CN108992708A - 表面改性骨粉及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表面改性骨粉及其制备方法，天然牛松质骨经前处理后，煅烧粉碎获得羟基磷灰石多孔颗粒，在颗粒表面吸附医用生物大分子对表面进行改性，获得表面改性骨粉。该骨粉材料在生物相容性方面优于传统的煅烧骨粉，有利于骨细胞的快速粘附、增殖及新骨的形成，缩短缺损骨的修复时间。本发明生产的骨粉可用于骨组织缺损、骨不连的修复及牙槽填充材料等。

Description

表面改性骨粉及其制备方法

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种表面改性骨粉及其制备方法。

背景技术

自体骨移植和异体骨移植是治疗骨缺损修复的主要方法。自体骨效果较好，但存在来源有限，会引起病人的二次创伤以及手术并发症等弊端。异体骨移植会引起免疫排斥。采用人工材料取代前二者应用于临床是当前骨移植领域的主要方向，也是用于牙周缺损、骨缺损、骨不连等方面修复的重要方法。

目前，骨组织工程采用的骨修复材料较多（如金属材料、生物陶瓷、骨水泥、纳米材料等），但面临的问题包括植入体内难以替代吸收、工艺复杂难以实现生产、含有化学交联剂等有一定毒性的成分而有潜在风险。理想的骨修复材料应该具有引导骨细胞生长的性能，结构上最好与天然骨的多孔结构一致，同时具有良好的生物相容性以及降解性。煅烧骨是去除有机相后剩余的具有天然孔径的骨小梁结构和骨无机晶体结构的生物材料，已经越来越多的应用于骨组织工程领域。天然的多孔结构有利于骨细胞的粘附生长。其主要成分为羟基磷灰石，具有一定的硬度和支撑力，由于去除了有机相，植入人体不会引起免疫排斥反应，生物相容性良好。

虽然煅烧骨作为可替代生物材料具有较大优势，但其经过脱脂脱蛋白以及高温煅烧后，完全去除了有机成分，对骨细胞的粘附和诱导性大大降低。针对这一现状，为了提高煅烧骨的粘附性，本发明制备的骨粉可通过吸附生物大分子来有效地促进骨细胞的粘附和增殖。

发明内容

本发明的目的是提供一种表面改性骨粉及其制备方法，提高煅烧骨的粘附性，可通过吸附生物大分子来有效地促进骨细胞的粘附和增殖。

本发明所采用的技术方案为：

表面改性骨粉的制备方法，其特征在于：

包括以下步骤：

天然牛松质骨经前处理后，煅烧粉碎获得羟基磷灰石多孔颗粒，在颗粒表面吸附医用生物大分子对表面进行改性，获得表面改性骨粉。

天然牛松质骨的前处理，由以下步骤实现：

取牛骨的松质骨部分切成2cm×2cm×2cm大小的骨块，依次经过沸水煮沸、NaOH溶液浸泡、H₂O₂溶液浸泡、超纯水和PBS洗涤至pH值为6.0-7.0，去除骨块上的有机物，然后干燥。

天然牛松质骨的煅烧粉碎，由以下步骤实现：

将骨块放入高温炉中，在450℃-800℃下恒温煅烧4-6h；

接着将煅烧骨块置于500℃-900℃下再次恒温煅烧2-5h后，采用PBS溶液洗涤至pH值为6.5-7.5，干燥；

机械粉碎，采用筛网筛分粒径分别为0.1-0.25、0.25-0.50、0.5-1.0、1.0-2.0 mm的煅烧骨颗粒，即获得不同等级的羟基磷灰石多孔颗粒。

羟基磷灰石多孔颗粒的表面改性，由以下步骤实现：

将羟基磷灰石多孔颗粒放于浓度为10-40 mg/mL的生物大分子溶液中进行负压浸泡吸附，吸附2-4h后，将颗粒在25-45℃烘干。

生物大分子包括透明质酸钠、硫酸软骨素、聚乳酸、粘多糖。

如所述的制备方法制得的表面改性骨粉。

本发明具有以下优点：

本发明所制备的骨粉经X线衍射、扫描电镜观察显示其主要成分为羟基磷灰石，具有完整的三维多孔的松质骨结构，在结构上符合骨缺损修复材料的要求。

通过细胞毒性实验，具体为：将小鼠成纤维细胞（L929）分别用煅烧骨粉的浸提液、表面改性煅烧骨粉的浸提液、培养液培养24h，得到骨颗粒材料浸提液中细胞的增殖率为99.8%，表面改性煅烧骨材料细胞增殖率可达到114%，煅烧骨粉与吸附生物大分子煅烧骨粉的细胞毒性属于0级。实验证实本发明的煅烧骨粉无细胞毒性，且具有良好的生物相容性。

将材料（煅烧骨片、表面改性煅烧骨片）与小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）、SD大鼠颅骨细胞的共培养3d、7d、14d后，采用AO/EB染料进行荧光染色以观察细胞的数量；并通过扫描电子显微镜（SEM）观察细胞在材料上的粘附增长情况。实验结果证实本发明所制备的表面改性煅烧骨材料，更有利于MC3T3-E1、SD大鼠颅骨细胞的粘附生长，是理想的骨替代材料。

本发明制备的骨粉具有良好的机械性能，高温煅烧的无机相吸附医用生物大分子，不引起免疫反应且无热源。SEM结果显示，骨粉保留了天然骨多孔结构及骨小梁，与人体骨结构相似、孔隙相互贯通，有利于骨细胞的粘附生长及营养物质的输送和血管的长入。将MC3T3-E1、SD大鼠颅骨细胞与煅烧骨（煅烧骨片、表面改性煅烧骨片）共培养后，表面改性骨片上有大量的细胞生长，生长形态正常、数量多、与材料的贴附紧密。以上结果证实本发明的骨粉可以用于骨缺损修复，也可以作为骨组织工程的载体使用。

本发明制备的骨粉可用于骨缺损填充，例如适用于牙槽嵴的扩展重建治疗、填充牙周部位的骨缺损、截根术、囊肿切除术术后的缺损充填、填充拔牙窝以保持牙槽嵴形态。也可根据需要，使用可固化的材料塑形成任意形状，用于各种临床需要。

附图说明

图1为本发明煅烧骨片粉碎前的外观形态，可见煅烧骨呈白色多孔状；

图2为本发明煅烧骨50×扫描图片，可见煅烧骨呈多孔结构；

图3为本发明煅烧骨5000×扫描图片，可见煅烧骨晶体结构，A、B、C、D分别为800℃煅烧4h、800℃煅烧6h、700℃煅烧6h以及500℃煅烧6h，粉碎后700℃继续煅烧5h骨粉的晶体结构；

图4为材料浸提液与细胞共培养24h的细胞形态，A、B、C分别是培养液、吸附透明质酸钠骨粉浸提液、骨粉浸提液培养24h的细胞形态；

图5和图6为细胞材料共培养的荧光图片，图5为MC3T3-E1细胞与材料共培养的荧光图，图6为SD大鼠颅骨细胞与材料共培养的荧光图，a₁、a₂、a₃为吸附透明质酸钠骨粉与细胞共培养荧光图，b₁、b₂、b₃为骨粉与细胞共培养荧光图；

图7和图8为细胞材料共培养的扫描电镜图片，图7为MC3T3-E1细胞与材料共培养的扫描图，图8为SD大鼠颅骨细胞与材料共培养的扫描图，a₁、a₂、a₃为吸附透明质酸钠骨粉与细胞共培养扫描图，b₁、b₂、b₃为骨粉与细胞共培养扫描图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

本发明通过多孔煅烧骨材料吸附一定量的生物大分子以进一步提高煅烧骨粉的促细胞粘附与生长能力。所制备的煅烧骨是经过煮沸、碱浸泡、煅烧后，获得的去除有机物的天然牛松质骨颗粒，具有天然骨小梁多孔结构，主要成分为羟基磷灰石晶体，具有三维网状多孔结构，粒径为0.1-2.0 mm，孔径大小分布在50 nm-150 μm之间。煅烧骨颗粒在真空下吸附一定量的生物大分子，相对于未表面改性煅烧骨颗粒，更有利于细胞的粘附生长、新骨的形成，进而促进缺损部位骨组织工程的重建。

所涉及的表面改性骨粉的制备方法，具体包括以下步骤：

天然牛松质骨经前处理后，煅烧粉碎获得羟基磷灰石多孔颗粒，粒径为0.1-2.0 mm，孔径介于50 nm-150 μm，在颗粒表面吸附医用生物大分子对表面进行改性，获得表面改性骨粉。

其中：

天然牛松质骨的前处理，由以下步骤实现：

取牛骨的松质骨部分（一岁龄的牛股骨干骺端）切成2cm×2cm×2cm大小的骨块，超纯水洗涤后，放入锅中反复煮沸8次，煮沸过程中去除骨块上的骨髓、软骨等组织，干燥。将上述骨块置于浓度为0.5 M的NaOH溶液中浸泡6h后，采用质量分数为30%的H₂O₂溶液浸泡6h，以超纯水和PBS（pH介于6.0-7.0之间）洗涤、干燥。通过上述步骤去除了骨块中大部分的有机物。

然后干燥。

天然牛松质骨的煅烧粉碎，由以下步骤实现：

将骨块放入高温炉（马弗炉）中，在450℃-800℃下恒温煅烧4-6h；

接着将煅烧骨块置于500℃-900℃下再次恒温煅烧2-5h后，采用PBS溶液洗涤至pH值为6.5-7.5，干燥；

机械粉碎，采用筛网筛分粒径分别为0.1-0.25、0.25-0.50、0.5-1.0、1.0-2.0 mm的煅烧骨颗粒，即获得不同等级的羟基磷灰石多孔颗粒。实验过程中，发现颗粒在压缩相同体积时，小颗粒所承受的力大，大颗粒小。承受相同力时，颗粒越小体积变化越小，颗粒越大则越大。针对缺损部位的大小以及缺损部位是否所需受力可以选择相应粒径的骨粉。

羟基磷灰石多孔颗粒的表面改性，由以下步骤实现：

将羟基磷灰石多孔颗粒放于浓度为10-40 mg/mL的生物大分子溶液中进行负压浸泡吸附，吸附2-4h后，将颗粒在25-45℃烘干。

生物大分子包括透明质酸钠、硫酸软骨素、聚乳酸、粘多糖。

实施例1

煅烧骨的前处理：选取一岁龄的牛股骨干骺端，切成2 cm×2 cm×2 cm大小的骨块，超纯水洗涤后，放入锅中反复煮沸8次，煮沸过程中去除骨块上的骨髓、软骨等组织，干燥。将上述骨块置于0.5 M的NaOH中浸泡6h后，采用30%的H₂O₂浸泡6h，以超纯水和PBS（pH介于6.0-7.0之间）洗涤、干燥。通过上述步骤去除了骨块中大部分的有机物。

实施例2

煅烧骨粉的制备与医用生物大分子的吸附：将制备好的牛骨块放入马弗炉里进行高温煅烧，煅烧工艺为700℃煅烧4h，700℃二次煅烧3h，PBS洗涤至pH值为6.5-7.5，粉碎机粉碎颗粒大小为0.1-0.25 mm后将该骨颗粒置于20 mg/mL的透明质酸钠溶液中进行负压吸附2h，于37℃烘干。

实施例3

煅烧骨粉的制备与医用生物大分子的吸附：将制备好的牛骨块放入马弗炉里进行高温煅烧，煅烧工艺为800℃煅烧3h，600℃二次煅烧5h，PBS洗涤至pH值为6.5-7.5，粉碎机粉碎颗粒大小为0.25-0.50 mm后将该骨颗粒置于30 mg/mL的透明质酸钠溶液中进行负压吸附2h，于37℃烘干。

实施例4

煅烧骨粉的制备与医用生物大分子的吸附：将制备好的牛骨块放入马弗炉里进行高温煅烧，煅烧工艺为500℃煅烧6h，500℃二次煅烧5h，PBS洗涤至pH值为6.5-7.5，粉碎机粉碎颗粒大小为0.50-1.0 mm后将该骨颗粒置于20 mg/mL的透明质酸钠溶液中进行负压吸附4h，于37℃烘干。

以下为通过本发明获得的煅烧骨粉的性能测试：

1、煅烧骨粉扫描电镜观察：

电镜型号：Carl Zeiss SIGMA

扫描电镜结果显示（见附图2），采用两次煅烧获得的骨块主要成分为羟基磷灰石，具有天然的三维交通的松质骨结构。煅烧的骨粉可进行后续的透明质酸钠的吸附。

2、煅烧骨粉的细胞毒性实验：

以培养液浸提骨粉（样品1）、吸附透明质酸钠的骨粉（样品2）24h，调整第二代的L929细胞密度为1×10⁵个/mL，每孔接种100 μL细胞悬液至96孔培养板中，并置于CO₂培养箱中。细胞孵育24h后，弃去原培养液，每孔加入100 μL的骨粉浸提液、吸附透明质酸钠骨粉的浸提液以及培养液（空白对照），每个样品4个平行。24h接触培养后，小心移除培养液，将50 μLMTT溶液加入到每一试验孔中，并在37℃下孵育2h，弃去MTT溶液，每孔加入100 μL DMSO溶液。振荡孔板，利用酶标仪在570 nm处测定吸光度。

表1结果表明，骨粉浸提液中细胞增殖率为99.8%，细胞毒性属于一级；吸附透明质酸钠的骨粉浸提液中细胞增殖率为114%，细胞毒性属于0级。从附图4中可以观察，细胞在骨粉浸提液、吸附透明质酸钠骨粉浸提液中培养24h后的细胞形态与空白对照相比，没有差异。骨粉、吸附透明质酸钠的骨粉均为安全的生物材料，而且吸附透明质酸钠的骨粉更能够有效地促进细胞的生长。

3、MC3T3-E1、SD大鼠颅骨细胞与煅烧骨共培养实验：

分别将煅烧骨块、吸附透明质酸钠的煅烧骨材料切成直径10 mm，厚5 mm的圆片状，放入48孔培养板中，Co₆₀照射灭菌，在每孔内加入1 mL MEM培养液，放置于CO₂培养箱内，24h后吸出培养液。调整长势良好的MC3T3-E1或SD大鼠颅骨细胞的二代细胞浓度为1×10⁵个/mL，吸取50 µL细胞悬浮液加在培养板孔中的样品材料表面后，将48孔板置于CO₂培养箱中培养3h后，补加1 mL培养液继续培养，每天换液。

细胞与材料在48孔板里共培养3d、7d、14d后用AO/EB染料进行细胞染色后，在荧光显微镜下观察细胞的生长情况（见附图5）。为进一步观察材料与细胞共培养，将培养3d、7d、14d的细胞支架材料复合物通过戊二醛固定过夜，采用梯度乙醇脱水、干燥。以扫描电镜观察细胞的粘附、增殖以及形态变化（见附图6）。

细胞荧光图显示：细胞与材料培养3d后，有较多的细胞粘附在支架上，形态正常；7d后，细胞呈层状聚集在材料的孔边缘以及孔内；14d后，孔内、孔边缘可以看到大量的细胞。吸附透明质酸钠的骨块中细胞数量明显多于未吸附透明质酸钠的骨块。细胞与材料共培养的SEM图也与此实验结果一致（见附图6）。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

Claims (6)

1.表面改性骨粉的制备方法，其特征在于：

包括以下步骤：

天然牛松质骨经前处理后，煅烧粉碎获得羟基磷灰石多孔颗粒，在颗粒表面吸附医用生物大分子对表面进行改性，获得表面改性骨粉。

2.根据权利要求1所述的表面改性骨粉的制备方法，其特征在于：

天然牛松质骨的前处理，由以下步骤实现：

取牛骨的松质骨部分切成2cm×2cm×2cm大小的骨块，依次经过沸水煮沸、NaOH溶液浸泡、H₂O₂溶液浸泡、超纯水和PBS洗涤至pH值为6.0-7.0，去除骨块上的有机物，然后干燥。

3.根据权利要求1所述的表面改性骨粉的制备方法，其特征在于：

天然牛松质骨的煅烧粉碎，由以下步骤实现：

将骨块放入高温炉中，在450℃-800℃下恒温煅烧4-6h；

接着将煅烧骨块置于500℃-900℃下再次恒温煅烧2-5h后，采用PBS溶液洗涤至pH值为6.5-7.5，干燥；

机械粉碎，采用筛网筛分粒径分别为0.1-0.25、0.25-0.50、0.5-1.0、1.0-2.0 mm的煅烧骨颗粒，即获得不同等级的羟基磷灰石多孔颗粒。

4.根据权利要求1所述的表面改性骨粉的制备方法，其特征在于：

羟基磷灰石多孔颗粒的表面改性，由以下步骤实现：

将羟基磷灰石多孔颗粒放于浓度为10-40 mg/mL的生物大分子溶液中进行负压浸泡吸附，吸附2-4h后，将颗粒在25-45℃烘干。

5.根据权利要求4所述的表面改性骨粉的制备方法，其特征在于：

生物大分子包括透明质酸钠、硫酸软骨素、聚乳酸、粘多糖。

6.如权利要求1所述的制备方法制得的表面改性骨粉。