CN111921014A - 一种地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料 - Google Patents

一种地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料 Download PDF

Info

Publication number
CN111921014A
CN111921014A CN202010917764.2A CN202010917764A CN111921014A CN 111921014 A CN111921014 A CN 111921014A CN 202010917764 A CN202010917764 A CN 202010917764A CN 111921014 A CN111921014 A CN 111921014A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bone
polysaccharide
rehmannia
calcined
radix rehmanniae
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010917764.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111921014B (zh
Inventor
徐钢
赵彦涛
李忠海
张博程
杨明
曲巍
张卫国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of Dalian Medical University
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Dalian Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of Dalian Medical University filed Critical First Affiliated Hospital of Dalian Medical University
Priority to CN202010917764.2A priority Critical patent/CN111921014B/zh
Publication of CN111921014A publication Critical patent/CN111921014A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111921014B publication Critical patent/CN111921014B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3608—Bone, e.g. demineralised bone matrix [DBM], bone powder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/20—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3645—Connective tissue
    • A61L27/365—Bones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/23—Carbohydrates
    • A61L2300/232—Monosaccharides, disaccharides, polysaccharides, lipopolysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Abstract

本发明实施例公开了一种地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料，属于医用材料技术领域。该材料由异种锻烧骨支架材料与地黄多糖溶液复合而成。本发明的地黄多糖具有优异的促成骨作用，与异种锻烧骨支架材料进行复合后，在不影响细胞活性的前提下，能够增强异种锻烧骨的骨诱导活性，达到促进骨形成和骨缺损修复的目的。本发明的骨修复材料的促进骨生长活性和骨缺损修复活性接近自体骨，且生产工艺操作简单，关键技术易控制，生产成本较低，为临床提供更优质的骨修复方案。

Description

一种地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料
技术领域
本发明实施例涉及医用材料技术领域，具体涉及一种地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料。
背景技术
临床上常见如高能量外伤、骨肿瘤切除等各种原因所致大块骨缺损，通常无法自行愈合，是临床亟待解决的棘手难题。自体骨移植凭借其优异的骨诱导、骨传导和成骨能力以及无免疫原性、无细胞毒性和组织相容性较好等优点而成为骨缺损修复的金标准，但是自体骨存在供区疼痛和局部并发症如血肿、骨折、感染以及术后瘢痕增生的潜在发生以及数量有限等缺点，其临床应用仍然受限。相比之下，与之性能相似的异体骨却不存在供区并发症等问题，但也存在如传播疾病，排斥反应、骨不愈合、移植物吸收和骨折及供体缺乏等问题。为了应对上述问题，异种骨似乎是一种可靠的选择。与自体骨和异体骨相比，异种骨亦具备一定的力学强度和骨诱导性能，且来源充足，安全性可靠，可以依靠物理或化学的手段消除或降低免疫原性。常见的异种骨为煅烧骨，异种锻烧骨是由新鲜牛松质骨经高温二次烧结而成，是一种磷酸钙系天然生物支架材料，其结晶特征与人工羟基磷灰石相似。异种锻烧骨的孔隙率高，这种多孔结构有助于增加表面积并帮助细胞因子释放到细胞附近，多孔结构还为新骨的生长提供了空间并加速成骨细胞的生长，其降解产生的钙和磷酸离子还可为新骨形成提供基础。与人工合成的羟基磷灰石相比，用异种锻烧骨培养的成骨细胞表现出更高的碱性磷酸酶活性。异种锻烧骨具备优良的生物相容性和骨传导能力，却也存在骨诱导活性不足的问题，解决该问题将有助于更好的促进骨缺损的修复。
2015版《中国药典》记载，地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜或干燥块根。作为中医常用药，其广见于中成药及临床调剂处方中，多用以防治骨质疏松症，已有千年的用药经验，效果显著。临床常用治疗骨质疏松的中成药如骨疏康胶囊、仙灵骨葆胶囊、六味地黄丸、左归丸、右归丸、金匮肾气丸、知柏地黄丸等组方中均含有地黄，可见组方中地黄抗骨质疏松作用的重要性。地黄的主要活性成分之一为地黄多糖，体外可诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化，具有一定的骨诱导活性。另外，熟地黄水煎液提取物可调节糖尿病性骨质疏松大鼠的骨形成。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料，使用的地黄多糖由生地黄多糖和熟地黄多糖按照一定配比混合而成，具有优异的促成骨效果，与异种煅烧骨复合能够有效解决现有异种煅烧骨存在的骨诱导活性不足的问题。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
根据本发明实施例的第一方面，本发明实施例提供一种地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料，由异种锻烧骨支架材料与地黄多糖溶液复合而成。
进一步地，所述异种锻烧骨支架材料的制备方法包括：
取成牛的双侧股骨，将其股骨骺端松质骨部分锯下，剥离附着于骨周围的其他组织，随后用切割机将其切成3-6×3-6×3-6mm的骨块并冲洗；将冲洗后的骨块浸泡在0.5mol/L NaOH溶液中1-3h，纯化水超声清洗3遍，每遍5-15min，随后将骨块浸入3％H2O2溶液15-45min，纯化水超声清洗3遍，每遍5-15min；将处理后的骨块放入沸水中，煮沸1-2h以除去部分蛋白质和脂质，待骨块冷却后烘干过夜，将干燥的骨块放入马弗炉中进行煅烧，控制温度缓慢升温至770℃，温度达770℃后煅烧2-4h；待骨块自然冷却后，研磨打粉，用筛网筛选出粒径在250-1000μm的骨粉装入塑封袋中，经25kGy60Co辐照灭菌后保存于4℃冰箱待用。
进一步地，所述地黄多糖溶液的制备方法包括：
取生地黄，粉碎，过60-100目筛，得生地黄粉，按料液比(g/ml)1：10-40加入蒸馏水，加热回流提取2-4次，每次1-4h，合并上清液，减压浓缩至膏状，在搅拌条件下，加入乙醇，直至乙醇的最终浓度达到60-90％，静置12h，抽滤取沉淀，冷冻干燥12h，即得生地黄多糖；
取生地黄，蒸至黑润，60-80℃烘干，粉碎，过60-100目筛，得熟地黄粉，按料液比(g/ml)1：10-40加入蒸馏水，加热回流提取2-4次，每次1-4h，合并上清液，减压浓缩至膏状，在搅拌条件下，加入乙醇，直至乙醇的最终浓度达到60-90％，静置12h，抽滤取沉淀，冷冻干燥12h，即得熟地黄多糖；
取30-70％重量百分含量的生地黄多糖和30-70％重量百分含量的熟地黄多糖混合，加入8～20倍量的清水，搅匀即得。
进一步地，所述异种锻烧骨支架材料与地黄多糖溶液的复合包括：
将异种煅烧骨支架材料置于地黄多糖溶液中浸泡24-48h，然后-40℃真空冷冻干燥36-72h进行自组装，即得地黄多糖和异种锻烧骨复合骨修复材料。
进一步地，所述异种锻烧骨支架材料与地黄多糖溶液的质量比为1：50-500。
根据本发明实施例的第二方面，本发明实施例提供上述的地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料在制备骨缺损修补材料中的用途。
本发明实施例具有如下优点：
1、本发明的地黄多糖具有优异的促成骨作用，与异种锻烧骨支架材料进行复合后，在不影响细胞活性的前提下，能够增强异种锻烧骨的骨诱导活性，达到促进骨形成和骨缺损修复的目的。
2、本发明的骨修复材料的促进骨生长活性和骨缺损修复活性接近自体骨，且生产工艺操作简单，关键技术易控制，生产成本较低，为临床提供更优质的骨修复方案。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明提供的细胞活性测试；
图2为本发明提供的骨诱导活性HE染色；
图3为本发明提供的骨诱导活性评分；
图4为本发明提供的病理切片骨钙素染色显示骨修复材料的成骨能力；
图5为本发明提供的micro-CT的骨体积分数BV/TV显示骨修复材料的骨缺损修复能力。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料：
1、异种锻烧骨支架材料的制备
取成牛的双侧股骨，将其股骨骺端松质骨部分锯下，剥离附着于骨周围的其他组织，随后用切割机将其切成4×4×4mm的骨块并冲洗；将冲洗后的骨块浸泡在0.5mol/LNaOH溶液中1h，纯化水超声清洗3遍，每遍8min，随后将骨块浸入3％H2O2溶液20min，纯化水超声清洗3遍，每遍8min；将处理后的骨块放入沸水中，煮沸1h以除去部分蛋白质和脂质，待骨块冷却后烘干过夜，将干燥的骨块放入马弗炉中进行煅烧，控制温度缓慢升温至770℃，温度达770℃后煅烧2h；待骨块自然冷却后，研磨打粉，用筛网筛选出粒径在300-600μm的骨粉装入塑封袋中，经25kGy60Co辐照灭菌后保存于4℃冰箱待用。
2、地黄多糖溶液的制备
取生地黄，粉碎，过80目筛，得生地黄粉，按料液比(g/ml)1：30加入蒸馏水，加热回流提取3次，每次2h，合并上清液，减压浓缩至膏状，在搅拌条件下，加入乙醇，直至乙醇的最终浓度达到80％，静置12h，抽滤取沉淀，冷冻干燥12h，即得生地黄多糖；
取生地黄，蒸至黑润，60℃烘干，粉碎，过80目筛，得熟地黄粉，按料液比(g/ml)1：30加入蒸馏水加热，加热回流提取3次，每次2h，合并上清液，减压浓缩至膏状，在搅拌条件下，加入乙醇，直至乙醇的最终浓度达到70％，静置12h，抽滤取沉淀，冷冻干燥12h，即得熟地黄多糖；
上述生地黄多糖和熟地黄多糖按照重量比2:3混合，加入10倍量的清水，搅匀即得。
3、异种锻烧骨支架材料与地黄多糖溶液的复合
异种锻烧骨支架材料与地黄多糖溶液按质量比1：100备料，将异种煅烧骨支架材料置于地黄多糖溶液中浸泡24h，然后-40℃真空冷冻干燥36h进行自组装，即得地黄多糖和异种锻烧骨复合骨修复材料。
实施例2
本实施例的地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料：
1、异种锻烧骨支架材料的制备
取成牛的双侧股骨，将其股骨骺端松质骨部分锯下，剥离附着于骨周围的其他组织，随后用切割机将其切成5×5×5mm的骨块并冲洗；将冲洗后的骨块浸泡在0.5mol/LNaOH溶液中3h，纯化水超声清洗3遍，每遍10min，随后将骨块浸入3％H2O2溶液25min，纯化水超声清洗3遍，每遍10min；将处理后的骨块放入沸水中，煮沸1.5h以除去部分蛋白质和脂质，待骨块冷却后烘干过夜，将干燥的骨块放入马弗炉中进行煅烧，控制温度缓慢升温至770℃，温度达770℃后煅烧3h；待骨块自然冷却后，研磨打粉，用筛网筛选出粒径在400-800μm的骨粉装入塑封袋中，经25kGy60Co辐照灭菌后保存于4℃冰箱待用。
2、地黄多糖溶液的制备
取生地黄，粉碎，过100目筛，得生地黄粉，按料液比(g/ml)1：40加入蒸馏水，加热回流提取2次，每次4h，合并上清液，减压浓缩至膏状，在搅拌条件下，加入乙醇，直至最终乙醇浓度达到80％，静置12h，抽滤取沉淀，冷冻干燥12h，即得生地黄多糖；
取生地黄，蒸至黑润，70℃烘干，粉碎，过100目筛，得熟地黄粉，按料液比(g/ml)1：20加入蒸馏水，加热回流提取2次，每次2h，合并上清液，减压浓缩至膏状，在搅拌条件下，加入乙醇，直至乙醇的最终浓度达到80％，静置12h，抽滤取沉淀，冷冻干燥12h，即得熟地黄多糖；
上述生地黄多糖和熟地黄多糖按照重量比1:1混合，加入10倍量的清水，搅匀即得。
3、异种锻烧骨支架材料与地黄多糖溶液的复合
异种锻烧骨支架材料与地黄多糖溶液按质量比1：300备料，将异种煅烧骨支架材料置于地黄多糖溶液中浸泡36h，然后-40℃真空冷冻干燥48h进行自组装，即得地黄多糖和异种锻烧骨复合骨修复材料。
实施例3
本实施例的地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料：
1、异种锻烧骨支架材料的制备
取成牛的双侧股骨，将其股骨骺端松质骨部分锯下，剥离附着于骨周围的其他组织，随后用切割机将其切成6×6×6mm的骨块并冲洗；将冲洗后的骨块浸泡在0.5mol/LNaOH溶液中3h，纯化水超声清洗3遍，每遍15min，随后将骨块浸入3％H2O2溶液45min，纯化水超声清洗3遍，每遍15min；将处理后的骨块放入沸水中，煮沸2h以除去部分蛋白质和脂质，待骨块冷却后烘干过夜，将干燥的骨块放入马弗炉中进行煅烧，控制温度缓慢升温至770℃，温度达770℃后煅烧4h；待骨块自然冷却后，研磨打粉，用筛网筛选出粒径在600-1000μm的骨粉装入塑封袋中，经25kGy60Co辐照灭菌后保存于4℃冰箱待用。
2、地黄多糖溶液的制备
取生地黄，粉碎，过80目筛，得生地黄粉，按料液比(g/ml)1：20加入蒸馏水，加热回流提取3次，每次2h，合并上清液，减压浓缩至膏状，在搅拌条件下，加入乙醇，直至最终乙醇浓度达到80％，静置12h，抽滤取沉淀，冷冻干燥12h，即得生地黄多糖；
取生地黄，蒸至黑润，60℃烘干，粉碎，过60目筛，得熟地黄粉，按料液比(g/ml)1：40加入蒸馏水，加热回流提取3次，每次2h，合并上清液，减压浓缩至膏状，在搅拌条件下，加入乙醇，直至乙醇的最终浓度达到70％，静置12h，抽滤取沉淀，冷冻干燥12h，即得熟地黄多糖；
上述生地黄多糖和熟地黄多糖按照重量比3:2混合，加入10倍量的清水，搅匀即得。
3、异种锻烧骨支架材料与地黄多糖溶液的复合
异种锻烧骨支架材料与地黄多糖溶液按质量比1：500备料，将异种煅烧骨支架材料置于地黄多糖溶液中浸泡48h，然后-40℃真空冷冻干燥72h进行自组装，即得地黄多糖和异种锻烧骨复合骨修复材料。
对比例1
本对比例为自体骨，以实验过程中同时获取自身头盖骨进行自体骨移植修复，以观察骨诱导活性和骨修复效果。具体地，用于测试例1的自体骨来源于同一幼鼠的部分头盖骨，用于测试例2或3的自体骨来源于小鼠或大鼠模型本身的头盖骨。
对比例2
本对比例为异种锻烧骨，其制备方法同实施例1记载的内容。
测试例1
细胞活性检测
利用浸提液方法对实施例1-3和对比例1-2的骨修复材料进行细胞活性实验评价。
体外实验采用原代培养小鼠成骨细胞(取幼鼠部分头盖骨，剪碎为1-2mm2小块，0.25％胰酶和0.1％Ⅰ型胶原蛋白酶消化，100目筛网滤过，稳定传代三代的细胞)为研究对象，细胞加入含10％胎牛血清的α-MEM培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中培养。细胞生长至80％融合时，用0.25％的胰蛋白酶消化传代。将骨修复材料放置于24孔培养板中，用60Co照射灭菌后，置于培养基中孵育24h。每孔接种104个细胞，每组3孔。空白对照组不放置材料。培养箱中培养2天后，取出培养板，用CCK-8法检测细胞活性。弃去原培养基，每孔加入100μl新鲜培养基，然后加入10μl的CCK-8溶液。培养箱中培养4h，450nm波长下检测吸光度，计算细胞活性，计算公式：细胞活性＝(A骨材料组-A空白对照组)/A空白对照组。
实验结果如图1所示，实施例1-3的骨修复材料的细胞活性与对比例1的自体骨和对比例2的异种煅烧骨均无显著性差异，说明本发明实施例的骨修复材料无细胞毒性。
测试例2
骨诱导活性试验
以昆明种裸小鼠为体内实验对象。随机分为试验组1-3和对照组1-2，每组10只。用1％戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射进行麻醉，在每组小鼠腿部肌间隙分别植入实施例1-3和对比例1-2的骨修复材料0.1g。术后4周按照伦理学要求处死小鼠，取材，用4％多聚甲醛固定，经过脱水、包埋、切片等过程，制成标本切片，HE染色观察组织学反应并进行骨诱导评分，分为五档，分值：0-6分，“0”分：当观察到切片上没有骨修复材料或新的组织出现并且新生骨形成面积百分比为0；“1”分：当观察到骨修复材料但新生骨形成面积百分比为1-10％；“2”分：当观察到有软骨细胞、成骨细胞或单个小骨片且新生骨形成面积百分比为11-30％；“4”分：当观察到有软骨基质形成或更多的小骨片出现且新生骨形成面积百分比为31-50％；“6”分：当在切片上观察到新生骨片覆盖达50％且新生骨形成面积百分比为50％以上。新生骨形成面积百分比：将显微镜200倍视野下采集图像，导入多功能真彩色细胞图像分析管理系统，通过Image-Pro Plus计算机图像分析系统观察，分别计算每一视野中新骨所占面积百分比取均值即得到实验结果。由对实验组别不清楚的实验人员观察并对各组实验结果进行半定量分析。
各组小鼠的骨诱导活性HE染色和骨诱导活性评分结果如图2和3所示，对照组1和试验组1-3小鼠的骨组织排列相对于对照组2更加密实。试验组1-3的骨诱导活性显著高于对照组2，且接近于对照组1，说明本发明实施例的复合骨修复材料的骨诱导活性明显优于未复合的异种骨骨修复材料，且骨诱导活性接近于自体骨。
测试例3
骨缺损模型修复试验
选取成年雄性SD大鼠50只，体重300±50g，随机分为试验组1-3和对照1-2，每组10只。3％戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，取俯卧位，颅顶处备皮，碘伏消毒。颅顶中线处开一条2cm左右的切口，分离骨膜，用取骨环钻于矢状缝左右各打一个直径5mm的缺损。将实施例1-3和对比例1-2的复合修复材料分别植入各组小鼠的缺损中，缝合骨膜及皮肤。术后肌注青霉素8万单位，连注3天，常规饲养。术中严格无菌操作，缺损均有同一组人员完成。术后观察动物伤口处是否有肿胀、发红、无渗出等不良反应。术后8周，骨钙素免疫组化染色观察成骨效果，micro-CT检测骨体积分数BV/TV评价骨缺损修复效果。
免疫组化：免疫组化检测骨钙素的表达变化。简而言之，4％多聚甲醛固定组织样本，包埋和切片，石蜡切片脱蜡至水，3％双氧水室温孵育，蒸馏水冲洗后PBS液浸泡2次，每次5min，封闭，滴加一抗工作液孵育过夜，清洗后，滴加二抗工作液，孵育30min，再清洗，滴加显色剂后冲洗，复染，脱水，透明，封片，观察。
micro-CT的检测：使用Micro-CT(Inveon MM CT)扫描各组小鼠头盖骨，定量分析骨体积分数BV/TV，评价骨缺损修复效果。扫描时条件参数为：电压80kV，电流500uA，扫描软件选用Inveon Acquisition Workplace，利用Inveon Research Workplace分析软件进行定量分析，所选取的感兴趣区域范围：直径6mm，深度5-8mm。
各组小鼠病理切片骨钙素染色结果如图4所示，病理切片的骨钙素染色结果显示试验组1-3的成骨效果明显优于对照组2，比对照组1的成骨效果稍差或相当，说明本发明实施例的骨修复材料的成骨能力明显优于异种煅烧骨，且接近于自体骨。
各组小鼠micro-CT的骨体积分数BV/TV结果如图5所示，对照组1的生骨比例为50％左右，对照组2的新生骨比例为15％左右，试验组1-3的新生骨比例为45％左右，说明本发明实施例的骨修复材料的骨缺损修复能力明显优于异种煅烧骨，且接近于自体骨。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料，其特征在于，由异种锻烧骨支架材料与地黄多糖溶液复合而成。
2.根据权利要求1所述的地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料，其特征在于，所述异种锻烧骨支架材料的制备方法包括：
取成牛的双侧股骨，将其股骨骺端松质骨部分锯下，剥离附着于骨周围的其他组织，随后用切割机将其切成3-6×3-6×3-6mm的骨块并冲洗；将冲洗后的骨块浸泡在0.5mol/LNaOH溶液中1-3h，纯化水超声清洗3遍，每遍5-15min，随后将骨块浸入3％H2O2溶液15-45min，纯化水超声清洗3遍，每遍5-15min；将处理后的骨块放入沸水中，煮沸1-2h以除去部分蛋白质和脂质，待骨块冷却后烘干过夜，将干燥的骨块放入马弗炉中进行煅烧，控制温度缓慢升温至770℃，温度达770℃后煅烧2-4h；待骨块自然冷却后，研磨打粉，用筛网筛选出粒径在250-1000μm的骨粉装入塑封袋中，经25kGy60Co辐照灭菌后保存于4℃冰箱待用。
3.根据权利要求1所述的地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料，其特征在于，所述地黄多糖溶液的制备方法包括：
取生地黄，粉碎，过60-100目筛，得生地黄粉，按料液比(g/ml)1：10-40加入蒸馏水，加热回流提取2-4次，每次1-4h，合并上清液，减压浓缩至膏状，在搅拌条件下，加入乙醇，直至乙醇的最终浓度达到60-90％，静置12h，抽滤取沉淀，冷冻干燥12h，即得生地黄多糖；
取生地黄，蒸至黑润，60-80℃烘干，粉碎，过60-100目筛，得熟地黄粉，按料液比(g/ml)1：10-40加入蒸馏水，加热回流提取2-4次，每次1-4h，合并上清液，减压浓缩至膏状，在搅拌条件下，加入乙醇，直至乙醇的最终浓度达到60-90％，静置12h，抽滤取沉淀，冷冻干燥12h，即得熟地黄多糖；
取30-70％重量百分含量的生地黄多糖和30-70％重量百分含量的熟地黄多糖混合，加入8～20倍量的清水，搅匀即得。
4.根据权利要求1所述的地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料，其特征在于，所述异种锻烧骨支架材料与地黄多糖溶液的复合包括：
将异种煅烧骨支架材料置于地黄多糖溶液中浸泡24-48h，然后-40℃真空冷冻干燥36-72h进行自组装，即得地黄多糖和异种锻烧骨复合骨修复材料。
5.根据权利要求1所述的地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料，其特征在于，所述异种锻烧骨支架材料与地黄多糖溶液的质量比为1：50-500。
6.权利要求1所述地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料在制备骨缺损修补材料中的用途。
CN202010917764.2A 2020-09-03 2020-09-03 一种地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料 Active CN111921014B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010917764.2A CN111921014B (zh) 2020-09-03 2020-09-03 一种地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010917764.2A CN111921014B (zh) 2020-09-03 2020-09-03 一种地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111921014A true CN111921014A (zh) 2020-11-13
CN111921014B CN111921014B (zh) 2023-04-07

Family

ID=73309139

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010917764.2A Active CN111921014B (zh) 2020-09-03 2020-09-03 一种地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111921014B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114344562A (zh) * 2022-01-13 2022-04-15 吉林大学第一医院 一种仿骨小梁结构钛合金支架的生物活性改善方法和应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009117938A1 (zh) * 2008-03-25 2009-10-01 深圳力瑞医药科技有限公司 一种具有抗疲劳等作用的药物组合物及其制备方法和用途
CN101991838A (zh) * 2010-11-02 2011-03-30 李永胜 抗骨质增生、风湿、类风湿、椎间盘突出的组合药
CN102274546A (zh) * 2011-07-11 2011-12-14 佳木斯大学 一种天然骨修复材料的制备方法
CN105249463A (zh) * 2015-11-19 2016-01-20 哈尔滨圣吉药业股份有限公司 一种具有增强骨密度功能的保健食品及其生产方法
CN107158465A (zh) * 2017-06-29 2017-09-15 西北民族大学 一种骨支架复合材料的制备方法
CN107441230A (zh) * 2017-08-22 2017-12-08 张涛 一种熟地黄饮片的炮制方法
CN107469151A (zh) * 2017-08-09 2017-12-15 青岛慧生惠众生物科技有限公司 一种牙槽骨修复材料及其制备方法和应用
CN108992708A (zh) * 2018-07-02 2018-12-14 西安巨子生物基因技术股份有限公司 表面改性骨粉及其制备方法
CN109674915A (zh) * 2019-03-04 2019-04-26 河南中医药大学第一附属医院 一种治疗骨性关节炎的中药及其制备方法
CN109954167A (zh) * 2019-02-28 2019-07-02 天新福（北京）医疗器材股份有限公司 一种骨修复材料及其应用

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009117938A1 (zh) * 2008-03-25 2009-10-01 深圳力瑞医药科技有限公司 一种具有抗疲劳等作用的药物组合物及其制备方法和用途
CN101991838A (zh) * 2010-11-02 2011-03-30 李永胜 抗骨质增生、风湿、类风湿、椎间盘突出的组合药
CN102274546A (zh) * 2011-07-11 2011-12-14 佳木斯大学 一种天然骨修复材料的制备方法
CN105249463A (zh) * 2015-11-19 2016-01-20 哈尔滨圣吉药业股份有限公司 一种具有增强骨密度功能的保健食品及其生产方法
CN107158465A (zh) * 2017-06-29 2017-09-15 西北民族大学 一种骨支架复合材料的制备方法
CN107469151A (zh) * 2017-08-09 2017-12-15 青岛慧生惠众生物科技有限公司 一种牙槽骨修复材料及其制备方法和应用
CN107441230A (zh) * 2017-08-22 2017-12-08 张涛 一种熟地黄饮片的炮制方法
CN108992708A (zh) * 2018-07-02 2018-12-14 西安巨子生物基因技术股份有限公司 表面改性骨粉及其制备方法
CN109954167A (zh) * 2019-02-28 2019-07-02 天新福（北京）医疗器材股份有限公司 一种骨修复材料及其应用
CN109674915A (zh) * 2019-03-04 2019-04-26 河南中医药大学第一附属医院 一种治疗骨性关节炎的中药及其制备方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OU LI等: "Therapeutic efficacy of Rehmannia glutinosa polysaccharides in the healing of animal osteoporotic fractures", 《BIOLETIN DE MALARIOLOGIA Y SALUD AMBIENTAL》 *
孙娜等: "中药地黄防治骨质疏松症的研究进展", 《中国中药杂志》 *
李建军: "地黄药用研究概述" *
李红伟: "地黄化学成分及其药理作用研究进展" *
杨春瑜等: "超微牛煅烧骨的制备、表征和生物相容性评价", 《食品工业科技》 *
赖满香: "地黄多糖对SD大鼠骨髓间充质干细胞骨向诱导的实验研究", 《广州医科大学学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114344562A (zh) * 2022-01-13 2022-04-15 吉林大学第一医院 一种仿骨小梁结构钛合金支架的生物活性改善方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111921014B (zh) 2023-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Viateau et al. Long‐bone critical‐size defects treated with tissue‐engineered grafts: A study on sheep
CN101020082B (zh) 一种骨修复材料及其制备方法和用途
CN104307045B (zh) 一种天然组织来源的脱细胞骨膜材料的制备方法
Wang et al. Hybrid composites of mesenchymal stem cell sheets, hydroxyapatite, and platelet‑rich fibrin granules for bone regeneration in a rabbit calvarial critical‑size defect model
Fenelon et al. Assessment of fresh and preserved amniotic membrane for guided bone regeneration in mice
CN1846789A (zh) 一种注射型骨修复材料及其制备与应用
CN1668732A (zh) 用自体同源的成纤维细胞治疗
CN1846790A (zh) 一种注射型组织工程骨及其构建与应用
CN112587729B (zh) 一种骨修复材料
Zhou et al. In vivo efficacy of bone marrow stromal cells coated with beta-tricalcium phosphate for the reconstruction of orbital defects in canines
Chen et al. Multi-level customized 3D printing for autogenous implants in skull tissue engineering
CN114949360A (zh) 一种可注射型骨诱导修复材料及其制备方法
CN113749825B (zh) 一种框架式骨关节假体及其制备方法和应用
CN111921014B (zh) 一种地黄多糖/异种煅烧骨复合骨修复材料
EP4023267A1 (en) Foraminifera-derived bone graft material
US10994050B2 (en) High yield and high precision bone graft substitute from stem cells
CN112618798B (zh) 一种骨修复材料的制备方法
CN110732040A (zh) 一种骨修复材料、方法及用途
RU86455U1 (ru) Биоинженерная конструкция
CN108355167A (zh) 一种缓释sdf-1的壳聚糖包被bcbb骨修复支架材料及其制备方法
CN107213517B (zh) 一种复合骨水泥及其制备方法
CN205235020U (zh) 淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片
Yadav et al. Evaluation of use of platelet rich plasma (PRP) with decellularized caprine aortal xenograft for healing of critical size bone defects in New Zealand white rabbits
CN110946677A (zh) 一种3d打印复合磁性煅自然铜支架的制备方法及其应用
Zhao et al. Irregular bone defect repair via tissue-engineered periosteum approach in rabbit model.

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant