CN110922645A - 一种双网络水凝胶组合物、双网络水凝胶生物支架及其制备方法和应用 - Google Patents

一种双网络水凝胶组合物、双网络水凝胶生物支架及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双网络水凝胶组合物、双网络水凝胶生物支架及其制备方法和应用。所述双网络水凝胶组合物包括醛基化透明质酸、羧甲基壳聚糖，乙烯基明胶和光交联引发剂，其中，醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖的质量比为1:1~5:1，乙烯基明胶与羧甲基壳聚糖的质量比为1:2~5:1。组合物中的醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖反应得到第一网络，乙烯基明胶光引发自由基聚合制备第二网络结构，形成的双网络水凝胶生物支架具备良好的结构稳定性、细胞相容性、生物安全性和优异的结构保真度，通过控制各组分的比例可调节水凝胶生物支架的压缩模量，使其达到压缩模量10~100KPa，适用于各类组织体的打印，且打印细胞活性在80%以上，进一步扩大了细胞生物支架材料的应用。

Description

一种双网络水凝胶组合物、双网络水凝胶生物支架及其制备 方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，更具体地，涉及一种双网络水凝胶组合物、双网络水凝胶生物支架及其制备方法和应用。
背景技术
现今，透明质酸、壳聚糖和明胶等材料作为可降解支架已在组织工程领域展开了广泛研究。透明质酸（HA）是一种天然可降解且降解产物可以被机体吸收的生物医学材料，在临床上用途也十分广泛。HA具有较强的黏弹性和润滑性，经过交联能够形成连续的大分子网状结构，不仅可以保持良好的生物相容性和天然的生物降解代谢方式，而且具有更好的机械强度和稳定性。高分子量的透明质酸能主动刺激内皮细胞的增生和转移，诱导体内血管生成，降解后的低分子量HA具有促血管生成作用。羧甲基壳聚糖也被称为水溶性甲壳素，具有优异的抗菌抗感染特性，因此可用于大面积烧伤烫伤，对于抗感染和促进伤口愈合效果很好，因此以壳聚糖作为细胞支架不仅具有优秀的生物相容性并能维持支架结构，维持细胞形态和表型，还能促进细胞黏附与增殖，诱导组织再生。但现有的单组分水凝胶生物墨水在体系培养过程中缺少功能性，比如材料的可打印性与打印结构的相似性之间的矛盾，生物支架机械强度与优异的生物活性和生物降解性之间的矛盾。现有技术中的双网络水凝胶生物支架多通过化学交联同时实现良好的功能性和生物相容性也是生物支架材料突破瓶颈的关键问题。
因此通过多材料复合的生物墨水体系的建立，有望为对组织功能化培育的生物支架的发展提供帮助。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有水凝胶生物支架功能性和生物相容性的缺陷和不足，提供一种双网络水凝胶组合物，通过双网络水凝胶组合物组分之间的反应构筑具有结构稳定性、细胞相容性、生物安全性的第一网络，利用紫外光辐照自由基聚合形成第二网络结构，双网络结构有利于加强和维持结构长期稳定的性质，具有优异的结构保真度。
本发明的另一目的在于提供一种双网络水凝胶生物支架。上述双网络水凝胶生物支架包括通过迈克尔加成反应形成的第一网络结构和通过紫外光引发自由基聚合反应形成的贯穿交错的第二网络结构。
本发明的又一目的在于提供一种双网络水凝胶生物支架的制备方法。
本发明的又一目的在于提供一种上述双网络水凝胶组合物在3D打印水凝胶生物支架中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种双网络水凝胶组合物，所述双网络水凝胶组合物包括醛基化透明质酸、羧甲基壳聚糖、乙烯基明胶和光交联引发剂，其中，醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖的质量比为1:1~5:1，乙烯基明胶与羧甲基壳聚糖的质量比为1:2~5:1。
本发明提供了一种包括醛基化透明质酸、羧甲基壳聚糖、乙烯基明胶、光交联引发剂的双网络水凝胶组合物，通过控制体系中醛基化透明质酸与羧甲基壳聚糖、乙烯基明胶组分的比例来调节水凝胶生物支架的压缩模量，使其达到压缩模量10~100KPa。通过醛基化透明质酸及羧甲基壳聚糖进行迈克尔加成反应来构筑具有结构稳定性、细胞相容性、生物安全性的第一网络；通过紫外光辐照引发乙烯基明胶聚合形成第二网络，使其具有维持结构长期稳定的性质，即优异的结构保真度。
优选地，所述醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖的质量比为2:1，所述乙烯基明胶与羧甲基壳聚糖的质量比为2:1。
优选地，所述光交联引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
一种双网络水凝胶生物支架，所述双网络水凝胶生物支架由上述双网络水凝胶组合物制备得到，由醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖迈克尔加成反应形成第一网络结构，由乙烯基明胶光引发自由基聚合形成第二网络结构，所述第一网络与所述第二网络彼此独立又相互交错贯穿。
双网络水凝胶生物支架包括第一网络结构和第二网络结构，所述第一网络结构为醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖迈克尔加成反应搭接贯穿形成的互穿网络结构，第二网络结构为在第一网络结合的网格中通过乙烯基明胶光引发自由基聚合相互搭接形成的贯穿第一网络结构之中的独立网络结构，通过第一网络结构和第二网络结构共同形成一个双网络互穿结构。在双网络的构筑过程中，第一网络混合后快速形成交联结构，因此可以具有短期稳定的形状保持，紫外光引发交联的第二网络乙烯基明胶具有保持结构长期稳定的性质，最终打印出来的支架的结构与设计结构具有高度的相似性。相对于现有双网络水凝胶支架的丙烯酰胺化学交联的第二网络，光引发自由基聚合乙烯基明胶制备的第二网络具有很好的细胞生物相容性，交联过程中无化学物质的引入，有利于细胞外基质结构的建立。
一种双网络水凝胶生物支架的制备方法，包括如下步骤：
S1 配制醛基化透明质酸溶液；
S2配制乙烯基明胶和羧甲基壳聚糖的混合溶液；
S3 在乙烯基明胶和羧甲基壳聚糖溶液的混合溶液中加入光交联引发剂，与醛基化透明质酸溶液充分混合，醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖通过迈克尔加成构成第一网络结构；
S4紫外光照射，均匀分布在第一网络结构中的乙烯基明胶通过光自由基聚合固化交联构成第二网络结构。
制备方法中醛基化透明质酸溶液配制的溶剂可以为水也可以为带细胞的培养基溶液，即可以混入活细胞打印，通过选择不同种类的活细胞，可用于培养各类组织体，扩大细胞生物支架材料的应用。
将醛基化透明质酸溶液、乙烯基明胶和羧甲基壳聚糖溶液的混合溶液进行充分的物理混合后混入光交联引发剂I2959 ，醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖加成构成A-HA/CM-CTS第一网络，乙烯基明胶溶液充分混合在第一网络周围，通过紫外光照射形成乙烯基明胶的第二网络。通过将透明质酸HA进行醛基化修饰，获得的材料可以和壳聚糖CTS作为生物支架的第一网络结构，透明质酸材料对细胞的增殖过程具有明显的营养作用，且材料具有优异的水合性，利用营养物质在其内部的交换。壳聚糖具有抗菌性，不利于细菌的生长，增加了双网络水凝胶支架的生物安全性，因此基于迈克尔加成的两种材料结合是理想的细胞支架材料，有利于细胞外基质结构的建立。第二网络由乙烯基明胶E-Gel构筑，通过紫外光诱导聚合后构筑结构稳定的A-HA/CTS和E-Gel双网络水凝胶网络。
优选地，S1中所述醛基化透明质酸、羧甲基壳聚糖、乙烯基明胶的浓度均为50mg/ml ~400mg/mL。
优选地，S1中所述醛基化透明质酸的浓度为100mg/ml~400mg/mL。
优选地，S1中所述醛基化透明质酸的浓度为200mg/ml~400mg/mL。
优选地，S2中羧甲基壳聚糖的浓度为100mg/ml~400mg/mL。
优选地，S2中乙烯基明胶的浓度为200mg/ml~400mg/mL。
优选地，S2中乙烯基明胶的浓度为200mg/ml~250mg/mL。
优选地，所述醛基化透明质酸、羧甲基壳聚糖、乙烯基明胶的浓度均为200mg/mL。
其中醛基化透明质酸的制备方法如下：
S11. 将透明质酸溶于水中，溶质浓度为0.1%~10%，优选1%；
S12. 称取高碘酸钠溶于去离子水中，高碘酸钠的溶液质量分数为1%~10%，优选5%，透明质酸与高碘酸钠的摩尔比为1:1~10:1，优选5:1；
S13. 将高碘酸钠溶液缓慢滴加到透明质酸溶液中，边滴加边搅拌溶液，使二者充分混合，搅拌速度为200r/min~1000r/min，优选500r/min，避光搅拌反应2小时；
S14. 反应结束后滴加乙二醇溶液至体系中，中和残留的高碘酸钠，乙二醇的摩尔质量不低于使用的高碘酸钠摩尔质量，继续反应1小时后停止反应；
S15. 将经此步骤反应得到的混合物透析除去未反应的单体及小分子物质，-20℃冷冻干燥得到醛基化透明质酸。透析采用分子量7000-10000的透析袋，透析24h，每隔4小时换水一次，将经渗析得到的混合物置于金属托盘中置于-20℃冰箱中冷冻，然后进行冷冻干燥，得到修饰有醛基的透明质酸。
优选地，S3中所述光交联引发剂的质量为明胶质量的1~5%。
更优选地，S3中所述光交联引发剂的质量为明胶质量的3%。
优选地，S4中所述紫外光照射时间为1~20min，优选5min。
一种双网络水凝胶组合物在3D打印水凝胶生物支架中的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地，S1中所述醛基化透明质酸溶液中包括活细胞。制备方法中醛基化透明质酸溶液配制的溶剂可以为水，也可以为带细胞的培养基溶液，即可以混入活细胞打印，通过选择不同种类的活细胞，可用于培养各类组织体，扩大细胞生物支架材料的应用。本发明的双网络水凝胶支架的弹性模量为10~100KPa，适合各类活细胞打印，获得的双网络支架可以用于带细胞打印后的各类组织体培养。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种双网络水凝胶组合物，组合物中的醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖反应得到第一网络，乙烯基明胶光引发自由基聚合制备的第二网络结构，形成的双网络水凝胶生物支架具备良好的结构稳定性、细胞相容性、生物安全性和优异的结构保真度，通过控制各组分的比例可调节水凝胶生物支架的压缩模量，使其达到压缩模量10~100KPa，适用于各类组织体的打印，且打印成型后细胞活性在80%以上，进一步扩大了细胞生物支架材料的应用。
附图说明
图1为双网络水凝胶生物支架形成示意图。
图2为双网络水凝胶生物支架的光学照片。
图3为双网络水凝胶支架不同浓度浸提液细胞毒分析结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
其中压缩模量的检测操作如下：
压缩模量测试的是材料在压缩变形区间的应力－应变，是指在试样上施加一恒定的应力，测定其压缩弯曲挠度，根据应力和应变计算压缩模量。压缩模量的测试方法属于对试样具有破坏性质的一种方法，不具有重复性测试的机会。
测量压缩模量方法：打印长宽高分别为1cm×1cm×1cm的支架，置于万能力学测试机的样品台上，以1mm/min的速度对打印的支架材料进行压缩测试，当样品破裂瞬间记取压缩模量的数值。
实施例1
一种双网络水凝胶组合物，包括醛基化透明质酸、羧甲基壳聚糖，乙烯基明胶和光交联引发剂，其中，醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖的质量比为1:1，乙烯基明胶与羧甲基壳聚糖的质量比为1:1，光交联引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
一种双网络水凝胶生物支架，如图1所示，生物支架包括第一网络结构和第二网络结构，其中第一网络结构为醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖迈克尔加成反应搭接贯穿形成的互穿网络结构，第二网络结构为在第一网络结合的网格中通过乙烯基明胶光引发自由基聚合相互搭接形成的贯穿第一网络结构之中的独立网络结构，通过第一网络结构和第二网络结构共同形成一个双重网络互穿结构，由上述双网络水凝胶组合物制备得到，
制备步骤如下：
S1 配制浓度为200mg/mL的醛基化透明质酸（A-HA）溶液；
S2将乙烯基明胶（GelMA）溶解于羧甲基壳聚糖（CM-CTS）溶液中得到乙烯基明胶和羧甲基壳聚糖溶液的混合溶液，CM-CTS和GelMA的浓度均为200mg/mL；
S3 在乙烯基明胶和羧甲基壳聚糖溶液的混合溶液中加入光交联引发剂，光引发剂I2959的质量为明胶质量的 3%，与醛基化透明质酸溶液充分混合，醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖通过迈克尔加成构成第一网络结构；
S4通过254nm紫外光照射3min，均匀分布在第一网络结构中的乙烯基明胶通过光自由基聚合固化交联构成第二网络结构。
其中醛基化透明质酸的制备步骤如下：
S11. 将透明质酸溶于水中，溶质浓度为1%；
S12. 称取高碘酸钠溶于去离子水中，高碘酸钠的溶液质量分数5%，透明质酸与高碘酸钠的摩尔比为1.25:1；
S13. 将高碘酸钠溶液缓慢滴加到透明质酸溶液中，边滴加边搅拌溶液，使二者充分混合，搅拌速度为500r/min，避光搅拌反应2小时；
S14. 反应结束后滴加0.1mL乙二醇溶液至体系中，中和残留的高碘酸钠，乙二醇的摩尔质量为1.8mmol，继续反应1小时后停止反应；
S15. 将S14反应得到的混合物灌装预透析袋中（7000-10000分子量透析袋），置于大量纯化水中渗析24小时，每隔4小时换水一次以除去未反应的单体及小分子物质，-20℃冷冻干燥得到醛基化透明质酸。透析采用分子量7000-10000的透析袋，透析24h，每隔4小时换水一次，将经渗析得到的混合物置于金属托盘中置于-20℃冰箱中冷冻，后进行冷冻干燥，得到修饰有醛基的透明质酸。
将获得的双网络水凝胶生物支架进行压缩模量的测试，结果为65.6kpa。
实施例1制备的双网络水凝胶生物支架的光学照片如图2所示，通过光学照片及SEM照片可以发现其清晰的支架结构内，冷冻干燥后结构仍然得以保持，没有发生结构的坍塌和变化。并且其表面结构在脱水后出现明显的凹凸不平，比较适宜细胞在其表面的附着、生长和爬行。
实施例2
一种双网络水凝胶生物支架，所述生物支架包括由醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖迈克尔加成反应构成第一网络和由乙烯基明胶光引发自由基聚合反应构成的第二网络，由实施例1的双网络水凝胶组合物制备得到，
制备步骤如下：
S1 配制浓度为50mg/mL的醛基化透明质酸（A-HA）溶液，溶剂为带有内皮细胞的细胞培养基溶液（浓度约1000000个/ml）；
S2将乙烯基明胶（GelMA）溶解于羧甲基壳聚糖（CM-CTS）溶液中得到乙烯基明胶和羧甲基壳聚糖溶液的混合溶液，CM-CTS和GelMA的浓度均为50mg/mL；
S3 在乙烯基明胶和羧甲基壳聚糖溶液的混合溶液中加入光交联引发剂，光引发剂I2959的质量为明胶质量的 1%，与醛基化透明质酸溶液充分混合，醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖通过迈克尔加成构成第一网络结构；
S4通过254nm紫外光照射3min，均匀分布在第一网络结构中的乙烯基明胶通过光自由基聚合固化交联构成第二网络结构。
其中醛基化透明质酸的制备步骤如下：
S11. 将透明质酸溶于水中，溶质浓度为0.1%；
S12. 称取高碘酸钠溶于去离子水中，高碘酸钠的溶液质量分数10%，透明质酸与高碘酸钠的摩尔比为10:1；
S13. 将高碘酸钠溶液缓慢滴加到透明质酸溶液中，边滴加边搅拌溶液，使二者充分混合，搅拌速度为1000r/min，避光搅拌反应2小时；
S14. 反应结束后滴加2.5mL乙二醇溶液至体系中，中和残留的高碘酸钠，乙二醇的摩尔质量为4.5mmol，继续反应1小时后停止反应；
S15. 将S14反应得到的混合物灌装预透析袋中（7000-10000分子量透析袋），置于大量纯化水中渗析24小时，每隔4小时换水一次以除去未反应的单体及小分子物质，-20℃冷冻干燥得到醛基化透明质酸。透析采用分子量7000-10000的透析袋，透析24h，每隔4小时换水一次，将经渗析得到的混合物置于金属托盘中置于-20℃冰箱中冷冻，后进行冷冻干燥，得到修饰有醛基的透明质酸。
将获得的双网络水凝胶生物支架进行细胞标记，进行活死分析，结果细胞存活率为85%。同时对双网络水凝胶生物支架进行压缩模量的测试，结果为15.4kpa。
实施例3
一种双网络水凝胶组合物，包括醛基化透明质酸、羧甲基壳聚糖，乙烯基明胶和光交联引发剂，其中，醛基化透明质酸、羧甲基壳聚糖、乙烯基明胶的质量比为1:1:4，光交联引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
一种双网络水凝胶生物支架，所述生物支架包括由醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖迈克尔加成反应构成第一网络和由乙烯基明胶光引发自由基聚合反应构成的第二网络，由上述双网络水凝胶组合物制备得到，
制备步骤如下：
S1 配制浓度为100mg/mL的醛基化透明质酸（A-HA）溶液，溶剂为水；
S2. 乙烯基明胶（GelMA）溶解于羧甲基壳聚糖（CM-CTS）溶液中得到乙烯基明胶和羧甲基壳聚糖溶液的混合溶液，CM-CTS的浓度为100mg/mL，GelMA的浓度为400mg/mL；
S3.在乙烯基明胶和羧甲基壳聚糖溶液的混合溶液中加入光交联引发剂，光引发剂I2959的质量为明胶质量的 5%，与醛基化透明质酸溶液充分混合，醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖通过迈克尔加成构成第一网络结构；
S4. 通过365nm紫外光照射20min，均匀分布在第一网络结构中的乙烯基明胶通过光自由基聚合固化交联构成第二网络结构。
其中醛基化透明质酸的制备步骤如下：
S11. 将透明质酸溶于水中，溶质浓度为10%；
S12. 称取高碘酸钠溶于去离子水中，高碘酸钠的溶液质量分数1%，透明质酸与高碘酸钠的摩尔比为5:1；
S13. 将高碘酸钠溶液缓慢滴加到透明质酸溶液中，边滴加边搅拌溶液，使二者充分混合，搅拌速度为100r/min，避光搅拌反应2小时；
S14. 反应结束后滴加0.28mL乙二醇溶液至体系中，中和残留的高碘酸钠，乙二醇的摩尔质量为5mmol，继续反应1小时后停止反应；
S15. 将S14反应得到的混合物灌装预透析袋中（7000-10000分子量透析袋），置于大量纯化水中渗析24小时，每隔4小时换水一次以除去未反应的单体及小分子物质，-20℃冷冻干燥得到醛基化透明质酸。透析采用分子量7000-10000的透析袋，透析24h，每隔4小时换水一次，将经渗析得到的混合物置于金属托盘中置于-20℃冰箱中冷冻，后进行冷冻干燥，得到修饰有醛基的透明质酸。
将获得的双网络水凝胶生物支架进行压缩模量的测试，结果为30.6kpa。
实施例4
一种双网络水凝胶组合物，包括醛基化透明质酸、羧甲基壳聚糖，乙烯基明胶和光交联引发剂，其中，醛基化透明质酸、羧甲基壳聚糖、乙烯基明胶的质量比为2:2:1，光交联引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
一种双网络水凝胶生物支架，所述生物支架包括由醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖迈克尔加成反应构成第一网络和由乙烯基明胶光引发自由基聚合反应构成的第二网络，由上述双网络水凝胶组合物制备得到，
制备步骤如下：
S1 配制浓度为400mg/mL的醛基化透明质酸（A-HA）溶液，溶剂为内皮细胞的细胞培养基溶液（浓度约1000000个/ml）；
S2. 将乙烯基明胶（GelMA）溶解于羧甲基壳聚糖（CM-CTS）溶液中得到乙烯基明胶和羧甲基壳聚糖溶液的混合溶液，CM-CTS的浓度为400mg/mL，GelMA的浓度,为200mg/mL；
S3.在乙烯基明胶和羧甲基壳聚糖溶液的混合溶液中加入光交联引发剂，光引发剂I2959的质量为明胶质量的 5%，与醛基化透明质酸溶液充分混合，醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖通过迈克尔加成构成第一网络结构；
S4. 通过254nm紫外光照射3min，均匀分布在第一网络结构中的乙烯基明胶通过光自由基聚合固化交联构成第二网络结构。
其中醛基化透明质酸的制备步骤如下：
S11. 将透明质酸溶于水中，溶质浓度为10%；
S12. 称取高碘酸钠溶于去离子水中，高碘酸钠的溶液质量分数1%，透明质酸与高碘酸钠的摩尔比为5:1；
S13. 将高碘酸钠溶液缓慢滴加到透明质酸溶液中，边滴加边搅拌溶液，使二者充分混合，搅拌速度为100r/min，避光搅拌反应2小时；
S14. 反应结束后滴加0.28mL乙二醇溶液至体系中，中和残留的高碘酸钠，乙二醇的摩尔质量为5mmol，继续反应1小时后停止反应；
S15. 将S14反应得到的混合物灌装预透析袋中（7000-10000分子量透析袋），置于大量纯化水中渗析24小时，每隔4小时换水一次以除去未反应的单体及小分子物质，-20℃冷冻干燥得到醛基化透明质酸。透析采用分子量7000-10000的透析袋，透析24h，每隔4小时换水一次，将经渗析得到的混合物置于金属托盘中置于-20℃冰箱中冷冻，后进行冷冻干燥，得到修饰有醛基的透明质酸。
将获得的双网络水凝胶生物支架进行细胞标记，进行活死分析，结果细胞存活率为82%。同时对双网络水凝胶生物支架进行压缩模量的测试，结果为85.2kpa。
实施例5
一种双网络水凝胶组合物，包括醛基化透明质酸、羧甲基壳聚糖，乙烯基明胶和光交联引发剂，其中，醛基化透明质酸、羧甲基壳聚糖、乙烯基明胶的质量比为6:3:7，光交联引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
一种双网络水凝胶生物支架，所述生物支架包括由醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖迈克尔加成反应构成第一网络和由乙烯基明胶光引发自由基聚合反应构成的第二网络，由上述双网络水凝胶组合物制备得到，
制备步骤如下：
S1. 配制浓度为200mg/mL的醛基化透明质酸（A-HA）溶液，溶剂为去离子水；
S2. 将乙烯基明胶（GelMA）溶解于羧甲基壳聚糖（CM-CTS）溶液中得到乙烯基明胶和羧甲基壳聚糖溶液的混合溶液，CM-CTS的浓度为100mg/mL，GelMA的浓度为250mg/mL；
S3.在乙烯基明胶和羧甲基壳聚糖溶液的混合溶液中加入光交联引发剂，光引发剂I2959的质量为明胶质量的 5%，与醛基化透明质酸溶液充分混合，醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖通过迈克尔加成构成第一网络结构；
S4. 通过254nm紫外光照射3min，均匀分布在第一网络结构中的乙烯基明胶通过光自由基聚合固化交联构成第二网络结构。
其中醛基化透明质酸的制备步骤如下：
S11. 将透明质酸溶于水中，溶质浓度为10%；
S12. 称取高碘酸钠溶于去离子水中，高碘酸钠的溶液质量分数1%，透明质酸与高碘酸钠的摩尔比为5:1；
S13. 将高碘酸钠溶液缓慢滴加到透明质酸溶液中，边滴加边搅拌溶液，使二者充分混合，搅拌速度为100r/min，避光搅拌反应2小时；
S14. 反应结束后滴加0.28mL乙二醇溶液至体系中，中和残留的高碘酸钠，乙二醇的摩尔质量为5mmol，继续反应1小时后停止反应；
S15. 将S14反应得到的混合物灌装预透析袋中（7000-10000分子量透析袋），置于大量纯化水中渗析24小时，每隔4小时换水一次以除去未反应的单体及小分子物质，-20℃冷冻干燥得到醛基化透明质酸。透析采用分子量7000-10000的透析袋，透析24h，每隔4小时换水一次，将经渗析得到的混合物置于金属托盘中置于-20℃冰箱中冷冻，后进行冷冻干燥，得到修饰有醛基的透明质酸。
将获得的双网络水凝胶生物支架进行压缩模量的测试，结果为68.4kpa，可对创面进行组织封闭及止血。
为了解支架材料代细胞打印过程对细胞的影响，对获得的支架结构进行了细胞毒性的分析。
（1）分析方法
用0.05%胰酶（含EDTA）消化细胞制备单细胞悬液，细胞悬液离心（200g，3min），然后将细胞重悬分散于培养液中，调整细胞密度为1×105个/mL；将上述细胞悬液接种到96孔板中，每孔100uL，置于37℃，5% CO2培养箱中培养24小时；待细胞长成单层后，吸出原来的培养液，分别加入100uL不同浓度的试验样品浸提液（100%、75%、50%、25%）、空白对照液，每组6个复孔，空白对照浸提液加入到96孔板，37℃，5% CO2 培养24小时。培养结束后，吸出培养液，每孔加50uLMTT (3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐)(1mg/mL)，培养2小时，吸出上清，加100uL99.9%纯度的异丙醇溶解结晶，在酶标仪上以570nm为主吸收波长，650nm为参考波长测定吸光度值。
（2）分析结果
结果表明该材料制备的生物支架细胞毒性等级均为1级，无细胞毒性。如图3所示，从图3双网络水凝胶生物支架的不同浸提液细胞毒性分析可以看出本发明提供的水凝胶生物支架的浸提液的细胞毒性与空白样相差不大，可以为支架材料的应用明确方向。
对比例1
一种双网络水凝胶生物支架，所述生物支架包括由醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖迈克尔加成反应构成第一网络和由乙烯基明胶光引发自由基聚合反应构成的第二网络，其中醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖的质量比为6:1，乙烯基明胶与羧甲基壳聚糖的质量比为1:1。
制备方法与实施例1相同。但由于醛基化透明质酸与羧甲基壳聚糖的质量比较高，因此第一网络成形性较差，第二网络坍塌。
对比例2
一种双网络水凝胶生物支架，所述生物支架包括由醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖迈克尔加成反应构成第一网络和由乙烯基明胶光引发自由基聚合反应构成的第二网络，其中醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖的质量比为1:2，乙烯基明胶与羧甲基壳聚糖的质量比为1:1。
制备方法与实施例1相同。但由于醛基化透明质酸远小于羧甲基壳聚糖的质量，因此第一网络成形性较差，第二网络坍塌。
对比例3
一种双网络水凝胶生物支架，所述生物支架包括由醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖迈克尔加成反应构成第一网络和由乙烯基明胶光引发自由基聚合反应构成的第二网络，其中醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖的质量比为1:1，乙烯基明胶与羧甲基壳聚糖的质量比为1:3。
制备方法与实施例1相同。但由于第二网络的比例远小于醛基化透明质酸与羧甲基壳聚糖的第一网络，因此第二网络成形性较差，压缩模量为2.5KPa。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种双网络水凝胶组合物，其特征在于，所述双网络水凝胶组合物包括醛基化透明质酸、羧甲基壳聚糖、乙烯基明胶和光交联引发剂，其中，醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖的质量比为1:1~5:1，乙烯基明胶与羧甲基壳聚糖的质量比为1:2~5:1。
2.如权利要求1所述双网络水凝胶组合物，其特征在于，所述醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖的质量比为2:1，所述乙烯基明胶与羧甲基壳聚糖的质量比为2:1。
3.如权利要求1所述双网络水凝胶组合物，其特征在于，所述光交联引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
4.一种双网络水凝胶生物支架，其特征在于，所述双网络水凝胶生物支架由权利要求1~3任一项所述双网络水凝胶组合物制备得到，由醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖迈克尔加成反应形成第一网络结构，由乙烯基明胶光引发自由基聚合形成第二网络结构，所述第一网络与所述第二网络彼此独立又相互交错贯穿。
5.一种权利要求4所述双网络水凝胶生物支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1 配制醛基化透明质酸溶液；
S2配制乙烯基明胶和羧甲基壳聚糖的混合溶液；
S3 在乙烯基明胶和羧甲基壳聚糖溶液的混合溶液中加入光交联引发剂，然后与醛基化透明质酸溶液充分混合，醛基化透明质酸和羧甲基壳聚糖通过迈克尔加成构成第一网络结构；
S4紫外光照射，均匀分布在第一网络结构中的乙烯基明胶通过光自由基聚合固化交联构成第二网络结构。
6.如权利要求5所述双网络水凝胶生物支架的制备方法，其特征在于，所述醛基化透明质酸、羧甲基壳聚糖和乙烯基明胶的浓度均为50mg/mL ~400mg/mL。
7.如权利要求5所述双网络水凝胶生物支架的制备方法，其特征在于，S3中所述光交联引发剂的质量为乙烯基明胶质量的1~5%。
8.如权利要求5所述双网络水凝胶生物支架的制备方法，其特征在于，S4中所述紫外光照射时间为1~20min。
9.如权利要求5所述双网络水凝胶生物支架的制备方法，其特征在于，S1中所述醛基化透明质酸溶液中包括活细胞。
10.一种权利要求1~3任一项所述双网络水凝胶组合物在细胞生物打印中的应用。
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