CN104788583A - 光交联材料、光交联材料形成的水凝胶及制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种光交联材料，由甲基丙烯酸化的含有-OH和-NH₂基团的材料构成。该光交联材料通过以下方法制得：1）使含有-OH和-NH₂基团的材料溶解；2）使所得溶液与甲基丙烯酸酐反应至少16个小时。本发明也提供由这种光交联材料形成的水凝胶，通过以下方法制得：1）将光启动剂在避光下溶解于光交联材料的透明溶液；2）对所得溶液进行光照。本发明的水凝胶可以用作损伤组织的修复材料。

Description

光交联材料、光交联材料形成的水凝胶及制备方法和用途

技术领域

本发明涉及光交联材料、该光交联材料形成的水凝胶及其制备方法和用途。

背景技术

由于创伤及病变造成的人体内组织缺损，需要生物材料提供组织生长的支持，同时这些生物材料也能够作为细胞及再生因子的运输载体。然而，体内的创伤形状往往是不规则的，通过对材料的修剪可以部分解决这个问题，但是依然存在宿主组织与移植材料不吻合的部位，这就大大降低了移植材料与宿主组织的整合及随后的修复效果。

实体无形构建（Solid Freeform Fabrication）技术能够有效解决这个问题，用于此类技术的材料最初以粉末或者溶液状态存在，这样可以无需复杂的处理即可非常完美地无缝覆盖无规则的损伤区域，接着通过不同的聚合方法使这些粉末或者溶液形成固体或者凝胶组织，这样就能产生出与损伤组织在形状上完全互补的支架。

在不同的此类材料中，水凝胶因其能够独立提供细胞生长的液态环境而受到特别的关注。目前，已发展出多种不同条件激活的水凝胶成型技术，包括温度敏感型、pH敏感型等等。温度敏感型材料多为合成材料，选择有限且存在材料特性不均匀的问题。而pH敏感材料则由于条件过于剧烈，不利于细胞运输。

光敏感型水凝胶技术，因其能够对许多材料进行简单的修饰以达到聚合的目的并且激活条件相对温和，近来受到特别重视。但其应用目前也存在一些问题，如：大部分光敏感水凝胶材料都是化学合成的，细胞相容性存在问题，而且由于缺乏细胞黏附基团，造成细胞无法贴附及生长，大大影响细胞功能。另外，目前用于光交联的交联剂只对紫外光敏感，而紫外光的使用则潜在地对包含在凝胶中的细胞以及周边宿主组织有突变作用，无法在临床上应用。

发明内容

一方面，本发明提供一种光交联材料，由甲基丙烯酸化的含有-OH和-NH₂基团的材料构成。

在实施方式中，含有-OH和-NH₂基团的材料可以是明胶、透明质酸、壳聚糖等。根据所选择的光启动剂的类型，本发明的光交联材料可以在紫外光、可见光或红外光的照射下形成水凝胶。

一方面，本发明提供一种制备光交联材料的方法，包括以下步骤：

1）使含有-OH和-NH₂基团的材料溶解；

2）使所得溶液与甲基丙烯酸酐反应至少约16个小时。

在实施方式中，含有-OH和-NH₂基团的材料可以是明胶、透明质酸、壳聚糖等。

在实施方式中，含有-OH和-NH₂基团的材料可以溶解于任何合适的溶剂和溶液中，溶剂可以是例如水、DMSO等；溶液可以是例如PBS缓冲液、培养基等。

在实施方式中，所得溶液与甲基丙烯酸酐反应约16小时以上，一般反应约16～48个小时，优选在搅拌中反应约16～48个小时。搅拌的方式可以是置于摇床上，或是使用搅拌器。反应的温度可以是约50℃以下，特别是约4℃～50℃，例如室温条件下，优选能够保持材料处于液态的温度，例如约30℃～50℃，特别优选约37℃。

在实施方式中，根据材料的不同，反应时含有-OH和-NH₂基团的材料与甲基丙烯酸酐的摩尔比也不同。含有-OH和-NH₂基团的材料是明胶时，步骤（2）中其与甲基丙烯酸酐的摩尔比为约1:10～1:50，例如可以是约1:10～1:40、1:10～1:30、1:10～1:20、1:20～1:50、1:20～1:40、1:20～1:30、1:30～1:50、1:30～1:40、1:40～1:50，例如1:10、1:20、1:30、1:40或1:50，优选为约1:20。含有-OH和-NH₂基团的材料是透明质酸时，步骤（2）中其与甲基丙烯酸酐的摩尔比可以是约2:1～1:2，例如可以是约2:1～1:1、1:1～1:2，例如约2:1、1:1或1:2，优选为约1:1。含有-OH和-NH₂基团的材料是壳聚糖时，步骤（2）中其与甲基丙烯酸酐的摩尔比可以是约2:1～1:2，例如可以是约2:1～1:1、1:1～1:2，例如约2:1、1:1或1:2，优选为约1:1。

在实施方式中，在步骤2）之后，可以对得到的光交联材料进行纯化，以除去杂质。例如可以采用透析的方式进行纯化，以除去小分子。

在实施方式中，反应混合物可以直接以溶液形式存在，也可以冻干成固体以备后用。

一方面，本发明提供一种水凝胶，由上述光交联材料形成。

在实施方式中，由光交联材料溶液到水凝胶的过程不可逆。形成的水凝胶在约-20℃～60℃下不溶解。

一方面，本发明提供由上述光交联材料制备水凝胶的方法，包括以下步骤：

1）将光启动剂在避光下溶解于上述光交联材料的透明溶液中；

2）对所得溶液进行光照。

在实施方式中，光交联材料的透明溶液可以是光交联材料的水溶液、PBS溶液、培养基溶液等。该透明溶液可以是如上所述直接制备得到的光交联材料溶液，也可以是将光交联材料冻干固体再次溶解而得到的溶液。当光交联材料为甲基丙烯酸化的明胶时，其在透明溶液中的浓度可以为约6%（w/v）以上，优选为约6%～20%（w/v），例如可以是约6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%或20%等。当光交联材料为甲基丙烯酸化的透明质酸时，其在透明溶液中的浓度可以为约1%（w/v）以上，优选为约1%～3%（w/v），例如可以是约1%、1.5%、2%、2.5%或3%等。当光交联材料为甲基丙烯酸化的壳聚糖时，其在透明溶液中的浓度可以为约1%（w/v）以上，优选为约1%～10%（w/v），例如可以是约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%等。

在实施方式中，光启动剂可以是任何合适的光启动剂，例如可见光启动剂、紫外光启动剂、红外光启动剂或敏感波长跨越可见光、紫外光和红外光中的两者或三者的光启动剂。其中，光启动子剂的实例可以是苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂（lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphophinate，LAP）或2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮（I2959）。光启动剂的加入量可以是光交联材料透明溶液的0.1～1%（w/v）。

在实施方式中，光启动剂与光交联材料透明溶液混合的温度可以是室温以上，例如37℃。

在实施方式中，水凝胶的形成是不可逆的，并且可以通过调整光照时间来控制水凝胶的强度。

在实施方式中，如果要在所得的水凝胶中包裹细胞或其他作用因子，则将光交联材料透明溶液的pH调节为6.5～8，优选为7.4。

在实施方式中，在步骤2）之前，可以将细胞或其他作用因子加入溶液中。此处，其他作用因子可以是BMP-2、PDGF-BB、VEGF、bFGF、NGF-β和BDNF等。

在实施方式中，在步骤2）之前，将光交联材料的透明溶液注射到损伤组织或模子中。

在实施方式中，用于照射光交联材料的光可以是可见光、紫外光或红外光。

另一方面，本发明提供光交联材料及其形成的水凝胶作为组织修复材料的用途。

在实施方式中，组织包括皮肤、软骨、骨、外周神经、脑、脊髓、肌腱等。

本发明提供的光交联材料由常见材料通过简单步骤制得，在光启动剂的存在下，这种光交联材料可以方便地在光照下瞬时形成水凝胶。本发明的水凝胶具有良好的组织整合功能和极佳的生物相容性，并且能使干细胞在其中快速增殖并高效表达自身基因。当应用于组织修复时，可以选用可见光光启动剂来形成水凝胶，则整个过程对于细胞和组织没有损伤。而且本发明中光交联材料形成水凝胶的过程是不可逆的，在损伤组织中不会因体温而溶解。因此，由本发明光交联材料制得的水凝胶可以替代琼脂糖等用于损伤组织的修复。

附图说明

图1示出在本发明明胶水凝胶以及琼脂糖上接种人骨髓间充质干细胞并培养90天后活细胞/死细胞的染色结果。

图2示出干细胞在本发明明胶水凝胶以及琼脂糖中生长的MTT分析。

图3示出本发明明胶水凝胶以及琼脂糖的机械强度测试结果。

图4示出人骨髓间充质干细胞在本发明明胶水凝胶以及琼脂糖中的软骨特异性基因表达的实时定量PCR结果。

图5示出干细胞在本发明明胶水凝胶以及琼脂糖中产生的软骨特异多糖葡萄糖胺聚合糖的定量结果（左）以及Alcian blue染色（右）。

图6示出本发明明胶水凝胶以及琼脂糖的push-out测试结果，上图为位移-压强曲线，下图为推出不同凝胶使产生的最大压强。

图7示出在本发明透明质酸水凝胶以及琼脂糖上接种人骨髓间充质干细胞并培养7天后活细胞/死细胞的染色结果。

图8示出在本发明壳聚糖水凝胶以及琼脂糖上接种人骨髓间充质干细胞并培养7天后活细胞/死细胞的染色结果。

具体实施方式

甲基丙烯酸化可以使含有-OH和-NH₂基团的材料例如明胶、透明质酸和壳聚糖获得光交联的能力。得到的光交联生物材料可以在适当的光启动剂的存在下，在光特别是可见光的照射下形成生物相容性好且组织整合能力强的水凝胶。

本发明的光交联材料可以以极为简单的步骤得到，包括：

1）使含有-OH和-NH₂基团的材料溶解；

2）使所得溶液与甲基丙烯酸酐反应至少16个小时。

步骤（1）中，含有-OH和-NH₂基团的材料可以溶解于任何合适的溶剂或溶液中，只要能够充分溶解。例如，溶剂可以是水、DMSO等，溶液可以是PBS缓冲液、培养基等。当光交联材料将要用于医学目的例如组织修复时，含有-OH和-NH₂基团的材料应当溶解于水、PBS、培养基等对于细胞和组织无毒无害的溶剂或溶液中。

反应中，根据材料的不同，含有-OH和-NH₂基团的材料与甲基丙烯酸酐的摩尔比也不同。含有-OH和-NH₂基团的材料是明胶时，步骤（2）中其与甲基丙烯酸酐的摩尔比在约1:10～1:50的范围内，优选为约1:20。含有-OH和-NH₂基团的材料是透明质酸时，步骤（2）中其与甲基丙烯酸酐的摩尔比可以在约2:1～1:2的范围内，优选为1:1。含有-OH和-NH₂基团的材料是壳聚糖时，步骤（2）中其与甲基丙烯酸酐的摩尔比可以在约2:1～1:2的范围内，优选为1:1。当摩尔比低于约1:10（明胶）或2:1（透明质酸和壳聚糖）时，例如1:5（明胶）或4:1（透明质酸和壳聚糖），交联的-OH和-NH₂基团的比例太低，使得之后很难形成凝胶；而摩尔比高于1:50（明胶）或1:2（透明质酸和壳聚糖）时，过量的甲基丙烯酸酐成为浪费，并增加后期的纯化时间。

在所得溶液与甲基丙烯酸酐反应时，应尽量使两者充分混匀。反应时间为至少16个小时，优选为16～48个小时。反应时可以进行搅拌，例如置于摇床上，或使用搅拌器。反应温度可以是4～50℃，优选为较低温，优选能够保持材料处于液态的温度，例如37℃。温度对于反应本身不重要，但是当光交联材料为胶原材料时，在室温条件下可能自发形成胶状物，即共价交联的物理聚集，会大大降低反应效率，因此优选在30～50℃进行混匀。而对于透明质酸或壳聚糖而言，没有这方面问题，但一般将温度控制在50℃以下，以降低水解作用。

所得的光交联材料可以用于制备水凝胶以参与损伤组织的修复，因此优选对光交联材料进行纯化，除去小分子物质和杂质。纯化可以通过本领域技术人员所知的任何常规方法进行，例如透析法、离子交换树脂或凝胶过滤法等。纯化后的光交联材料可以直接配置成适当浓度的溶液进行使用，或者经过低温干燥例如冻干制成固体。制成固体可以方便保存和存放。

将适当的光启动剂加到上述本发明的光交联材料中，经一定波长的光的照射，即可形成水凝胶，具体方法如下：

1）将光启动剂在避光下溶解于光交联材料的透明溶液中；

2）对所得溶液进行光照。

光启动剂的类型决定形成水凝胶时的敏感波长。当选择紫外光启动剂时，形成水凝胶时需要紫外光的照射，当选择可见光启动剂时，则需要可见光的照射。由于本发明的水凝胶应用于人体受损的组织，应尽量避免紫外光对组织和细胞的损伤。因此，可以选择适当的可见光段光启动剂，在可见光的照射下，方便地形成水凝胶。此外，用于本发明医学用途的光启动剂还需要满足以下要求：（1）溶于水或其他溶剂和溶液、（2）无明显细胞毒性。目前而言，符合要求的光启动剂仅能列出苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂，其本身对220～480nm范围内的波长敏感。光启动剂和光交联材料的混合要在避光的情况下进行，否则在没有混匀的情况下就开始凝胶化，使最终形成的水凝胶呈现出不均匀的状态，不利于细胞的生长。特别是要形成与损伤组织在形状上完全互补的支架的情况下，一定要在避光条件下使光启动剂与光交联材料均匀混合，在将混合物注入受损组织后再进行光照。这样，无需复杂的处理即可非常完美地无缝覆盖无规则的损伤区域。另外，光交联材料的溶液必需是透明的，这样才能够在光照时，使各部分均匀发生凝胶化。

本发明中，当光交联材料为甲基丙烯酸化的明胶时，其在透明溶液中的浓度可以为约6%（w/v）以上。其中，6%是明胶成胶的最低浓度，而当形成的水凝胶用于组织修复时，光交联材料的溶液浓度上限为20%（w/v），高于此浓度时，细胞的存活比例大大降低。当光交联材料为甲基丙烯酸化的透明质酸时，其在透明溶液中的浓度可以为约1%（w/v）以上。其中，1%是透明质酸的最低成胶浓度，而当浓度高于3%时，溶液太粘，不利于操作。当光交联材料为甲基丙烯酸化的壳聚糖时，其在透明溶液中的浓度可以为约1%（w/v）以上，优选为约1%～10%（w/_x）。

此外，光交联剂的添加量需要进行优化选择。当光交联剂的添加量过低时，需要较长的时间才能彻底交联，而光交联剂的添加量过高时，可能会对细胞产生毒副作用。在选用苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂作用光启动剂的情况下，其含量可以为光交联材料溶液的0.1%～1%（w/v），优选为0.1%～0.4%，特别优选为0.2%。

光启动剂和光交联材料的溶液混合的温度一般在室温以上，可以防止光交联材料的自发成胶。

如果要在水凝胶中包裹细胞等，则需要在加入光启动剂之前调节光交联材料溶液的pH。pH只要调节至6.5～8的范围即可，优选7.4左右。pH本身对成胶没有太大的影响。在加入光启动剂并混匀之后，可以在溶液中加入细胞或其他作用因子，这些成分的加入可以加速组织的修复。

在光照之前，将溶液注入受损组织或模子中。在需要注射的情况下，将溶液吸入注射器中，在约4℃放置至少30分钟。在这种低温条件下，本发明的光交联材料形成可逆的软凝胶，可以通过注射器进行注射。而这种软凝胶会在例如体温下溶解成溶液。

在将本发明的光交联材料注射到所需位置之后，使用光源，优选可见光光源进行照射。在照射1～5分钟后即可形成稳定的水凝胶。而且形成的水凝胶是不可逆的，在体温下不会溶解，从而可以起生物支架的作用，而且事先加入的细胞和其他作用因子也均匀分布其中，促进组织修复。此外，本发明光交联材料形成的水凝胶的强度可以通过调整光照时间来控制。

在本发明中，只需要简单的原材料如明胶、交联剂、光启动剂和光源即可制备得到具有良好组织整合功能和极佳生物相容性，并且能使干细胞在其中快速增殖并高效表达自身基因的水凝胶。而且，通过交联剂和光启动剂等的选择，仅用可见光光源就可以形成所需的水凝胶。

本发明的水凝胶可以完美贴合受损的组织，而且具有良好的组织整合能力。在临床应用中，移植的组织工程产品与宿主的整合是修复成败与否的关键，如果没有与周边组织的有效整合，即使移植的支架能够表现出很好的组织分化，也不能有效的执行原先组织应用的功能，只能起到填充的作用。而本发明光交联材料形成的水凝胶，通过push-out实验验证，具有比常用材料更好好的组织整合功能。

提供以下实施例来具体说明本发明。应当注意的是，这些实施例仅用于示例说明，而不限制本发明的范围。

实施例

明胶中-OH和-NH₂基团数目的确定请参考Lab Chip,2012,12,2959–2969，1g明胶约包含0.25～0.3mmol的-OH/-NH₂。根据各自的分子式,1g透明质酸与1g壳聚糖分别包含约0.02～0.03mol和0.01～0.02mol的-OH/-NH₂。

制备例1：光交联明胶的制备

1）将15g购自Sigma-Aldrich（货号：G9391）的胶原明胶（Gelatin）粉末溶于500ml水中，置于37℃摇床中直至明胶完全溶解，形成3%（w/v）的透明溶液；

2）分别向所得溶液中加入6ml、12ml和30ml甲基丙烯酸酐（>94%，Sigma-Aldrich，276685），使得明胶与甲基丙烯酸酐的摩尔比分别为1:10、1:20和1:50，用力摇晃混匀，置于37℃摇床中过夜；

3）将反应后的混合物取出，倒入透析袋中（截留分子量3.5k），室温下在水中（4L）透析2天，期间至少换水10次；

4）将纯化后的甲基丙烯酸化明胶取出，使用Benchtop FreeZone4.5L（Labconco）冻干成海绵状固体，置于干燥器中备用，此时的得率在80%左右。

制备例2：光交联透明质酸的制备

将5g透明质酸（MW600,000～850,000，HA700K-1,Lifecore）溶解于500ml水中，分别加入到9ml、18ml和36ml的甲基丙烯酸酐中，使得透明质酸和甲基丙烯酸酐的摩尔比分别为2：1、1:1和1:2。反应条件与纯化步骤与制备例1相同，透析袋的截留分子量为3.5k。

制备例3：光交联壳聚糖的制备

将7g壳聚糖（MW140,000～220,000，740179，Sigma）溶解于500ml的2%（v/v）醋酸（320099,Sigma）溶液中，分别加入到7.5ml、15ml和30ml的甲基丙烯酸酐中，使得壳聚糖和甲基丙烯酸酐的摩尔比分别为2:1、1:1和1:2。反应条件与纯化步骤与制备例1相同，透析袋的截留分子量为3.5k。

制备例4：光启动剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂（LAP）的制备

所有以下步骤均在通风橱中进行。

1）室温下，将3.2g2,4,6-三甲基苯甲酰氯（Acros Organics）逐滴加入到搅拌中的苯基亚膦酸二甲酯（Acros Organics）中，然后在室温避光搅拌18个小时；

2）将6.1g溴化锂（Acros Organics）加入到100ml的丁酮（>99.5%,Acros Organics）中直至完全溶解；

3）将所得的溴化锂丁酮溶液全部加入步骤1）的溶液中，将混合物摇匀后置于50℃水浴中10分钟；

4）当析出会有白色沉淀析时，用滤纸过滤除掉溶剂，保留粉末；

5）用300ml丁酮清洗滤纸上的固体粉末3次（100ml/次）；

6）在避光的条件下将粉末放入通风橱过夜，以除去丁酮；

7）将粉末放入约720mmHg的负压环境下，进一步除去丁酮；

8）将终产物，即可见光启动剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂（LAP）用药匙碾压成粉末，放入干燥器中避光保存。

制备例5：明胶水凝胶的制备

使用制备例1得到的三种摩尔比的光交联明胶，分别按照如下表1中的数值，进行明胶水凝胶的制备。

[表1]

1）将甲基丙烯酸化明胶溶于37℃溶液；

2）为能够将细胞包裹在水凝胶中，调节甲基丙烯酸化明胶的pH值在6.5～8之间（具体见表1）；

3）在甲基丙烯酸化明胶溶液中加入LAP,37℃下避光在摇床中摇晃，直至彻底溶解；

4）将细胞或者其他因子加入甲基丙烯酸化明胶溶液中，混合均匀；

5）将混合溶液注入模子或者组织缺损部位；

6）将牙医用可见光光源（400～490nm，1,400mw/cm²）照射到溶液上。

在光照1～5min之后，即可形成稳定的明胶水凝胶。此时形成的水凝胶是不可逆的，不会在体温下溶解，细胞或者生长因子同时也被包裹在水凝胶中。通过调整光照时间，可以控制凝胶的强度。

制备例6：透明质酸水凝胶的制备

使用制备例2得到的三种摩尔比的光交联透明质酸，分别按照如下表2中的数值和制备例5中的步骤，进行透明质酸水凝胶的制备。

[表2]

在光照1～5min之后，即可形成稳定的透明质酸水凝胶。此时形成的水凝胶是不可逆的，不会在体温下溶解，细胞或者生长因子同时也被包裹在水凝胶中。通过调整光照时间，可以控制凝胶的强度。

制备例7：壳聚糖水凝胶的制备

使用制备例3得到的三种摩尔比的光交联壳聚糖，分别按照如下表3中的数值和制备例5中的步骤，进行壳聚糖水凝胶的制备。

[表3]

在光照1～5min之后，即可形成稳定的壳聚糖水凝胶。此时形成的水凝胶是不可逆的，不会在体温下溶解，细胞或者生长因子同时也被包裹在水凝胶中。通过调整光照时间，可以控制凝胶的强度。

以下，选择最常见的用于软骨损伤修复的琼脂糖作为对照，研究人骨髓干细胞（hMSC）在本发明水凝胶中的行为及软骨分化。

实施例1：本发明的明胶水凝胶的生物相容性

人骨髓间充质干细胞（hMSC）分离于成年人骨髓，采用DMEM完全培养液（DMEM基础培养基，10%胎牛血清，100mgPL青霉素，100mgPL链霉素），37℃+5%CO₂孵育箱培养。待细胞密度达到70%～80%时进行传代。

将100g制备例1中明胶与甲基丙酸酐的摩尔比为1:20的甲基丙烯酸化明胶与2g LAP溶解在1000ml PBS中,将以上培养的传代细胞与溶液混匀，用牙医用可见光光源照射，细胞在水凝胶中的浓度为1×10⁷个/ml。同时，将接种同样细胞浓度的2%（w/v）琼脂糖水凝胶作为对照。将包含hMSC的两种水凝胶培养在软骨细胞分化培养基中（DMEM,1×ITS,10ng/ml TGF-β3，0.1μM地塞米松，40μg/ml脯氨酸,50μg/ml抗坏血酸，100mgPL青霉素，100mgPL链霉素）。

90天后，采用Cell Viability Assays试剂盒（Invitrogen）对活细胞/死细胞进行染色，按试剂盒所附实验流程进行。

图1示出在本发明明胶水凝胶和琼脂糖上接种hMSC细胞并培养90天后活细胞/死细胞的染色结果，其中左图点状染色表示活细胞，右图点状染色表示死细胞。结果显示，相比于琼脂糖（50%细胞存活率），本发明中的明胶水凝胶显示出更好的生物相容性（95%细胞存活率），能够支持长期的细胞生长。

实施例2：干细胞在本发明的明胶水凝胶中的增殖

取实施例1中培养90天之后的包含hMSC的明胶水凝胶和琼脂糖水凝胶，放入MTS溶液中（G5421,Promega），四小时后使用SynergyHt酶标仪（BioTek）读取溶液在492nm的吸收值。

图2示出人骨髓间充质干细胞在本发明明胶水凝胶和琼脂糖中生长的MTT分析。可以看到，MTT结果显示人骨髓间充质干细胞在明胶水凝胶中能快速增殖,而在琼脂糖中增殖很慢。

实施例3：干细胞在本发明的明胶水凝胶中的功能

按实施例1步骤制备包含hMSC的圆柱形水凝胶（直径5mm，高2mm），分别在软骨分化培养基中培养之前和培养90天之后，置于机械强度测量仪上（Electroforce，Bose），以0.01mm/s的速度行10%（0.2mm）压缩，将机器记录的位移与压强作出曲线，根据斜率计算杨氏模量。

图3示出本发明明胶水凝胶和琼脂糖的机械强度测试结果。结果显示，在软骨分化培养基中，干细胞分泌细胞外基质到明胶水凝胶中，并且增加凝胶的强度。而在琼脂糖中没有这种情况。

实施例4：干细胞在本发明的明胶水凝胶中的基因表达

取实施例1中培养90天之后的包含hMSC的明胶水凝胶和琼脂糖水凝胶，采用Trizol（Invitrogen）法将包含在水凝胶中的细胞RNA抽提出来，采用SYBRGreen（ABI）的方法进行实时定量PCR,以检测细胞中的软骨特异基因sox9、colII和agg的表达。其中，对照组是指不包含hMSC的本发明明胶水凝胶，经实施例1中同样条件培养90天。

图4示出人骨髓干细胞的软骨特异性基因表达的实时定量PCR结果。结果示出，在TGF-β3的刺激下，干细胞在本发明的明胶水凝胶中能高效表达软骨特异细胞外基质基因，例如sox9、colII和agg基因。

实施例5：干细胞在本发明明胶水凝胶中的葡萄糖胺聚合糖的表达

取实施例1中培养90天之后的包含hMSC的明胶水凝胶和琼脂糖水凝胶，用125μg/ml木瓜蛋白酶（P3125,Sigma）降解，然后使用定量试剂盒Blyscan（Biocolor）测量溶液中的葡萄糖胺聚合糖（GAG）的含量。设两个对照组，即不含hMSC的琼脂糖和明胶水凝胶，也经实施例1中同样条件培养90天。

同时，为了直观地表征GAG在水凝胶中的量，将凝胶用4%福尔马林（Fisher）固定，按照标准的处理流程进行切片（8μm），并做Alcianblue（Sigma）染色。

图5示出人骨髓间充质干细胞在本发明明胶水凝胶以及琼脂糖中产生的软骨特异多糖即葡萄糖胺聚合糖的定量结果（左）以及Alcianblue染色（右）。结果显示，在TGF-β3刺激下，人骨髓干细胞在明胶水凝胶中能高效产生软骨特异多糖GAG。Alcian blue染色结果更直观地证实了以上结果，其中深色表示GAG沉积。

实施例6：本发明的明胶水凝胶对组织的整合功能

采用push-out实验来检验本发明水凝胶对组织的整合能力。具体地，模拟体内的情况，在牛来源的软骨组织中间切去一个圆形结构，造成一个圆柱型的缺损，然后将包含人骨髓间充质干细胞（1×10⁷个/ml）的明胶溶液（10%于PBS，PH7.4，包含0.2%LAP）或者琼脂糖溶液（2%于PBS,PH7.4）滴入缺损部位，然后利用牙医用可见光源照射（明胶）或者冷却（琼脂糖）的方法在原位交联形成支架。培养6个星期后，用一个比移植支架略小的金属圆柱将移植支架顶出软骨。支架对于金属圆柱的反作用力将通过连接金属圆柱的探头记录，如果整合越好，产生的反作用力越大，最终比较材料所能承受的最大压力。设不含人骨髓间充质干细胞的琼脂糖和明胶水凝胶作为对照组。

图6示出本发明明胶水凝胶以及琼脂糖的push-out测试结果，上图为位移-压强曲线，下图为推出不同凝胶使产生的最大压强。在金属圆柱的推动下，相比于琼脂糖，本发明中的明胶水凝胶产生更大的反作用力，同时，也需要更大的力将其完全推出软骨组织，显示出本发明的明胶水凝胶良好的组织整合功能。

实施例7：本发明的透明质酸水凝胶的生物相容性

采用与实施例1相同的步骤，测试透明质酸水凝胶的生物相容性，其中透明质酸与甲基丙烯酸酐的摩尔比为1:1，水凝胶中透明质酸的终浓度为2%（w/v），且所接种的hMSC细胞的培养时间为7天。

图7示出在本发明透明质酸水凝胶以及琼脂糖上接种hMSC细胞并培养7天后活细胞/死细胞的染色结果，其中左图中点状染色表示活细胞，右图中点状染色表示死细胞。结果显示，相比于琼脂糖（50%存活率），本发明中的透明质酸水凝胶显示出良好的生物相容性（96%细胞存活率），并提供粘附基团供细胞延伸。

实施例8：本发明的壳聚糖水凝胶的生物相容性

采用与实施例1相同的步骤，测试壳聚糖水凝胶的生物相容性，其中壳聚糖与甲基丙烯酸酐的摩尔比为1:1，水凝胶中壳聚糖的终浓度为5%（w/v），且所接种的hMSC细胞的培养时间为7天。

图8示出在本发明壳聚糖水凝胶以及琼脂糖上接种hMSC细胞并培养7天后活细胞/死细胞的染色结果，其中左图中点状染色表示活细胞，右图中点状染色表示死细胞。结果显示，相比于琼脂糖（50%存活率），本发明中的壳聚糖水凝胶显示出良好的生物相容性（96%细胞存活率）。

Claims (14)

1.一种光交联材料，由甲基丙烯酸化的含有-OH和-NH₂基团的材料构成。

2.根据权利要求1所述的光交联材料，其中，

所述含有-OH和-NH₂基团的材料选自明胶、透明质酸和壳聚糖。

3.一种制备光交联材料的方法，包括以下步骤：

1）使含有-OH和-NH₂基团的材料溶解；

2）使所得溶液与甲基丙烯酸酐反应至少16个小时。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，

所述含有-OH和-NH₂基团的材料选自明胶、透明质酸和壳聚糖，所述含有-OH和-NH₂基团的材料是明胶时，步骤（2）中其与甲基丙烯酸酐的摩尔比为1:10～1:50，所述含有-OH和-NH₂基团的材料是透明质酸时，步骤（2）中其与甲基丙烯酸酐的摩尔比为2:1～1:2，所述含有-OH和-NH₂基团的材料是壳聚糖时，步骤（2）中其与甲基丙烯酸酐的摩尔比为2:1～1:2。

5.根据权利要求3或4所述的方法，还包括

在步骤2）之后，使得到的光交联材料纯化。

6.一种制备水凝胶的方法，包括以下步骤：

1）将光启动剂在避光下溶解于权利要求1或2所述的光交联材料的透明溶液中；

2）对所得溶液进行光照。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，

所述光交联材料为甲基丙烯酸化的明胶时，其在所述透明溶液中的浓度是6%～20%；所述光交联材料为甲基丙烯酸化的透明质酸时，其在所述透明溶液中的浓度是1%～3%；所述光交联材料为甲基丙烯酸化的壳聚糖时，其在所述透明溶液中的浓度是1%～10%。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，

所述光启动剂的添加量为所述光交联材料的透明溶液的0.1%～1%。

9.根据权利要求6或7所述的方法，其中，

在步骤2）之前，将所述光交联材料的透明溶液的pH调节为6.5～8并将细胞或其他作用因子加入其中。

10.根据权利要求6或7所述的方法，其中，

所述光启动剂选自苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂、2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮等。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，

在步骤2）中，使用可见光或紫外光对所得溶液进行光照。

12.一种水凝胶，由权利要求6～11中任一项所述的方法制备。

13.权利要求1或2所述的光交联材料或权利要求12所述的水凝胶作为组织修复材料的用途。

14.根据权利要求13所述的用途，其中，

所述组织包括皮肤、软骨、骨、外周神经、脑、脊髓、肌腱等。