CN111375090A - 脂肪细胞外基质支架及其制备方法和应用 - Google Patents

脂肪细胞外基质支架及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种脂肪细胞外基质支架及其制备方法和应用。该脂肪细胞外基质支架的制备方法，包括如下步骤：将脂肪组织依次进行脱细胞处理、脱水处理和脱脂处理，得到脂肪细胞外基质；将脂肪细胞外基质粉碎，得到基质粉末；将基质粉末与甲基丙烯酸酐在第一缓冲液中反应，得到甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质；将甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质与光引发剂、第二缓冲液混合，再在紫外光照射下进行交联反应，得到脂肪细胞外基质支架。上述脂肪细胞外基质支架的制备方法能够根据需要调整脂肪细胞外基质支架的降解速度，且得到的脂肪细胞外基质还具有较好的力学强度。

Description

脂肪细胞外基质支架及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，特别是涉及一种脂肪细胞外基质支架及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，由先天性畸形、慢性疾病、感染、肿瘤切除或外伤引起的软组织损伤每年都在增加，导致医疗费用和患者发病率也随之增加。然而对于软组织损伤，理想的手术治疗是先完全切除缺损组织，然后通过全器官移植或自体移植来替代缺损组织并重建缺损组织的结构和功能。然而，缺乏可用性移植软组织，组织匹配相对复杂，并且供体部位存在发病率高的风险，使得全器官移植或自体移植治疗软组织缺损实施起来相对困难。因此，在临床需求的驱动下，许多基于细胞外基质的移植物，包括同种异体移植物和异种移植物，已经发展成为器官移植的替代方法，大量相关产品不断被批准上市，用于各种临床疾病的治疗，如
Figure BDA0001929502090000011
(Life Cell)、
Figure BDA0001929502090000012
(Cook)、Bio-
Figure BDA0001929502090000013
(Geistlic小时)等。
脱细胞外基质因其保存完好的原始组织的三维超微结构、生物相容性、机械完整性、组成以及最终的生物活性而在许多临床应用中取得了良好的临床治疗效果。最近，人或动物脂肪组织作为脱细胞外基质原材料因其来源丰富而备受关注。
脂肪组织是人体中最普遍、最易消耗的组织，可大量采集，发病率最低。此外，脂肪组织中含有丰富的细胞外基质成分，如胶原、弹性蛋白、蛋白多糖、层黏连蛋白，以及各种分泌多肽、细胞因子和补体因子，这些都可以调节许多细胞过程(Strem B M，Hedrick MH.The growing importance of fat in regenerative medicine.Trends inBiotechnology.2005,23(2):64-66)。虽然许多脱细胞组织维持其原有的组织结构，仅作为原始组织的替代品使用，但脂肪组织是无定形的，从脂肪组织中提取的细胞外基质可以根据受损组织、脂肪或其他组织的结构进行定制。目前，脂肪组织衍生的细胞外基质已经被制造成具有可控制的微/宏观结构的组织工程三维支架，例如多孔海绵、空心管、微粒和水凝胶(Choi J S，et al.Decellularized extracellular matrix derived from humanadipose tissue as a potential scaffold for allograft tissueengineering.JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH Part A.2011,97(3):292-299)。但是脂肪细胞外基质存在力学强度较差，体内降解速度过快，这不利于脂肪细胞外基质在生物医用材料领域的应用。
发明内容
基于此，有必要提供一种脂肪细胞外基质支架的制备方法，该方法能够根据需要调整脂肪细胞外基质支架的降解速度，且得到的脂肪细胞外基质还具有较好的力学强度。
此外，还提供一种脂肪细胞外基质支架和应用。
一种脂肪细胞外基质支架的制备方法，包括如下步骤：
将脂肪组织依次进行脱细胞处理、脱水处理和脱脂处理，得到脂肪细胞外基质；
将所述脂肪细胞外基质粉碎，得到基质粉末；
将所述基质粉末与甲基丙烯酸酐在第一缓冲液中反应，得到甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质；及
将所述甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质与光引发剂、第二缓冲液混合，再在紫外光照射下进行交联反应，得到脂肪细胞外基质支架。
在其中一个实施例中，所述将所述基质粉末与甲基丙烯酸酐在第一缓冲液中反应，得到甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质的步骤包括：
在40℃～60℃的条件下，将所述基质粉末在所述第一缓冲液中溶胀，得到混合物；将所述混合物与所述甲基丙烯酸酐在40℃～60℃下反应，得到反应液；将所述反应液进行透析处理，再在15℃～30℃下固液分离，收集固体，并将所述固体冷冻干燥，得到甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质。
在其中一个实施例中，所述将所述混合物与所述甲基丙烯酸酐在40℃～60℃下反应，得到反应液的步骤包括：
在40℃～60℃和持续搅拌的条件下，将所述甲基丙烯酸酐滴加到所述混合物中，待所述甲基丙烯酸酐加完后继续在40℃～60℃和持续搅拌的条件下反应2小时～24小时，然后加入所述第一缓冲液稀释反应体系，得到所述反应液。
在其中一个实施例中，所述将所述甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质与光引发剂、第二缓冲液混合的步骤包括：将所述光引发剂溶解在所述第二缓冲液中，然后加入所述甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质，并在25℃～40℃下混合均匀。
在其中一个实施例中，所述脱细胞处理的步骤包括：
将所述脂肪组织在强碱溶液中震荡孵化，然后固液分离，收集沉淀，得到第一沉淀物；用水清洗所述第一沉淀物直至所述第一沉淀物的pH为5～8；然后将所述第一沉淀物在强酸溶液中震荡孵化，经固液分离，收集沉淀，得到第二沉淀物；将所述第二沉淀物依次在pH为3～4的高渗盐水中浸泡清洗和在碳酸氢钠的水溶液中浸泡清洗，经固液分离，收集沉淀，得到第三沉淀物；将所述第三沉淀物用水清洗至中性，收集沉淀，得到脱细胞的所述脂肪组织；
及/或，所述脱水处理的步骤包括：将所述脱细胞处理后的所述脂肪组织依次浸泡在浓度递增的脱水剂中进行梯度脱水，每种浓度的所述脱水剂中的浸泡时间为15分钟～90分钟，所述脱水剂包括脱水物质，所述脱水物质选自酮类及醇类中的至少一种；
及/或，所述脱脂处理的步骤包括：将所述脱水处理后所述脂肪组织用脱脂剂浸泡，所述脱脂剂包括脱脂物质，所述脱脂物质选自正己烷及乙醚中的至少一种。
在其中一个实施例中，在将所述脂肪组织进行所述脱细胞处理的步骤之前，还包括对所述脂肪组织进行预处理的步骤，所述对所述脂肪组织进行预处理的步骤包括：将所述脂肪组织用生理盐水洗涤，然后将洗涤后的所述脂肪组织与水混合进行匀浆处理，收集沉淀。
在其中一个实施例中，所述基质粉末与所述甲基丙烯酸酐的质量比为2:20～20:2；
及/或，所述第一缓冲液和所述第二缓冲液分别独立地选自中性磷酸盐缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液及磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中的一种。
在其中一个实施例中，所述光引发剂选自2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮及苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂中的一种；
及/或，所述交联反应的步骤中，所述紫外光的强度为5mW/cm2～100mW/cm2，照射时间为30秒～30分钟。
上述脂肪细胞外基质支架的制备方法制备得到的脂肪细胞外基质支架。
上述脂肪细胞外基质支架在制备软组织修复用医疗器械中的应用。
上述脂肪细胞外基质支架的制备方法通过将脂肪组织依次进行脱细胞处理、脱水处理和脱脂处理，将得到的脂肪细胞外基质粉碎，以形成基质粉末，通过将基质粉末与甲基丙烯酸酐在第一缓冲液中反应得到甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质，将甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质与光引发剂、第二缓冲液混合，得到的浆料能够在紫外光照射的作用下发生交联而定型，那么在实际应用中，可以在紫外光照射之前将浆料置于所需形状的模具中，然后进行紫外光照射以发生交联而定型，交联后能够使脂肪细胞外基质支架具有较好的力学强度，而通过调节紫外光照射的强度和/或照射时间就能够调节脂肪细胞外基质支架的交联程度，以调节脂肪细胞外基质支架的体内降解速度，使得上述方法能够根据需要通过调整紫外光照射的强度和/或照射时间而调整支架所需的体内降解速度，从而使得上述方法制备得到的脂肪细胞外基质支架的力学强度较好且具有合适的体内降解速度。
附图说明
图1为一实施方式的脂肪细胞外基质支架的制备方法的流程图；
图2为实施例1～4的步骤(5)得到的脂肪细胞外基质支架及对比例1的步骤(3)得到的脂肪细胞外基质支架的拉伸强度的柱状图；
图3为实施例1的脂肪细胞外基质支架植入两周后的苏木素伊红(HE)染色图；
图4为对比例1的脂肪细胞外基质支架植入两周后的苏木素伊红(HE)染色图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
如图1所示，一实施方式的脂肪细胞外基质支架的制备方法，包括如下步骤：
步骤S110：对脂肪组织进行预处理。
其中，对脂肪组织进行预处理的步骤包括：将脂肪组织用生理盐水洗涤，以去除脂肪组织中的血液；然后将洗涤后的脂肪组织与水混合进行匀浆处理，收集沉淀。
具体地，脂肪组织可以为动物脂肪或离体的人类脂肪，其中，离体的人类脂肪例如可以为抽取的人体脂肪。
具体地，将脂肪组织用生理盐水洗涤的步骤包括：将脂肪组织剪碎，然后与生理盐水混合，并在1000转/分钟～2000转/分钟的转速下离心处理3分钟～10分钟，以去除脂肪中的血液。
具体地，将洗涤后的脂肪组织与水混合进行匀浆处理的步骤包括：按照质量比为(0.5～5):1将洗涤后的脂肪组织与水混合，然后在8000转/分钟～15000转/分钟的转速下匀浆2分钟～8分钟，然后静置，得到悬浮液；将悬浮液以2000转/分钟～5000转/分钟的转速于4℃～10℃下离心3分钟～10分钟。
可以理解，若脂肪组织为干净的、无血液的，步骤S110可以省略。
步骤S120：将脂肪组织依次进行脱细胞处理、脱水处理和脱脂处理，得到脂肪细胞外基质。
具体地，脱细胞处理的步骤包括：将脂肪组织在强碱溶液中震荡孵化，然后固液分离，收集沉淀，得到第一沉淀物；用水清洗第一沉淀物直至第一沉淀物的pH为5～8；然后将第一沉淀物在强酸溶液中震荡孵化，经固液分离，收集沉淀，得到第二沉淀物；将第二沉淀物依次在pH为3～4的高渗盐水中浸泡清洗和在碳酸氢钠的水溶液中浸泡清洗，经固液分离，收集沉淀，得到第三沉淀物；将第三沉淀物用水清洗至中性，收集沉淀，得到脱细胞的脂肪组织。其中，高渗盐水指的是质量百分浓度高于0.9％的生理盐水。更具体地，高渗盐水中的氯化钠的质量百分浓度大于0.9％且小于10％。具体地，通过在高渗盐水中加入酸调节高渗盐水的pH至3～4。其中，酸为盐酸。
在其中一个实施例中，强碱溶液为氢氧化钠的水溶液。强碱溶液的质量百分浓度0.5％～3％，脂肪组织与强碱溶液的质量比为1:5～1:30。将脂肪组织在强碱溶液中震荡孵化时的温度为15℃～30℃，震荡孵化的时间为1小时～24小时。
具体地，将脂肪组织在强碱溶液中震荡孵化之后的固液分离的步骤为离心分离，转速为2000转/分钟～5000转/分钟，离心时间为3分钟～10分钟。
在其中一个实施例中，强酸溶液为盐酸。强酸溶液的质量百分浓度为0.1％～2％，第一沉淀物与强酸溶液的质量比为1:5～1:30。将第一沉淀物在强酸溶液中震荡孵化时的温度为15℃～30℃，震荡孵化的时间为1小时～5小时。
具体地，将第一沉淀物在强酸溶液中震荡孵化后的固液分离的方法为离心分离，转速为2000转/分钟～5000转/分钟，离心时间为3分钟～10分钟。
具体地，将第二沉淀物在pH为3～4的高渗盐水中浸泡清洗的步骤之前，还包括将第二沉淀物用水清洗的步骤。
具体地，将第二沉淀物在pH为3～4的高渗盐水中浸泡清洗的次数为2次～3次，每次浸泡的时间为10分钟～180分钟。
具体地，将第二沉淀物在pH为3～4的高渗盐水中浸泡清洗之后的在碳酸氢钠的水溶液中浸泡清洗的步骤中，碳酸氢钠的水溶液的质量百分浓度为0.5％～2％，浸泡时间为12小时～24小时。
具体地，将第二沉淀物依次在pH为3～4的高渗盐水中浸泡清洗的步骤之前，还包括使用水交替清洗和离心2次～4次的步骤。
具体地，脱水处理的步骤包括：将脱细胞处理后的脂肪组织依次浸泡在浓度递增的脱水剂中进行梯度脱水，每种脱水剂中的浸泡时间为15分钟～90分钟。其中，脱水剂包括脱水物质，脱水物质选自丙酮及醇类中的至少一种。醇类选自乙醇及异丙醇中的至少一种。在其中一个实施例中，脱水剂中的脱水物质的质量百分浓度为50％～100％。
具体地，脱脂处理的步骤包括：将脱水处理后脂肪组织用脱脂剂浸泡，脱脂剂包括脱脂剂，脱脂剂选自正己烷及乙醚中的至少一种。在其中一个实施例中，将脱水处理后脂肪组织用脱脂剂浸泡2次～4次，每次浸泡的时间为4小时～24小时。
步骤S130：将脂肪细胞外基质粉碎，得到基质粉末。
具体地，将脂肪细胞外基质粉碎的步骤之前，还包括将脂肪组织细胞外基质干燥的步骤。
步骤S140：将基质粉末与甲基丙烯酸酐在第一缓冲液中反应得到甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质。
具体地，将基质粉末与甲基丙烯酸酐在第一缓冲液中反应得到甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质的步骤包括：在40℃～60℃的条件下，将基质粉末在第一缓冲液中溶胀，得到混合物；将混合物与甲基丙烯酸酐在40℃～60℃下反应得到反应物；将反应物进行透析处理，再在15℃～30℃下固液分离，收集固体，并将固体冷冻干燥，得到甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质。
具体地，将基质粉末在第一缓冲液中溶胀的步骤为：将基质粉末和第一缓冲液混合均匀，然后在40℃～60℃下溶胀30分钟～120分钟。
更具体地，将混合物与甲基丙烯酸酐在40℃～60℃下反应的步骤包括：在40℃～60℃和持续搅拌的条件下，将甲基丙烯酸酐滴加到混合物中，待甲基丙烯酸酐加完后继续在40℃～60℃和持续搅拌的条件下反应2小时～24小时，然后加入25℃～40℃的第一缓冲液稀释反应体系，得到反应液。通过加入第一缓冲液稀释反应体系以终止反应。在其中一个实施例中，稀释反应体系用的第一缓冲液与反应体系的质量比为(1～3):1。
具体地，具体地，基质粉末与甲基丙烯酸酐的质量比为2:20～20:2。
具体地，第一缓冲液选自中性磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲液)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液及磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中的一种。
具体地，将反应物进行透析处理后的固液分离的方法为离心分离，转速为3000转/分钟～5000转/分钟，离心时间为10分钟～30分钟。
步骤S150：将甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质与光引发剂、第二缓冲液混合，再在紫外光照射下进行交联反应，得到脂肪细胞外基质支架。
具体地，将甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质与光引发剂、第二缓冲液混合的步骤包括：将光引发剂溶解在第二缓冲液中，然后加入甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质，并在25℃～40℃下混合均匀。
具体地，光引发剂选自2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(光引发剂L2959)或苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)。光引发剂与甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质的质量比为(1～5):(1～20)。
具体地，第二缓冲液为中性磷酸盐缓冲溶液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液及磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中的一种。
具体地，紫外光的强度为5mW/cm2～100mW/cm2，照射时间为30秒～30分钟，以使脂肪细胞外基质支架具有较优的力学强度且具有合适的体内降解速度。
具体地，在将甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质与光引发剂、第二缓冲液混合的步骤之后，再在紫外光照射下进行交联反应的步骤之前，还包括将甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质与光引发剂、第二缓冲液混合得到的浆料装入模具中的步骤。
进一步地，在步骤S160之后，还包括将脂肪细胞外基质支架冷冻干燥的步骤。该步骤可以根据需要进行选择。
进一步地，在步骤S160之后，还包括将脂肪细胞外基质支架包装，然后灭菌的步骤。包装的脂肪细胞外基质支架可以为冷冻干燥的脂肪细胞外基质支架，也可以为未经冷冻干燥的脂肪细胞外基质支架。灭菌的方法为钴-60γ射线辐照灭菌或电子束辐照灭菌。
上述脂肪细胞外基质支架的制备方法通过将脂肪组织依次进行脱细胞处理、脱水处理和脱脂处理后得到脂肪细胞外基质粉碎，以形成基质粉末，通过将基质粉末与甲基丙烯酸酐在第一缓冲液中反应得到甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质，将甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质与光引发剂、第二缓冲液混合，得到的浆料能够在紫外光照射的作用下发生交联而定型，那么在实际应用中，可以在紫外光照射之前将浆料置于所需形状的模具中，然后进行紫外光照射以发生交联而定型，交联后能够使脂肪细胞外基质支架具有较好的力学强度，而通过调节紫外光照射的强度和/或照射时间就能够调节脂肪细胞外基质支架的交联程度，以调节脂肪细胞外基质支架的体内降解速度，使得上述方法能够根据需要通过调整紫外光照射的强度和/或照射时间而调整支架所需的体内降解速度，从而使得上述方法制备得到的脂肪细胞外基质支架的力学强度较好且具有合适的体内降解速度。
同时，上述方法的脱细胞处理、脱水处理和脱脂处理不仅脱细胞彻底、免疫源物质去除彻底，而且还保留了原组织的三维结构，有利于宿主细胞的长入，使得制备得到的脂肪细胞外基质支架还具有较好的生物相容性和生物活性。
一实施方式的脂肪细胞外基质支架的制备方法制备得到的脂肪细胞外基质支架。该脂肪细胞外基质支架的力学强度较好且具有合适的降解速度，同时还具有较好的生物相容性和生物活性。在软组织修复领域具有巨大的应用潜力。该脂肪细胞外基质支架可以用于制备软组织修复用医疗器械。
以下为具体实施例部分(以下实施例如无特殊说明，则不含有除不可避免的杂质以外的其它未明确指出的组分。)：
实施例1
本实施例的脂肪细胞外基质支架的制备过程如下：
(1)脂肪组织的预处理：将新鲜的猪脂肪组织切成大小约1cm×1cm×1cm的小块，然后与生理盐水混合，并在1200转/分钟的转速下离心处理8分钟，去除脂肪中的血液。将清洗后的脂肪组织与纯水按照质量比0.5:1混匀，然后在高速匀浆机中在室温下以12000rpm的转速匀浆6分钟，将匀浆后的组织悬液静置，得到悬浮液，将悬浮液以3000rpm的转速于4℃下温离心3分钟，收集白色沉淀物，得到预处理的脂肪组织。
(2)脱细胞处理：将步骤(1)得到的预处理的脂肪组织与质量百分浓度为1.0％的氢氧化钠的水溶液按质量比1:20混合均匀，然后在25℃条件下，在震荡摇床中孵化24小时，随后在3000rpm的转速下于15℃离心10分钟，收集底层白色沉淀，得到第一沉淀物。将第一沉淀物用纯水清洗，直至第一沉淀物的pH值为8.0，将第一沉淀物离心处理，收集白色沉淀物，然后将白色沉淀物与质量百分浓度为0.5％的盐酸按质量比为1:20混合均匀，然后在20℃下于震荡摇床中孵化4小时，随后在3000rpm的转速下于15℃离心10分钟，收集白色沉淀物，得到第二沉淀物。将第二沉淀物用纯水交替清洗和离心4次，收集白色凝胶状沉淀物。将白色凝胶状沉淀物用pH为4.0的高渗盐水浸泡清洗2次，每次浸泡120分钟，然后再用质量百分浓度为0.5％的碳酸氢钠的水溶液浸泡清洗24小时，然后离心处理，收集沉淀，得到第三沉淀物，将第三沉淀物用纯水反复清洗至中性后离心，收集沉淀，得到脱细胞的脂肪组织。
(3)脱水处理和脱脂处理：将步骤(2)得到的脱细胞的脂肪组织依次用质量百分浓度为70％、90％、100％的丙酮的水溶液进行脱水处理，每种浓度下处理的时间为60分钟，得到脱水处理后的脂肪组织。将脱水处理后的脂肪组织在正己烷中浸泡处理4次，每次12小时，处理完成后去除有机溶剂，自然干燥，得到脂肪细胞外基质。
(4)甲基丙烯酸化处理：将步骤(3)中得到的脂肪细胞外基质用高速冷冻研磨机研磨成粉末，得到基质粉末。称取5质量份的基质粉末，然后加入100质量份的PBS缓冲液，混合均匀，并在60℃温度下溶胀60分钟，得到混合物；接着，在60℃和持续搅拌的条件下，将2质量份的甲基丙烯酸酐滴加到混合物中，待甲基丙烯酸酐滴加完成后，在60℃下继续搅拌反应2小时，然后加入与反应体系等质量的温度为40℃的PBS缓冲液以稀释反应体系，得到反应液，将反应液倒入透析袋中透析，去除未反应的甲基丙烯酸酐；再将透析后反应液在5000rpm的转速下于15℃离心10分钟，收集沉淀并进行冷冻干燥，得到甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质。
(5)光固化：称取质量份为0.1份的光引发剂L2959在25℃下溶解于100质量份的PBS缓冲液中，得到预混液；然后称取1质量份的步骤(4)中获得的甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质加入预混液中，并在25℃下混合均匀，得到浆料；将浆料装入模具中，在光强为5mW/cm2的紫外灯下照射30分钟，得到凝胶状的脂肪细胞外基质支架。
(6)将步骤(5)中得到的脂肪细胞外基质支架进行包装，之后进行钴-60γ射线辐照灭菌。
实施例2
本实施例的脂肪细胞外基质支架的制备过程如下：
(1)脂肪组织的预处理：将抽脂手术收集的人体脂肪与生理盐水混合，并在2000转/分钟的转速下离心处理10分钟，以去除脂肪中的血液。将清洗后的脂肪组织与纯水按照质量比3:1混匀，然后在高速匀浆机中在室温下以10000rpm的转速匀浆3分钟，将匀浆后的组织悬液静置，得到悬浮液，将悬浮液以5000rpm的转速于10℃下温离心10分钟，收集白色沉淀物，得到预处理的脂肪组织。
(2)脱细胞处理：将步骤(1)得到的预处理的脂肪组织与质量百分浓度为2％的氢氧化钠的水溶液按质量比1:10混合均匀，然后在20℃条件下，在震荡摇床中孵化4小时，随后在5000rpm的转速下于30℃离心5分钟，收集底层白色沉淀，得到第一沉淀物。将第一沉淀物用纯水清洗，直至第一沉淀物的pH值为6，将第一沉淀物离心处理，收集白色沉淀物，然后将白色沉淀物与质量百分浓度为2％的盐酸按质量比为1:10混合均匀，然后在20℃下于震荡摇床中孵化2小时，随后在5000rpm的转速下于30℃离心4分钟，收集白色沉淀物，得到第二沉淀物。将第二沉淀物用纯水交替清洗和离心3次，收集白色凝胶状沉淀物。将白色凝胶状沉淀物用pH为3的高渗盐水浸泡清洗3次，每次浸泡10分钟，然后再用质量百分浓度为2％的碳酸氢钠的水溶液浸泡清洗12小时，然后离心处理，收集沉淀，得到第三沉淀物，将第三沉淀物用纯水反复清洗至中性后离心，收集沉淀，得到脱细胞的脂肪组织。
(3)脱水处理和脱脂处理：将步骤(2)得到的脱细胞的脂肪组织依次用质量百分浓度为70％、80％、90％、95％、100％的异丙醇的水溶液进行脱水处理，每种浓度下处理的时间为30分钟，得到脱水处理后的脂肪组织。将脱水处理后的脂肪组织在乙醚中浸泡处理2次，每次24小时，处理完成后去除有机溶剂，自然干燥，得到脂肪细胞外基质。
(4)甲基丙烯酸化处理：将步骤(3)中得到的脂肪细胞外基质用高速冷冻研磨机研磨成粉末，得到基质粉末。称取10质量份的基质粉末，然后加入100质量份的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，混合均匀，并在50℃温度下溶胀120分钟，得到混合物；接着，在50℃和持续搅拌的条件下，将10质量份的甲基丙烯酸酐滴加到混合物中，待甲基丙烯酸酐滴加完成后，在50℃下继续搅拌反应12小时，然后加入与反应体系的质量比为2:1的温度为30℃的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液以稀释反应体系，得到反应液，将反应液倒入透析袋中透析，去除未反应的甲基丙烯酸酐；再将透析后反应液在5000rpm的转速下于30℃离心10分钟，收集沉淀并进行冷冻干燥，得到甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质。
(5)光固化：称取质量份为5份的光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂在37℃下溶解于100质量份的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，得到预混液；然后称取1质量份的步骤(4)中获得的甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质加入预混液中，并在37℃下混合均匀，得到浆料；将浆料装入模具中，在光强为100mW/cm2的紫外灯下照射30s，得到凝胶状的脂肪细胞外基质支架。
(6)将步骤(5)中得到的脂肪细胞外基质支架进行包装，之后进行电子束辐射灭菌。
实施例3
本实施例的脂肪细胞外基质支架的制备过程如下：
(1)脂肪组织的预处理：将新鲜的猪脂肪组织切成大小约1cm×1cm×1cm的小块，然后与生理盐水混合，并在1000转/分钟的转速下离心处理3分钟，以去除脂肪中的血液。将清洗后的脂肪组织与纯水按照质量比5:1混匀，然后在高速匀浆机中在室温下以8000转/分钟的转速匀浆8分钟，将匀浆后的组织悬液静置，得到悬浮液，将悬浮液以2000转/分钟的转速于8℃下温离心10分钟，收集白色沉淀物，得到预处理的脂肪组织。
(2)脱细胞处理：将步骤(1)得到的预处理的脂肪组织与质量百分浓度为0.5％的氢氧化钠的水溶液按质量比1:30混合均匀，然后在15℃条件下，在震荡摇床中孵化1小时，随后在2000转/分钟的转速下于20℃离心3分钟，收集底层白色沉淀，得到第一沉淀物。将第一沉淀物用纯水清洗，直至第一沉淀物的pH值为5，将第一沉淀物离心处理，收集白色沉淀物，然后将白色沉淀物与质量百分浓度为0.1％的盐酸按质量比为1:30混合均匀，然后在15℃下于震荡摇床中孵化5小时，随后在2000转/分钟的转速下于20℃离心3分钟，收集白色沉淀物，得到第二沉淀物。将第二沉淀物用纯水交替清洗和离心3次，收集白色凝胶状沉淀物。将白色凝胶状沉淀物用pH为3的高渗盐水浸泡清洗2次，每次浸泡180分钟，然后再用质量百分浓度为1％的碳酸氢钠的水溶液浸泡清洗18小时，然后离心处理，收集沉淀，得到第三沉淀物，将第三沉淀物用纯水反复清洗至中性后离心，收集沉淀，得到脱细胞的脂肪组织。
(3)脱水处理和脱脂处理：将步骤(2)得到的脱细胞的脂肪组织依次用质量百分浓度为50％、60％、70％、80％、90％、100％的乙醇进行脱水处理，每种浓度下处理的时间为15分钟，得到脱水处理后的脂肪组织。将脱水处理后的脂肪组织在正己烷中浸泡处理3次，每次4小时，处理完成后去除有机溶剂，自然干燥，得到脂肪细胞外基质。
(4)甲基丙烯酸化处理：将步骤(3)中得到的脂肪细胞外基质用高速冷冻研磨机研磨成粉末，得到基质粉末。称取2质量份的基质粉末，然后加入100质量份的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，混合均匀，并在40℃温度下溶胀30分钟，得到混合物；接着，在40℃和持续搅拌的条件下，将20质量份的甲基丙烯酸酐滴加到混合物中，待甲基丙烯酸酐滴加完成后，在40℃下继续搅拌反应24小时，然后加入与反应体系的质量比为3:1的温度为25℃的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液以稀释反应体系，得到反应液，将反应液倒入透析袋中透析，去除未反应的甲基丙烯酸酐；再将透析后反应液在3000rpm的转速下于20℃离心20分钟，收集沉淀并进行冷冻干燥，得到甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质。
(5)光固化：称取质量份为1份的光引发剂L2959在40℃下溶解于100质量份的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，得到预混液；然后称取20质量份的步骤(4)中获得的甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质加入预混液中，并在40℃下混合均匀，得到浆料；将浆料装入模具中，在光强为50mW/cm2的紫外灯下照射20分钟，得到凝胶状的脂肪细胞外基质支架。
(6)将步骤(5)中得到的脂肪细胞外基质支架冷冻干燥后进行包装，之后进行钴-60γ射线辐照灭菌。
实施例4
本实施例的脂肪细胞外基质支架的制备过程如下：
(1)脂肪组织的预处理：将新鲜的猪脂肪组织切成大小约1cm×1cm×1cm的小块，然后与生理盐水混合，并在1500转/分钟的转速下离心处理8分钟，以去除脂肪中的血液。将清洗后的脂肪组织与纯水按照质量比2:1混匀，然后在高速匀浆机中在室温下以15000转/分钟的转速匀浆2分钟，将匀浆后的组织悬液静置，得到悬浮液，将悬浮液以2000转/分钟的转速于20℃下温离心5分钟，收集白色沉淀物，得到预处理的脂肪组织。
(2)脱细胞处理：将步骤(1)得到的预处理的脂肪组织与质量百分浓度为3％的氢氧化钠的水溶液按质量比1:5混合均匀，然后在30℃条件下，在震荡摇床中孵化12小时，随后在3500转/分钟的转速下于20℃离心3分钟，收集底层白色沉淀，得到第一沉淀物。将第一沉淀物用纯水清洗，直至第一沉淀物的pH值为7，将第一沉淀物离心处理，收集白色沉淀物，然后将白色沉淀物与质量百分浓度为1％的盐酸按质量比为1:5混合均匀，然后在30℃下于震荡摇床中孵化1小时，随后在3500转/分钟的转速下于20℃离心5分钟，收集白色沉淀物，得到第二沉淀物。将第二沉淀物用纯水交替清洗和离心3次，收集白色凝胶状沉淀物。将白色凝胶状沉淀物用pH为3的高渗盐水浸泡清洗3次，每次浸泡50分钟，然后再用质量百分浓度为1.5％的碳酸氢钠的水溶液浸泡清洗20小时，然后离心处理，收集沉淀，得到第三沉淀物，将第三沉淀物用纯水反复清洗至中性后离心，收集沉淀，得到脱细胞的脂肪组织。
(3)脱水处理和脱脂处理：将步骤(2)得到的脱细胞的脂肪组织依次用质量百分浓度为70％、80％、90％、100％的丙酮的水溶液进行脱水处理，每种浓度下处理的时间为90分钟，得到脱水处理后的脂肪组织。将脱水处理后的脂肪组织在乙醚中浸泡处理2次，每次10小时，处理完成后去除有机溶剂，自然干燥，得到脂肪细胞外基质。
(4)甲基丙烯酸化处理：将步骤(3)中得到的脂肪细胞外基质用高速冷冻研磨机研磨成粉末，得到基质粉末。称取20质量份的基质粉末，然后加入100质量份的PBS缓冲液，混合均匀，并在50℃温度下溶胀80分钟，得到混合物；接着，在50℃和持续搅拌的条件下，将2质量份的甲基丙烯酸酐滴加到混合物中，待甲基丙烯酸酐滴加完成后，在50℃下继续搅拌反应10小时，然后加入与反应体系的质量比为2.5:1的温度为35℃的PBS缓冲液以稀释反应体系，得到反应液，将反应液倒入透析袋中透析，去除未反应的甲基丙烯酸酐；再将透析后反应液在4000pm的转速下于20℃离心20分钟，收集沉淀并进行冷冻干燥，得到甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质。
(5)光固化：称取质量份为5份的光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂在30℃下溶解于100质量份的PBS缓冲液中，得到预混液；然后称取1质量份的步骤(4)中获得的甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质加入预混液中，并在30℃下混合均匀，得到浆料；将浆料装入模具中，在光强为20mW/cm2的紫外灯下照射15分钟，得到凝胶状的脂肪细胞外基质支架。
(6)将步骤(5)中得到的脂肪细胞外基质支架冷冻干燥后进行包装，之后进行电子束辐射灭菌。
对比例1
对比例1的脂肪细胞外基质支架的制备如下：
(1)与实施例1的步骤(1)相同。
(2)与实施例1的步骤(2)相同；
(3)与实施例1的步骤(3)相同，得到的脂肪细胞外基质即为对比例1的脂肪细胞外基质支架。
(4)将步骤(3)得到的脂肪细胞外基质进行包装，之后进行钴-60γ射线辐照灭菌。
对比例2
对比例2的脂肪细胞外基质的制备过程如下：
(1)脂肪组织的预处理：将新鲜的猪脂肪组织切成大小约1cm×1cm×1cm的小块，然后与生理盐水混合，并在1200转/分钟的转速下离心处理8分钟，去除脂肪中的血液。将清洗后的脂肪组织与纯水按照质量比0.5:1混匀，然后在高速匀浆机中在室温下以12000rpm的转速匀浆6分钟，将匀浆后的组织悬液静置，得到悬浮液，将悬浮液以3000rpm的转速于4℃下温离心3分钟，收集白色沉淀物，得到预处理的脂肪组织。
(2)将预处理的脂肪组织使用PBS缓冲液漂洗后球磨仪打粉(2500r/s，5min)；
(3)室温下使用0.5％SDS溶液漂洗粉末状材料4h，大量PBS缓冲液漂洗至无泡沫，离心(3500rpm，5min)；
(4)用质量百分浓度为100％异丙醇溶液漂洗粉末状材料2h脱脂，大量PBS缓冲液漂洗，直至材料无异味，得到脂肪细胞外基质。
(5)将步骤(4)得到的脂肪细胞外基质制备粉末状材料后，将粉末放入不同的模具中，冻干制成不同形状的猪脂肪组织源性无细胞基质材料，包装后环氧乙烷消毒。
测试：
1)根据《YY/T 0606.25-2014组织工程医疗产品第25部分：动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法》方法测试实施例1～4的步骤(3)制备得到的脂肪细胞外基质中的外源性DNA残留水平和对比例2的步骤(4)制备得到的细胞外基质中的外源性DNA残留水平，其中，实施例1～4的步骤(3)得到的脂肪细胞外基质和对比例2的步骤(4)制备得到的细胞外基质中的DNA残留量如表1所示，从表1中可以看出，实施例1～4得到的脂肪细胞外基质的DNA残留量远远低于对比例2。
表1
Figure BDA0001929502090000201
2)采用美斯特万能力学实验机以为20mm/min加载速度，测试实施例1～4的步骤(5)得到的脂肪细胞外基质支架及对比例1的步骤(3)得到的脂肪细胞外基质支架的拉伸强度，图2为实施例1～4的步骤(5)得到的脂肪细胞外基质支架及对比例1的步骤(3)得到的脂肪细胞外基质支架的拉伸强度的柱状图，从图2中可以看出，实施例1～4的拉伸强度均明显高于对比例1。
3)将实施例1～4的步骤(5)得到的脂肪细胞外基质支架及对比例1的步骤(3)得到的脂肪细胞外基质支架分别浸泡在活性浓度为3.5UI/ml细菌胶原蛋白酶溶液中，并在37℃下孵化2h，然后取出，并冷冻干燥、称重，计算降解失重率，降解失重率＝(样品降解前的重量-样品降解后的剩余重量)/样品降解前的重量×100％，其中，实施例1～4的步骤(5)得到的脂肪细胞外基质支架及对比例1的步骤(3)得到的脂肪细胞外基质支架的降解失重率如表2所示。
表2
Figure BDA0001929502090000202
Figure BDA0001929502090000211
从表2中可以看出，在相同试验条件下，实施例1～4的脂肪细胞外基质支架的降解失重率明显低于对比例1的脂肪细胞外基质支架。
4)实施例1～4及对比例1的脂肪细胞外基质支架的生物相容性测试，将实施例1～4及对比例1的脂肪细胞外基质支架分别植入新西兰大白兔皮下，2周后观察两种支架材料的体内降解情况、周围组织的炎症反应情况。具体实验如下：
取新西兰兔，称重并按30mg/kg比例耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠溶液麻醉动物。去除背部被毛，尽量避免机械损伤皮肤。麻醉后观察10min，确认无明显结膜反射后，背部用浓度为5g/L的碘伏与75％酒精对手术区消毒。在新西兰兔的一侧切取长约15mm的皮囊，向两侧皮下钝性分离，至距切口约15mm处每侧各形成皮囊。分别将已制备好的样品植入皮囊内，缝合皮囊切口，并消毒。植入2周后，空气栓塞处死动物，分别进行组织取材。固定于10％甲醛溶液中，常规石蜡包埋，半连续切片，HE(苏木素伊红)染色后，在光学显微镜下进行切片观察。
图3和图4分别为实施例1和对比例1的脂肪细胞外基质支架植入两周后的苏木素伊红(HE)染色图，从图3和图4中可以看出，实施例1与对比例1的脂肪细胞外基质支架在新西兰大白兔皮下植入2周后，支架材料与植入部位周围组织均未出现明显炎症反应，并且实施例1的脂肪细胞外基质支架中出现少量新生血管，但是，对比例1的脂肪细胞外基质支架植入2周后，支架出现明显的降解，而实施例1的脂肪细胞外基质支架基本保持完整，从降解速度开看，实施例1明显优于对比例1。其中，实施例2～实施例4的与实施例1相似，植入两周后的与实施例1相似，支架材料与植入部位周围组织均未出现明显炎症反应，且脂肪细胞外基质支架中出现少量新生血管，支架基本保持完整，降解速率较对比例1慢，在此不再赘述。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种脂肪细胞外基质支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将脂肪组织依次进行脱细胞处理、脱水处理和脱脂处理，得到脂肪细胞外基质；
将所述脂肪细胞外基质粉碎，得到基质粉末；
将所述基质粉末与甲基丙烯酸酐在第一缓冲液中反应，得到甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质；及
将所述甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质与光引发剂、第二缓冲液混合，再在紫外光照射下进行交联反应，得到脂肪细胞外基质支架。
2.根据权利要求1所述的脂肪细胞外基质支架的制备方法，其特征在于，所述将所述基质粉末与甲基丙烯酸酐在第一缓冲液中反应，得到甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质的步骤包括：
在40℃～60℃的条件下，将所述基质粉末在所述第一缓冲液中溶胀，得到混合物；将所述混合物与所述甲基丙烯酸酐在40℃～60℃下反应，得到反应液；将所述反应液进行透析处理，再在15℃～30℃下固液分离，收集固体，并将所述固体冷冻干燥，得到甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质。
3.根据权利要求2所述的脂肪细胞外基质支架的制备方法，其特征在于，所述将所述混合物与所述甲基丙烯酸酐在40℃～60℃下反应，得到反应液的步骤包括：
在40℃～60℃和持续搅拌的条件下，将所述甲基丙烯酸酐滴加到所述混合物中，待所述甲基丙烯酸酐加完后继续在40℃～60℃和持续搅拌的条件下反应2小时～24小时，然后加入所述第一缓冲液稀释反应体系，得到所述反应液。
4.根据权利要求1所述的脂肪细胞外基质支架的制备方法，其特征在于，所述将所述甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质与光引发剂、第二缓冲液混合的步骤包括：将所述光引发剂溶解在所述第二缓冲液中，然后加入所述甲基丙烯酸化脂肪细胞外基质，并在25℃～40℃下混合均匀。
5.根据权利要求1所述的脂肪细胞外基质支架的制备方法，其特征在于，所述脱细胞处理的步骤包括：
将所述脂肪组织在强碱溶液中震荡孵化，然后固液分离，收集沉淀，得到第一沉淀物；用水清洗所述第一沉淀物直至所述第一沉淀物的pH为5～8；然后将所述第一沉淀物在强酸溶液中震荡孵化，经固液分离，收集沉淀，得到第二沉淀物；将所述第二沉淀物依次在pH为3～4的高渗盐水中浸泡清洗和在碳酸氢钠的水溶液中浸泡清洗，经固液分离，收集沉淀，得到第三沉淀物；将所述第三沉淀物用水清洗至中性，收集沉淀，得到脱细胞的所述脂肪组织；
及/或，所述脱水处理的步骤包括：将所述脱细胞处理后的所述脂肪组织依次浸泡在浓度递增的脱水剂中进行梯度脱水，每种浓度的所述脱水剂中的浸泡时间为15分钟～90分钟，所述脱水剂包括脱水物质，所述脱水物质选自丙酮及醇类中的至少一种；
及/或，所述脱脂处理的步骤包括：将所述脱水处理后所述脂肪组织用脱脂剂浸泡，所述脱脂剂包括脱脂物质，所述脱脂物质选自正己烷及乙醚中的至少一种。
6.根据权利要求1～5任一项所述的脂肪细胞外基质支架的制备方法，其特征在于，在将所述脂肪组织进行所述脱细胞处理的步骤之前，还包括对所述脂肪组织进行预处理的步骤，所述对所述脂肪组织进行预处理的步骤包括：将所述脂肪组织用生理盐水洗涤，然后将洗涤后的所述脂肪组织与水混合进行匀浆处理，收集沉淀。
7.根据权利要求1～5任一项所述的脂肪细胞外基质支架的制备方法，其特征在于，所述基质粉末与所述甲基丙烯酸酐的质量比为2:20～20:2；
及/或，所述第一缓冲液和所述第二缓冲液分别独立地选自中性磷酸盐缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液及磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中的一种。
8.根据权利要求1～5任一项所述的脂肪细胞外基质支架的制备方法，其特征在于，所述光引发剂选自2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮及苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂中的一种；
及/或，所述交联反应的步骤中，所述紫外光的强度为5mW/cm2～100mW/cm2，照射时间为30秒～30分钟。
9.权利要求1～8任一项所述的脂肪细胞外基质支架的制备方法制备得到的脂肪细胞外基质支架。
10.权利要求9所述的脂肪细胞外基质支架在制备软组织修复用医疗器械中的应用。
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