CN114848913A - 一种诱导骨再生修复材料的制备方法及其产品与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种诱导骨再生修复材料的制备方法及其产品与应用，属于生物材料技术领域，包括如下步骤：在煅烧骨颗粒表面复合重组胶原蛋白和/或透明质酸钠，然后置于细胞培养液中培养，获得再生骨修复材料。本发明制备的再生修复材料具有三维网状多孔结构以及表面覆有细胞分泌合成的细胞外基质涂层和细胞生长因子，有利于细胞贴附、长入以及新骨的形成，且在新骨基本成型后，可完全降解。

Description

一种诱导骨再生修复材料的制备方法及其产品与应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，尤其涉及一种诱导骨再生修复材料的制备方法及其产品与应用。
背景技术
骨缺损是临床骨科最常见的病症之一，可由感染、外伤、肿瘤和先天性疾病等造成，大部分不能自愈，需进行骨移植。随着人口老龄化和各种创伤的增多，对生物医学材料尤其是骨移植材料的需求也持续增长。很多天然材料和合成材料及其组合物已被用于骨缺损的治疗。
目前用于骨缺损的材料有多种，比如钙盐类骨填充植入物、丙自体骨、同种异体骨、异种异体骨、重组BMP、人工骨、金属材料等。但是现有许多骨修复材料仍存在一些弊端，比如自体骨虽然无免疫性，但是会对患者造成二次损伤且来源少；同种异体骨虽然骨诱导和传导能力强，但是免疫排斥反应大，需要通过冷冻或冻干法加工以去除其抗原性并延长贮存时间，在灭菌过程中会危害其材料特性及削弱骨诱导性；异种异体骨虽然来源广泛，但是免疫排斥反应比同种异体骨还要大，经脱钙、煅烧等处理后其活性物质基本不存在。另外，经脱钙、煅烧等处理后的异种异体骨，骨诱导性差且细胞贴附性低，植入骨缺损部位后不能很好的诱导新骨形成。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种诱导骨再生修复材料，该材料可有效促进新骨再生，且在新骨基本成型后，可完全降解。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种诱导骨再生修复材料的制备方法，包括如下步骤：在煅烧骨颗粒表面复合重组胶原蛋白和/或透明质酸钠，然后置于细胞培养液中培养，获得诱导骨再生修复材料。
优选的，所述煅烧骨颗粒的制备方法如下：取动物的股骨、椎骨、胫骨的松质骨，去除有机质，粉碎成粒径为1～30mm骨块，依次进行灭菌处理、胰酶酶解、氢氧化钠超声波处理、PBS清洗至中性、过氧化氢处理、干燥后粉碎至粒径为0.2～6mm的颗粒、煅烧处理，即得煅烧骨颗粒。
优选的，所述灭菌方式为钴60辐射灭菌、高压灭菌中的任意一种。
优选的，所述胰酶浓度为0.2～3g/L，所述酶解的时间为24～92h。
优选的，所述过氧化氢的浓度为10～35％，所述过氧化氢处理时间为30min以上。
优选的，所述复合重组胶原蛋白和/或透明质酸钠的具体步骤为：将所述煅烧骨颗粒倒入重组胶原蛋白和/或透明质酸钠溶液中，负压抽吸后浸泡1～12h，即复合完成。
优选的，所述细胞培养液包括如下按体积百分比组分：70～95％RPMI-1640培养基、5～20％胎牛血清、0.3～2.5％双抗(200ml)谷氨酰胺、5～15mg/ml链霉素和8000～15000U青霉素。
优选的，所述培养的具体步骤为：将复合重组胶原蛋白和/或透明质酸钠的煅烧骨颗粒按不超过4％的重量比加至细胞培养液中静置1～4h，然后动态三维培养，每三天换液，培养4～8天。
本发明提供了所述制备方法制备的诱导骨再生修复材料。
本发明还提供了所述诱导骨再生修复材料在制备修复骨缺损药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明制备的再生修复材料具有三维网状多孔结构以及表面覆有细胞分泌合成的细胞外基质涂层和细胞生长因子，有利于细胞贴附、长入以及新骨的形成，且在新骨基本成型后，可完全降解。
本发明制备工艺简便易行，可重复性高。
附图说明
图1诱导骨再生修复材料的大体扫描电镜图。
图2诱导骨再生修复材料放大后的扫描电镜图。
图3诱导骨再生修复材料表面复合骨髓间充质干细胞的扫描电镜图。
具体实施方式
本发明提供了一种诱导骨再生修复材料的制备方法，包括如下步骤：在煅烧骨颗粒表面复合重组胶原蛋白和/或透明质酸钠，然后置于细胞培养液中培养，获得诱导骨再生修复材料。
在本发明中，所述煅烧骨颗粒的制备方法如下：取动物的股骨、椎骨的松质骨，去除有机质，粉碎成粒径为1～30mm骨块，依次进行灭菌处理、胰酶酶解、氢氧化钠超声波处理、PBS清洗至中性、过氧化氢处理、干燥后粉碎至粒径为0.2～6mm的颗粒、煅烧处理，即得煅烧骨颗粒。本发明中所述动物为牛、猪、羊中的任意一种。本发明中所述灭菌方式为钴60辐射灭菌、高压灭菌中的任意一种，所述辐照剂量优选为14-30KGy。本发明中所述胰酶浓度优选为0.20～3g/L，更优选为0.25～1g/L；所述酶解的时间优选为24～92h，更优选为48～72h。本发明中所述氢氧化钠的浓度优选为0.5～3.5mol/L，更优选为1～2.5mol/L；所述氢氧化钠超声处理的时间优选为0.5h以上，更优选为1～4h。本发明中所述过氧化氢的浓度优选为10～35％，更优选为15～30％；所述过氧化氢处理时间优选为30min以上，更优选为35～60min。
在本发明中，所述煅烧处理的具体步骤为：将所述粒径0.2～6mm的颗粒放入刚玉坩埚中煅烧，升温至400～800℃后恒温煅烧1～3h，自然降温，完成一次煅烧。本发明中还可根据产品的需要进行二次煅烧，其工艺为：升温至800～1200℃后恒温煅烧3～6h，自然降温。本发明中所述一次煅烧的骨块强度比所述二次煅烧的强度小，一次煅烧适于制备粒径500μm以下的骨颗粒，二次煅烧更适于制备较大尺寸的骨颗粒，且二次煅烧会形成更多的CaO晶体，提高煅烧骨的溶解性。
在本发明中，所述复合重组胶原蛋白和/或透明质酸钠的具体步骤为：将所述煅烧骨颗粒倒入重组胶原蛋白和/或透明质酸钠溶液中，负压抽吸后浸泡1～12h，即复合完成。本发明中所述重组胶原蛋白的浓度优选为1～5mg/ml，更优选为3mg/ml；所述透明质酸钠的浓度优选为10～20mg/ml，更优选为15mg/ml。本发明中所述复合完成后，需对复合完成的煅烧骨颗粒采用干燥箱40～90℃烘干6～18h，然后粉碎粒径为0.2～6mm的颗粒，即得复合重组胶原蛋白和/或透明质酸钠的煅烧骨颗粒。
在本发明中，所述细胞培养液包括如下按体积百分比组分：70～95％RPMI-1640培养基、5～20％胎牛血清、0.3～2.5％双抗(200ml)谷氨酰胺、5～15mg/ml链霉素和8000～15000U青霉素。
在本发明中，所述培养的具体步骤为：将复合重组胶原蛋白和/或透明质酸钠的煅烧骨颗粒按不超过4％的重量比加至细胞培养液中静置1～4h，然后动态三维培养，每三天换液，培养4～8天。本发明中所述动态三维培养的方法为旋转式细胞培养方法。本发明中所述培养需培养至细胞培养液中至少含有105个细胞/ml。
本发明提供了所述制备方法制备的诱导骨再生修复材料。本发明中所述的诱导骨再生修复材料主要成分为羟基磷灰石晶体，具有三维网状多孔结构，粒径为0.2～6mm的颗粒，孔径大小分布在60～500μm之间。
本发明还提供了所述诱导骨再生修复材料在制备修复骨缺损药物中的应用。本发明所述骨再生修复材料颗粒可以作为填充材料单独使用，也可以与凝胶溶液混合使用。本发明中所述的凝胶为纤维蛋白原、纤维蛋白、海藻酸盐、胶原蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、水凝胶、骨胶、明胶、果胶、骨水泥的任意一种或是多种。本发明中所述混合使用时为凝胶状，可以塑形成缺损部位的形状，填充到人体骨缺损部位，便于操作。本发明中单独使用时，可用膜样结构包被骨缺损部位(例如胶原膜、羊膜等材料)，隔离颗粒与周围软组织，起到固定骨颗粒，隔离骨颗粒与周围软组织的作用，降低骨颗粒被组织吸收的速度，有利于骨缺损部位的重建。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、煅烧骨颗粒的制备
取适龄牛股骨骨骺端松质骨，人工去除表面的结缔组织及其附属组织后，机械加工成粒径5mm大小碎骨块，纯化水搅拌清洗15min；将碎骨块装进不锈钢桶，加入1.5倍量的纯化水，使用高压灭菌锅蒸煮1h，再用3倍量的纯化水清洗3次；然后将碎骨块置入浓度为0.25g/L胰酶溶液常温下消化48h，再用纯化水搅拌清洗后置于1M的NaOH溶液中超声波处理1h，每0.5h更换NaOH溶液一次，PBS搅拌清洗至中性；再用15％浓度的H2O2溶液常温处理50min，纯化水+注射用水搅拌清洗，37℃干燥箱内干燥至完全干燥，机械粉碎至粒径为5mm的颗粒。
将干燥后的颗粒放入刚玉坩埚中，在马弗炉中煅烧，升温到600℃，继续恒温煅烧6h，待炉内温度降至室温，取出，使用辊式粉碎机将骨再生修复材料粉碎后用筛网分选出粒径50～150μm的煅烧骨颗粒，即得煅烧骨颗粒。
2、复合透明质酸：将煅烧骨颗粒置于15mg/ml的透明质酸钠溶液中负压抽吸后，浸泡8h，再经常温干燥后灭菌消毒。
3、细胞培养液的配制：其组分按体积百分比有：90％RPMI-1640培养基、10％胎牛血清、1％双抗(200ml)谷氨酰胺、10mg/ml链霉素和10000U青霉素。
4、细胞培养：将骨再生修复材料颗粒10g加至含有105个/ml细胞的0.5L培养液中静置2h，再置于旋转式细胞培养系统，进行动态三维培养，每三天更换培养液，培养6天。
5、真空干燥：将完成培养的骨再生修复材料颗粒用磷酸盐缓冲液清洗，再用真空干燥机干燥20h，γ射线灭菌消毒后，得到复合有人体细胞合成分泌的细胞外基质和细胞生长因子的诱导骨再生修复材料颗粒。采用扫描电镜观察诱导骨再生修复材料的形态，结果见图1-3。
6、使用前将诱导骨再生修复材料颗粒与重组胶原蛋白溶液按重量体积比1：4混合均匀，形成可自固化的骨再生修复材料凝胶，然后通过注射器填充到缺损部位，在体内塑形成缺损部位的形状。
实施例2
1、煅烧骨颗粒的制备
取牛椎骨的松质骨，人工去除表面的结缔组织及其附属组织后，机械加工成粒径10mm大小碎骨块，纯化水搅拌清洗60min；将碎骨块采用辐照剂量为20KGy的钴60辐射灭菌；然后再用将碎骨块置入1g/L胰酶溶液常温下消化72h，纯化水充分搅拌清洗后置于1M的NaOH溶液中超声波清洗2h，每0.5h更换溶液一次，PBS搅拌清洗至中性；再用25％的H2O2溶液处理60min，纯化水+注射用水充分搅拌清洗，37℃干燥箱内直至干燥，机械粉碎至粒径为10mm的颗粒。
将干燥后的碎骨块放入刚玉坩埚中，在马弗炉中煅烧；升温到800℃，继续恒温煅烧4h，将炉内温度降至室温，再次升温到1100℃，恒温煅烧3h后降至室温，取出，使用辊式粉碎机将骨再生修复材料粉碎后用筛网分选出粒径1～2mm的煅烧骨颗粒，即得煅烧骨颗粒。
2、复合重组胶原蛋白：将煅烧骨颗粒置于3mg/ml的重组胶原蛋白溶液中负压抽吸，浸泡4h，再经真空干燥灭菌消毒。
3、细胞培养液的配制：其组分按体积百分比有：75％RPMI-1640培养基、15％胎牛血清、1％双抗(200ml)谷氨酰胺、7mg/ml链霉素和15000U青霉素。
4、细胞培养：将骨再生修复材料颗粒40g加至含有106个/ml细胞的1L培养液中静置2h，再置于旋转式细胞培养系统进行动态三维培养，每三天更换培养液，8天后培养完毕。
5、真空干燥：将完成培养的骨再生修复材料颗粒用磷酸盐缓冲液清洗后，使用真空干燥机干燥24h，γ射线灭菌消毒后，得到复合有人体成骨细胞合成分泌的细胞外基质和细胞生长因子的诱导骨再生修复材料颗粒。
6、使用前将诱导骨再生修复材料颗粒与透明质酸钠溶液按重量体积比1∶3混合均匀，形成可自固化的骨再生修复材料凝胶，然后通过注射器填充到缺损部位，在体内塑形成缺损部位的形状。
实施例3
1、煅烧骨颗粒的制备
取猪股骨骨骺端松质骨，人工去除表面的结缔组织及其附属组织后，机械加工成粒径20mm大小碎骨块，纯化水搅拌清洗45min；将碎骨块装进不锈钢桶，加入3倍量的纯化水，使用高压灭菌锅蒸煮0.5h，再用4倍量的纯化水清洗5次；然后将碎骨块加入2.5g/L胰酶溶液常温下消化92h，纯化水搅拌清洗后置于1M的NaOH溶液中超声波清洗3h，每1h更换溶液一次，PBS超声波清洗至中性；再用35％的H2O2溶液处理70min，纯化水+注射水搅拌清洗，37℃干燥箱内至完全干燥，机械粉碎至粒径为20mm的颗粒。
将干燥后的碎骨块放入刚玉坩埚中，在马弗炉中煅烧；升温到850℃，恒温煅烧4h，将炉内温度降至室温，再次升温到1200℃，恒温煅烧3h后降至室温，取出，使用辊式粉碎机将骨再生修复材料粉碎后用筛网分选出粒径4～5mm的煅烧骨颗粒，即得煅烧骨颗粒。
2、复合重组胶原蛋白和透明质酸钠混合溶液：将煅烧骨颗粒置于15mg/ml的透明质酸钠溶液和3mg/ml的重组胶原蛋白混合溶液中负压抽吸后，浸泡6h，再经常温干燥后灭菌消毒。
3、细胞培养液的配制：其组分按体积百分比有：80％RPMI-1640培养基、8％胎牛血清、2％双抗(200ml)谷氨酰胺、15mg/ml链霉素和10000U青霉素。
4、细胞培养：将骨再生修复材料颗粒80g加至含有106个/ml细胞的2L培养液中静置1h，再置于旋转式细胞培养系统(美国NASA)进行动态三维培养，每三天更换培养液，10天后培养完毕。
5、真空干燥：将培养后的骨再生修复材料颗粒使用磷酸盐缓冲液清洗后，使用真空干燥机干燥20h，γ射线灭菌消毒后，得到复合有人体细胞合成分泌的细胞外基质和细胞生长因子的人源化煅烧骨颗粒。
6、使用前将诱导骨再生修复材料颗粒与重组胶原蛋白溶液和透明质酸钠的混合溶液按重量体积比1：5混合均匀，形成可自固化的骨再生修复材料凝胶，然后通过注射器填充到缺损部位，在体内塑形成缺损部位的形状。
实施例4
选择健康成年雄性杂种犬6只，分为三组，分别在犬两侧下颌骨嚼肌前缘制备2个骨缺损模型，把实施例1制备的诱导骨再生修复材料植入一个骨缺损中，另一个缺损处不植入任何材料作为空白对照，逐层缝合伤口。于术后1个月，3个月和6个月处死动物，测量不同时间点下的骨缺损面积、纤维组织面积以及不同时间点试验区域下测量区域面积、新骨面积和骨修复材料未降解面积，计算出不同时间点下骨缺损修复率、新骨率和骨修复材料存留率，计算公式如下：
骨缺损修复率＝(骨缺损面积-纤维组织面积)/骨缺损面积*100％
新骨率＝(新骨面积/测量区域面积)*100％
骨修复材料存留率＝(未降解区面积/测量区域面积)*100％。
由表1～2试验结果可知，使用本发明制备的诱导再生骨修复材料后，杂种犬骨缺损修复率在3个月达到72.3％，与对照组相比提高了25.3％，新骨生成率3个月达到47.5％，与对照组相比提高了32.3％，诱导骨修复材料3个月时存留率为30.2％，表明该诱导骨再生修复材料具有显著的诱导骨再生能力，且在新骨形成后，该材料逐渐降解。
表1不同时间点的骨缺损修复率(％，X±S)
Figure BDA0003656422780000081
表2不同时间点的新骨率(％，X±S)
Figure BDA0003656422780000082
表3不同时间点骨修复材料的存留率(％，X±S)
Figure BDA0003656422780000083
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种诱导骨再生修复材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：在煅烧骨颗粒表面复合重组胶原蛋白和/或透明质酸钠，然后置于细胞培养液中培养，获得诱导骨再生修复材料。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述煅烧骨颗粒的制备方法如下：取动物的股骨、椎骨、胫骨的松质骨，去除有机质，粉碎成粒径为1～30mm骨块，依次进行灭菌处理、胰酶酶解、氢氧化钠超声波处理、PBS清洗至中性、过氧化氢处理、干燥后粉碎至粒径为0.2～6mm的颗粒、煅烧处理，即得煅烧骨颗粒。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌方式为钴60辐射灭菌、高压灭菌中的任意一种。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述胰酶浓度为0.2～3g/L，所述酶解的时间为24～92h。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述过氧化氢的浓度为10～35％，所述过氧化氢处理时间为30min以上。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述复合重组胶原蛋白和/或透明质酸钠的具体步骤为：将所述煅烧骨颗粒倒入重组胶原蛋白和/或透明质酸钠溶液中，负压抽吸后浸泡1～12h，即复合完成。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞培养液包括如下按体积百分比组分：70～95％RPMI-1640培养基、5～20％胎牛血清、0.3～2.5％双抗(200ml)谷氨酰胺、5～15mg/ml链霉素和8000～15000U青霉素。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述培养的具体步骤为：将复合重组胶原蛋白和/或透明质酸钠的煅烧骨颗粒按不超过4％的重量比加至细胞培养液中静置1～4h，然后动态三维培养，每三天换液，培养4～8天。
9.如权利要求1～8任意一项所述制备方法制备的诱导骨再生修复材料。
10.如权利要求9所述诱导骨再生修复材料在制备修复骨缺损药物中的应用。
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