CN114949360A - 一种可注射型骨诱导修复材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可注射型骨诱导修复材料及其制备方法，属于生物医用材料技术领域，具体包括以下步骤：步骤S1、将生物骨进行矿物化处理，得到生物骨来源的矿物质，将生物骨来源的矿物质进行粉碎处理，得到复合型无机矿化颗粒；步骤S2、将活性因子与复合型无机矿化颗粒进行振荡吸附，使活性因子通过静电吸引稳固吸附于复合型无机矿化颗粒表面，得到吸附后的复合型无机矿化颗粒；步骤S3、将吸附后的复合型无机矿化颗粒与凝胶水溶液进行混合均匀后，即得骨诱导修复材料；本发明制备得到的骨诱导修复材料易于塑形，能够直接通过注射使用；具有超高的结晶度和结晶纯度，孔隙相互连通能够使细胞与活性因子相结合，促进细胞募集。

Description

一种可注射型骨诱导修复材料及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体地，涉及一种可注射型骨诱导修复材料及其制备方法。
背景技术
当人体的骨骼受到损伤时，需要对骨骼进行修复。天然自体骨无论是骨传导性，骨诱导性还是成骨能力方面都是最理想的供体，但是由于来源有限，采用“以伤治伤”的方式修复，然而当缺损部位很大时，便无法提供足够的骨源，还严重威胁人类的健康。
针对骨骼的修复材料，不仅要考虑到修复材料基材的结构或成分，还要考虑基体材料能否稳定地与活性因子相结合，促进细胞募集，这样才能充分发挥活性因子的作用。
公开号为CN113209368A的现有技术公开了一种骨科疾病及美容整形用动物源矿化骨及其制备方法，该发明将哺乳动物的四肢股骨干骺端松质骨部分，通过蒸煮、过氧化氢处理、高温煅烧、粉碎等步骤处理获得动物骨来源的矿物质，再将动物骨来源的矿物质经模拟体液溶液矿化处理，得到矿化后的羟基磷灰石颗粒，最后将矿化后的羟基磷灰石颗粒与活性因子进行震荡吸附，得到动物源矿化骨。该方法通过模拟体液矿化处理优化了骨修复材料的多孔结构，但其对活性因子的负载量和释放量的控制并不理想。
公开号为CN101564553A和CN103800945A的现有技术均公开了将骨修复材料与凝胶溶液或水凝胶混合使用，混合后为凝胶状可以注射使用，填充到人体骨缺损部位可以塑形成缺损部位的形状，便于操作；但其均未考虑凝胶溶液的浓度和用量对活性因子释放量的影响，无法保证凝胶溶液加入后活性因子的释放量能够达到人体骨缺损部位所需的水平，从而导致使用效果不佳。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可注射型骨诱导修复材料及其制备方法，利用复合型无机矿化颗粒负载更多的活性因子，并通过与凝胶水溶液混合，一方面能够通过注射使用，达到易于塑形方便操作的目的；另一方面优化凝胶水溶液的浓度和用量，使得修复材料的释放平稳性最优，达到最佳的使用效果。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种可注射型骨诱导修复材料的制备方法，将复合型无机矿化颗粒与活性因子分散吸附，再与凝胶水溶液混合即得，具体包括以下步骤：
步骤S1、将活性因子与复合型无机矿化颗粒按照20-500μg/g的比例进行振荡吸附；具体为将复合型无机矿化颗粒分散于含有活性因子的溶液中，含有活性因子的溶液的浓度为5-30μg/mL，进行振荡吸附，使大量活性因子通过静电吸引稳固吸附于复合型无机矿化颗粒表面，得到吸附后的复合型无机矿化颗粒；
步骤S2、按照质量比1:1-1.5，将吸附后的复合型无机矿化颗粒与浓度为5-50wt％的凝胶水溶液进行混合，混合均匀后，即得骨诱导修复材料。
凝胶水溶液的加入，不仅稳定了复合型无机矿化颗粒对活性因子的负载和吸附作用，而且能够产生一定的流动性，使该修复材料易于塑形，能够通过注射使用；通过对凝胶水溶液浓度范围的控制，能够有效地控制活化因子的释放平稳性，充分发挥活性因子的药物功能，促进复合型无机矿化颗粒在骨缺损部位的生成效果。
进一步地，所述复合型无机矿化颗粒通过以下步骤制得：
步骤A1、将哺乳动物的四肢股骨干骺端松质骨部分作为生物骨，使用线性切割机切成2-3cm3的小块，加清水煮沸0.5-1h，然后使用清水冲洗，去除表面杂质，重复蒸煮、冲洗多次；
步骤A2、将洗净的生物骨小块加入等体积混合的清水和质量分数为30-50％过氧化氢溶液中，煮沸1-2h，待所有生物骨小块变为白色后，得到白色骨块；
步骤A3、将白色骨块加入清水煮沸1h，捞出洗净后放入70℃烘箱中干燥1-2h，将干燥后的白色骨块置于600-800℃的焚烧炉中煅烧5-8h，得到生物骨来源的矿物质；
步骤A4、将生物骨来源的矿物质进行粉碎处理，得到粒径为100-500μm的复合型无机矿化颗粒，这样更适于细胞长入。
进一步地，所述活性因子为任何细胞外基质蛋白质，包括但不局限于纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白和胶原蛋白以及其生物活性片段的衍生多肽或蛋白中的任意一种。可以根据本发明修复材料的具体应用场景来选择相对应的活性因子。
进一步地，所述凝胶水溶液包括但不局限于聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯(PEO-PPO-PEO)嵌段共聚物溶液、羧甲基纤维素溶液、透明质酸溶液和壳聚糖溶液中的任意一种。凝胶水溶液是一种特殊的分散体系，具有多层次，多尺度的超微结构，含水量高，生物相容性好，具备很好的稳定水溶性药物，减少活性因子的酶解，由于凝胶水溶液中所含有的水性环境适合活性因子的自由扩散，因此可作为控制活性因子释放量的载体。
一种可注射型骨诱导修复材料通过上述制备方法制备得到。
本发明的有益效果：
本发明以哺乳动物的四肢股骨干骺端松质骨部分作为生物骨的来源，经过矿化处理和粉碎处理后，得到的复合型无机矿化颗粒具有天然多孔结构，兼具骨传导和骨诱导功能，解决了人工合成材料无法达到的孔隙结构，同时，复合型无机矿化颗粒能够取代同种异体骨，消除了同种异体骨抗原性以及伦理方面的问题；得到的复合型无机矿化颗粒还具有超高的结晶度和结晶纯度，保留了天然骨的骨小梁，其孔隙相互连通有利于成骨细胞的黏附和生长，能够稳定地与附着的活性因子相结合，促进细胞募集，充分发挥活性因子的促进作用，显著提升骨修复效果；
本发明直接将复合型无机矿化颗粒与活性因子进行振荡吸附，使大量活性因子稳固吸附于复合型无机矿化颗粒表面，为骨缺损部位提供充足负载量的活性因子，为骨诱导修复材料的使用效果奠定基础；
本发明通过将负载活性因子的复合型无机矿化颗粒与凝胶水溶液混合，一方面，稳定了复合型无机矿化颗粒对活性因子的负载和吸附作用，而且能够产生一定的流动性，使得到的骨诱导修复材料易于塑形，能够直接通过注射使用，可根据患者实际缺损的情况进行填充，具备良好的骨缺损占位效果，操作非常方便；更重要的另一方面，通过对凝胶水溶液浓度范围的控制，能够有效地控制活化因子的释放量和释放稳定性，充分发挥活性因子的药物功能，促进复合型无机矿化颗粒在骨缺损部位的生长效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明可注射型骨诱导修复材料的实物及扫描电镜图；
图2为本发明骨诱导修复材料表面的微观结晶结构扫描电镜图；
图3为本发明可注射型骨诱导修复材料分别在37℃和0℃水温条件下，浸泡5min后的状态示意图；
图4为本发明可注射型骨诱导修复材料经过冷冻、干燥后，制得的骨修复海绵的结构示意图；
图5为本发明实验例1对小鼠颅骨MC3T3-E1细胞增殖影响的结果统计图，*：表明数据有统计学差异，P≤0.0007；
图6为本发明实验例2对人骨髓间充质干细胞分化成骨细胞过程中的碱性磷酸酶(ALP)活性统计图，*：表明数据有统计学差异，P＝0.0002；
图7为本发明实验例3制得的HE染色组织切片在光学显微镜下的结构图，其中，上方两幅分别为利用对比例1材料制得的HE染色组织切片的40倍和400倍放大结构图，下方两幅分别为利用实施例3材料制得的HE染色组织切片的40倍和400倍放大结构图；
图8为本发明实验例4大鼠颅骨缺损区的微CT图；
图9为本发明实验例4骨小梁体积(BV)/组织体积(TV)的结果统计图，*：表明数据有统计学差异，P＝0.0245；
图10为本发明实验例5复合型无机矿化颗粒矿化处理和不进行矿化处理的表面Zeta电位图；
图11为本发明实验例5复合型无机矿化颗粒经过不同矿化处理后对BSA负载量的统计图；
图12为本发明实验例6中实施例2和对比例2制得的骨诱导修复材料活性因子释放量的曲线图；
图13为本发明实验例7中实施例4-实施例6制得的骨诱导修复材料活性因子释放量的曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
复合型无机矿化颗粒的制备：
选取哺乳动物的四肢股骨干骺端松质骨部分作为生物骨，将生物骨使用线性切割机切成2cm3的小块放入蒸锅中，水开后继续蒸煮30min，捞出后使用清水冲洗干净，去除表面杂质，蒸锅中更换清水，重复上述蒸煮和冲洗步骤3次；将洗净的生物骨小块加入等体积混合的清水和质量分数为40％过氧化氢溶液中，继续煮沸1h，待所有生物骨小块变为白色后，捞出白色骨块并用清水冲洗干净，再次使用清水煮沸1h，捞出洗净后，放入70℃烘箱中干燥1h，将干燥好的白色骨块置于焚烧炉中，在800℃条件下煅烧6h，制得生物骨来源的矿物质，将生物骨来源的矿物质进行粉碎处理，得到粒径为100-500μm的复合型无机矿化颗粒。
实施例2
本实施例主要验证本发明骨诱导修复材料的形貌特征与性质。
一种骨诱导修复材料的制备，包括以下步骤：
步骤S1、按照玻连蛋白与复合型无机矿化颗粒为25μg/g的比例，将实施例1制得的复合型无机矿化颗粒分散到20μg/mL的玻连蛋白溶液中，进行振荡吸附，使玻连蛋白能够附着在复合型无机矿化颗粒的表面，得到吸附后的复合型无机矿化颗粒；
步骤S2、将吸附后的复合型无机矿化颗粒与5wt％聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯嵌段共聚物溶液按照质量比1:1进行混合，混合均匀后，即得骨诱导修复材料。
请参阅图1-图2所示，实施例2制得的骨诱导修复材料具有一定的流动性，可实现任意塑形，可以通过注射器的挤压注射来使用，能够根据患者实际缺损的情况进行填充，操作方便，无需提前准备；复合型无机矿化颗粒的粒径尺寸在100-500μm内，具有人工合成材料无法达到的孔隙结构，且复合型无机矿化颗粒表面具有超高的结晶度和结晶纯度。
请参阅图3所示，根据聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯嵌段共聚物溶液的温度敏感特性，实施例2制得的骨诱导修复材料可在37℃条件下稳定存在，不发生遇水发散的情况，可有利于在人体的恒温环境中定型，避免植入物游离到其他部位而造成栓塞等风险。
此外，请参阅图4所示，实施例2制得的骨诱导修复材料经过冷冻干燥后，可制备得到骨诱导修复海绵，用于大段骨缺损填充，为本发明骨诱导修复材料增加更多可应用的场景。
实施例3
本实施例主要验证本发明骨诱导修复材料对细胞增殖分化的影响。
一种骨诱导修复材料的制备，包括以下步骤：
步骤S1、按照50μg/g的用量比例，将实施例1制得的复合型无机矿化颗粒分散到30μg/mL的特立帕肽(PTH)溶液中，进行振荡吸附，得到吸附后的复合型无机矿化颗粒；
步骤S2、将吸附后的复合型无机矿化颗粒与50wt％羧甲基纤维素溶液按照质量比1:1.5进行混合，混合均匀后，即得骨诱导修复材料。
对比例1
此对比例与实施例3相比，未在复合型无机矿化颗粒表面附着PTH，即省去步骤S1的操作，其余步骤和参数均相同。
实验例1
利用小鼠颅骨MC3T3-E1细胞，对实施例3和对比例1制得的骨诱导修复材料在常规培养条件下进行细胞增殖实验检测分析，分别检测分析第2、4、6天3个时间点的增殖结果。
请参阅图5所示，随着时间的延长，实施例3负载了PTH的骨诱导修复材料培养的小鼠颅骨MC3T3-E1细胞代谢活性明显高于对比例1未负载PTH的骨诱导修复材料，因此，本发明制得的骨诱导修复材料对细胞的增殖具有显著促进作用。
实验例2
利用人骨髓间充质干细胞(hMSC)，对实施例3和对比例1制得的骨诱导修复材料在常规培养条件下，干细胞分化为骨细胞的过程进行分析，测定碱性磷酸酶(ALP)的活性。
请参阅图6所示，实施例3和对比例1相比，培养21天后，实施例3负载了PTH的骨诱导修复材料培养的干细胞展现出较高的ALP活性，因此，本发明制得的骨诱导修复材料可促进早期细胞的增殖和分化。
实验例3
验证本发明骨诱导修复材料对异位成骨的影响：
将实施例3和对比例1制得的骨诱导修复材料分别植入到大鼠腿部肌肉的两侧，并在植入6周后分析新形成的硬组织，使用的剂量均为300mg。提取的组织保存于质量分数为10％的福尔马林溶液中固定，固定后，组织经取材、修整，按照常规石蜡切片制作方法，经脱水、包埋、切片等步骤，再进行常规HE(Hematoxylin-Eosin)染色，封片后制成HE染色组织切片。
请参阅图7所示，将制成的HE染色组织切片置于光学显微镜下进行组织标本的组织病理学观察，使用实施例3材料新形成的硬组织中血管生成和血液供应良好，血液供应是组织再生的主要决定因素。异位骨化早期表现为大量成纤维细胞增生，腿部肌肉植入区可见植入材料。在植入材料与骨骼肌交界处，大量成纤维细胞增生，纤维组织聚集，与周围正常骨骼肌界限较清。植入区可见新生血管。在植入区局部可见少量类软骨细胞，与对比例1相比，实施例3材料显示出优异的血管形成效果。
实验例4
将250-300g的SD大鼠成功麻醉后，在颅骨两侧用小动物颅骨环钻建立全层临界骨缺损模型，缺损尺寸为直径5mm，将实施例3制得的骨诱导修复材料和市售的β-磷酸三钙产品分别植入大鼠颅骨的两侧，依次缝合筋膜以及皮肤后，关闭手术创口，术后持续3天注射庆大霉素，预防感染；植入12周后，对动物实施安乐死并取出颅骨，利用颅骨缺损模型分析骨生长情况。
请参阅图8-图9所示，使用本发明的骨诱导修复材料植入后，颅骨缺损区的骨再生显著优于市售产品，具有更突出的骨诱导修复能力。
实验例5
参考中国专利CN113209368A说明书中的模拟体液溶液的组成成分，配制高、中、低三种浓度的模拟体液溶液：
高浓度模拟体液溶液：氯化钠120mM，氯化钾2mM，硫酸镁0.2mM，氯化镁0.5mM，碳酸氢钠4mM，氯化钙5mM，磷酸二氢钾1mM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10mM，最终PH值为6.8；
中浓度模拟体液溶液：氯化钠130mM，氯化钾4mM，硫酸镁0.5mM，氯化镁1mM，碳酸氢钠60mM，氯化钙5mM，磷酸二氢钾2mM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸20mM，最终PH值为7.0；
低浓度模拟体液溶液：氯化钠140mM，氯化钾6mM，硫酸镁0.5mM，氯化镁1.2mM，碳酸氢钠100mM，氯化钙6mM，磷酸二氢钾5mM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸40mM，最终PH值为6.9；
取四份实施例1制得的复合型无机矿化颗粒，其中一份不做任何处理，其余三份分别浸泡于高、中、低三种浓度的模拟体液溶液中进行矿化处理，37℃摇床震荡矿化5d，并每天更换溶液，真空干燥后备用；
分别测量上述无任何处理和高浓度模拟体液溶液处理后的复合型无机矿化颗粒表面的Zeta电位，并通过Zeta电位的不同分析复合型无机矿化颗粒表面电荷量变化；
然后将四份复合型无机矿化颗粒分别按照300μg/g的比例与胎牛血清白蛋白(BSA)溶液进行振荡吸附，对四份材料的BSA负载量进行对比和分析；
请参阅图10-图11所示，矿化处理后的复合型无机矿化颗粒表面Zeta电位会降低，证明经过矿化处理后的材料表面净电荷数量减少，而活性因子负载量与材料表面电荷息息相关，材料表面净电荷数量减少从而降低了活性因子的负载量。因此在本发明为了获得更高的活性因子负载量，选择直接将复合型无机矿化颗粒与活性因子进行振荡吸附。
对比例2
该对比例与实施例2相比，省去步骤S2的操作，直接将吸附后的复合型无机矿化颗粒作为骨诱导修复材料使用。
实验例6
将实施例2和对比例2制得的骨诱导修复材料进行活性因子(玻连蛋白)释放量的测试和分析，统计7天内的累计释放量。
请参阅图12所示，实施例2制得的骨诱导修复材料的累计释放量明显低于对比例2制得的骨诱导修复材料，吸附后的复合型无机矿化颗粒与凝胶水溶液混合后，可有效降低活性因子的释放量，提高活性因子释放的时间，不会出现使用初期释放量突增的问题；此外，实施例2制得的骨诱导修复材料活性因子释放误差更小，更加容易控制。
实施例4
一种骨诱导修复材料的制备，包括以下步骤：
步骤S1、按照100μg/g的用量比例，将复合型无机矿化颗粒分散到20μg/mL的胶原蛋白溶液中，进行振荡吸附，得到吸附后的复合型无机矿化颗粒；
步骤S2、将吸附后的复合型无机矿化颗粒与5wt％透明质酸溶液按照质量比1:1.5进行混合，混合均匀后，即得骨诱导修复材料。
实施例5
一种骨诱导修复材料的制备，包括以下步骤：
步骤S1、按照100μg/g的用量比例，将复合型无机矿化颗粒分散到20μg/mL的胶原蛋白溶液中，进行振荡吸附，得到吸附后的复合型无机矿化颗粒；
步骤S2、将吸附后的复合型无机矿化颗粒与30wt％透明质酸溶液按照质量比1:1.5进行混合，混合均匀后，即得骨诱导修复材料。
实施例6
一种骨诱导修复材料的制备，包括以下步骤：
步骤S1、按照100μg/g的用量比例，将复合型无机矿化颗粒分散到20μg/mL的胶原蛋白溶液中，进行振荡吸附，得到吸附后的复合型无机矿化颗粒；
步骤S2、将吸附后的复合型无机矿化颗粒与50wt％透明质酸溶液按照质量比1:1.5进行混合，混合均匀后，即得骨诱导修复材料。
实验例7
将实施例4-实施例6制得的骨诱导修复材料进行活性因子(胶原蛋白溶液)释放量的测试和分析，统计20天内的累计释放量。
请参阅图13所示，凝胶水溶液的浓度对于活性因子释放量也有一定影响，凝胶水溶液浓度越高，活性因子释放量越低；凝胶水溶液的浓度在5-50wt％之间，可以保持良好的活性因子释放环境，充分发挥活性因子的促进作用。
在实际应用过程中，凝胶水溶液的浓度过高，会导致活性因子释放量过低甚至无法释放，无法发挥活性因子在骨修复方面的促进作用；凝胶水溶液过低，无法起到控制活性因子释放量的作用，活性因子在短时间内突释，尤其是多肽类活性因子(特立帕肽)，会导致过量的活性因子在体内酶解失去应该有的作用，而一定浓度的凝胶水溶液可以有效控制活性因子的释放量，调控骨修复材料使用组织局部的药物浓度，减少活性因子的酶解，充分发挥活性因子的促进作用，长期促进细胞募集，达到更好的使用效果。
在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种可注射型骨诱导修复材料的制备方法，其特征在于：将复合型无机矿化颗粒与活性因子分散吸附，再与凝胶水溶液混合即得，具体包括以下步骤：
步骤S1、将活性因子与复合型无机矿化颗粒按照20-500μg/g的比例进行振荡吸附，得到吸附后的复合型无机矿化颗粒；
步骤S2、按照质量比1:1-1.5，将吸附后的复合型无机矿化颗粒与浓度为5-50wt％的凝胶水溶液进行混合，混合均匀后，即得骨诱导修复材料。
2.根据权利要求1所述的一种可注射型骨诱导修复材料的制备方法，其特征在于：所述复合型无机矿化颗粒的粒径为100-500μm。
3.根据权利要求1所述的一种可注射型骨诱导修复材料的制备方法，其特征在于：所述活性因子为细胞外基质蛋白质，包括纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白和胶原蛋白以及其生物活性片段的衍生多肽或蛋白中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的一种可注射型骨诱导修复材料的制备方法，其特征在于：所述凝胶水溶液包括聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯嵌段共聚物溶液、羧甲基纤维素溶液、透明质酸溶液和壳聚糖溶液中的任意一种。
5.一种可注射型骨诱导修复材料，其特征在于，所述骨诱导修复材料由权利要求1-4任一项所述的制备方法制得。
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