印(打印针头规格
Figure BDA0002958521880000161
Figure BDA0002958521880000171
Livprint Norm打印机，打印网格横纵角度90°，30％填充率，针头线性速度6mm/s，6层)，为保持更长效的结构稳定性，在打印后将上述生物墨水制成的类组织体在3％氯化钙溶液中处理20s以增强成胶强度。经打印后，实施例1的GEL-ALG/CMC/AHA生物墨水的交联位点示意图如图1所示。具体打印结果如图4所示。
本发明依次测试了常温生物墨水在常温条件下打印(图4中的A)、37℃生物墨水在常温环境下打印(图4中的B)、常温生物墨水在37℃条件下打印(图4中的C)以及与必须低温环境打印的GEL-ALG生物墨水(图4中的D)进行对比，发现GEL-ALG/CMC/AHA生物墨水对温度的敏感性很低，生物墨水温度以及打印温度对成胶性能的影响较小。同时，当生物墨水温度为37℃或打印温度为37℃(模拟体内直接打印)时，即可得到强度很高的类组织体，满足临床的拉伸、弯折等操作。
2、红外测试
本发明的水溶性壳聚糖的氨基会和修饰有醛基的透明质酸发生席夫碱反应生成酰亚胺基团。通过对比图2的FTIR结果，我们可以看到GEL-ALG/CMC/AHA曲线中，属于修饰有醛基的透明质酸中醛基的1725cm-1附近的C＝O对称伸缩振动、在838cm-1的C-H面外摇摆振动消失，在887cm-1附近出现了半缩醛结构基团，证明了席夫碱反应的发生。
在GEL-ALG体系中，明胶(GEL)通过静电相互作用被封装在海藻酸钠(ALG)溶胶体系中，当具有阳离子基团的羧甲基壳聚糖(CMC)加入后，羧甲基壳聚糖(CMC)也会和具有阴离子基团的海藻酸钠(ALG)发生静电相互作用，形成结合位点。
在经过CaCl2的增强处理后，Ca2+渗透入海藻酸钠(ALG)溶胶内部，与海藻酸钠(ALG)分子链发生离子螯合反应，形成半稳定的凝胶。
3、长期留驻测试
本发明将对比例1的GEL-ALG生物墨水(仅存在静电相互作用和离子螯合作用)和实施例1的GEL-ALG/CMC/AHA生物墨水(存在席夫碱反应、静电相互作用和离子螯合作用)体系分别成胶后倒置，37℃静置10min后(如图3所示)发现GEL-ALG体系随着时间逐渐液化，说明GEL-ALG的成胶强度和温度敏感性无法满足体内长期留驻的要求；而加入可形成席夫碱交联的水溶性壳聚糖和修饰有醛基的透明质酸成分的加入，大大增强了生物墨水的强度，降低了温度敏感性，使其具有体内长期高保真的潜力。
4、长期水环境保真度测试
通过将实施例1、实施例4、实施例5的GEL-ALG/CMC/AHA生物墨水和对比例1的GEL-ALG生物墨水进行3D打印后，在水环境浸泡和测量(如图5所示)，发现实施例1的GEL-ALG/CMC/AHA生物墨水在一次成型后，可保持30天尺寸稳定性；而对比例1的GEL-ALG生物墨水在第1天、第3天、第7天、第15天、第30天分别进行氯化钙交联的条件下，尺寸仍发生较为明显的收缩。
通过线性膨胀系数(LER＝SLt×100％/SL0)进行定量分析，GEL-ALG生物墨水在24h后最大达到66％膨胀系数变化；降低AHA含量后(实施例4)，生物墨水的部分降解使得GEL-ALG/CMC/AHA体系发生少量的收缩；增大CMC含量后(实施例5)，高吸水性和高保水性又使得GEL-ALG/CMC/AHA体系发生少量膨胀。综上，本发明所述的GEL-ALG/CMC/AHA生物墨水及其优化的配比可以在30天仍旧保持100％左右的线性膨胀系数，证明不发生明显的收缩/膨胀变化。
5、细胞相容性测试
利用本发明实施例2的GEL-ALG/CMC/AHA生物墨水进行试验。实施例2在打印后的含细胞类组织体上(NIH/3T3细胞，细胞含量1.5×106/mL)，利用活死染色和流式细胞分析的方法验证了GEL-ALG/CMC/AHA体系的生物相容性(如图6A和图6B所示)。
活死染色实验使用活死染色试剂盒(KGAF001,KeyGEN BioTECH,南京,中国)上的标准方法，染色后利用共聚焦荧光显微镜观察；
含细胞类组织体经上述方法染色后，利用55nM柠檬酸钠和20nM的乙二胺四乙酸混合溶液去除生物墨水，然后再37℃下利用0.25％(w/v)胰消化酶消解细胞团块3min，并经同等体积的、含10％FBS的MEM培养基清洗后离心，离心后利用PBS重新悬浮得到含染色细胞的悬液，利用流式细胞仪进行测试和分析。
从图中可以看出，GEL-ALG/CMC/AHA体系在打印后，出现了较多的活/死双染细胞，经分析认为GEL-ALG/CMC/AHA体系具有较高的初期凝胶强度，在经过微小挤出针头的过程中，部分细胞因剪切力的作用发生了损伤，细胞膜出现部分破损致使PI染料也通过的细胞膜进入到细胞核，发生了双染的情况。经过长时间的培养后，GEL-ALG/CMC/AHA体系中活细胞的数量开始高于GEL-ALG体系中的数量。在第19天和第29天的染色结果中，可以明显的看到GEL-ALG/CMC/AHA体系中的细胞存在扩展形态，证明此时GEL-ALG/CMC/AHA体系中的细胞仍旧具有较强活力。
Alamar Blue实验利用Alamar Blue试剂盒(40202ES76,YEASEN,上海，中国)上标注的标准方法进行。在Alamar Blue实验中，GEL-ALG/CMC/AHA和GEL-ALG包埋的细胞从第5天开始显著增殖，并在第17天达到高峰(图7中的A)。在GEL-ALG/CMC/AHA中，细胞在第17天增殖到3.61±0.19倍，而在GEL-ALG中，细胞增殖到3.29±0.22倍(图7中的A)。不同的是，GEL-ALG/CMC/AHA的细胞生长在第17天到第29天仍处于平台期，而GEL-ALG的细胞生长在第17天后呈下降趋势(图7中的A)。同样数量的细胞在2D环境中培养，第5天细胞增殖到2.39±0.08倍达到生长平台期，第9天细胞数量开始减少并出现波动(图7中的A)。
在第9天和第29天也进行了EdU掺入测定，结果与Alamar Blue测定结果一致。EdU是一种胸苷模拟物，在细胞周期的S期可以很容易地并入细胞DNA，因此它可以更灵敏地检测细胞增殖。EdU测定采取EdU试剂盒(C10338-3,Ribobio,中国)上标注的标准方法进行。第9天，GEL-ALG/CMC/AHA的EdU掺入率为14.16±1.23％，高于GEL-ALG的10.01±1.45％，而2D的EdU掺入率仅为1.17±0.29％(图7中的B，(i)-(iv))。29天，虽然细胞增殖GEL-ALG/CMC/AHA在Alamar Blue试验已进入平台期(图7)，但还有6.06±1.24％的EdU掺入率(图7中的B，(i)和(v)),表明细胞增殖是仍在继续。对于GEL-ALG体系，细胞的EdU掺入率仅为1.23±0.55％(图7中的B，(i)和(vi))，表明此时细胞几乎没有发生增殖。
由此可证明本发明所述生物墨水可以促使细胞更好地增殖，同时在长期培养时，仍保持更好的促细胞能力。
综上，本发明测试了粘弹性、可打印性，评估了的长期水环境下打印的结构的稳定性和保真度，并测量了长期的细胞生存能力和扩散能力，证明了本发明提供了一种简单、实用、精确的生物墨水，用于3D生物打印和软组织修复。
需要说明的是，尽管以具体实例介绍了本发明的技术方案，但本领域技术人员能够理解，本发明应不限于此。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。

Claims (19)

1.一种医用水凝胶组合物，其特征在于，包括第一组分、第二组分以及第三组分；其中，所述第一组分包括修饰有醛基的透明质酸或其衍生物；所述第二组分包括水溶性壳聚糖或其衍生物，所述水溶性壳聚糖或其衍生物的数均分子量为100000-200000Da；所述第三组分包括含有氨基的天然物质和海藻酸盐，所述含有氨基的天然物质包括蛋白质或其衍生物，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物的数均分子量为1000-1500kDa；
所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物与水溶性壳聚糖或其衍生物交联形成的第一凝胶体系；所述含有氨基的天然物质与所述海藻酸盐形成的第二凝胶体系；其中，
所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物、所述水溶性壳聚糖或其衍生物、所述含有氨基的天然物质以及所述海藻酸盐的质量比为0.1~1:0.1~1:1~10:0.5~2。
2.根据权利要求1所述的医用水凝胶组合物，其特征在于，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物中，醛基的含量为10%~50%。
3.根据权利要求2所述的医用水凝胶组合物，其特征在于，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物中，醛基的含量为20~40%。
4.根据权利要求2所述的医用水凝胶组合物，其特征在于，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物中，醛基的含量为23.85%~31.05%。
5.根据权利要求1-4任一项所述的医用水凝胶组合物，其特征在于，所述含有氨基的天然物质包括明胶或其衍生物、胶原或其衍生物中的一种或两种以上的组合。
6.根据权利要求1-4任一项所述的医用水凝胶组合物，其特征在于，所述水溶性壳聚糖或其衍生物的羧化度为80-90%。
7.一种医用水凝胶，其由权利要求1-6任一项所述的医用水凝胶组合物的第一组分、第二组分以及第三组分反应后形成。
8.根据权利要求7所述的医用水凝胶，其特征在于，所述医用水凝胶由所述第一组分、所述第二组分以及所述第三组分在缓冲溶液中反应后形成。
9.根据权利要求7所述的医用水凝胶，其特征在于，所述医用水凝胶包括修饰有醛基的透明质酸或其衍生物与水溶性壳聚糖或其衍生物交联形成的第一凝胶体系；以及
含有氨基的天然物质与海藻酸盐形成的第二凝胶体系。
10.一种根据权利要求7-9任一项所述的医用水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将修饰有醛基的透明质酸或其衍生物溶于缓冲溶液中，得到第一反应液；
将水溶性壳聚糖或其衍生物溶于缓冲溶液中，得到第二反应液；
将含有氨基的天然物质与海藻酸盐混合并溶于缓冲溶液中，得到第三反应液；
将第二反应液与第三反应液混合后再与第一反应液混合，得到医用水凝胶。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述第一反应液中，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物的质量体积浓度为2~6%；和/或，所述第二反应液中，所述水溶性壳聚糖或其衍生物的质量体积浓度为0.5~5%；和/或，所述第三反应液中，所述含有氨基的天然物质的质量体积浓度为5-15%，所述海藻酸盐的质量体积浓度为0.5~5%。
12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述第一反应液、第二反应液、第三反应液的至少一种中含有细胞和/或生长因子。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述第一反应液中包含有细胞和/或生长因子。
14.一种医用水凝胶试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-6任一项所述的医用水凝胶组合物以及用于溶解医用水凝胶组合物的各组分的缓冲溶液。
15.根据权利要求14所述的医用水凝胶试剂盒，其特征在于，所述医用水凝胶组合物的第一组分、第二组分以及第三组分是分开储存的。
16.根据权利要求15所述的医用水凝胶试剂盒，其特征在于，所述第三组分中的含有氨基的天然物质和海藻酸盐是分开储存的。
17.一种成型体，其特征在于，使用权利要求7-9任一项所述的医用水凝胶经3D打印制备得到。
18.根据权利要求17所述的成型体，其特征在于，利用可溶性盐对所述成型体进行交联。
19.一种根据权利要求17或18所述的成型体的用途，其特征在于，所述成型体用于制备细胞负载支架、体外活细胞模型、组织修复支架、医用载体中的用途。
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