CN110732040A - 一种骨修复材料、方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种骨修复材料、方法及用途，制备骨修复材料的方法，包括以下步骤：A1)将去除牙髓的离体牙用盐酸进行脱钙处理；A2)用高、低渗NaCl溶液交替浸泡脱钙后的离体牙；A3)用胰蛋白酶和EDTA消化，TritonX‑100浸泡，交联剂交联。本发明公开的骨修复材料为采用本发明制备骨修复材料的方法制得；本发明提供了一种不会产生排斥反应且能广泛使用的骨修复材料、方法及用途。

Description

一种骨修复材料、方法及用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种骨修复材料、方法及用途。
背景技术
骨缺损修复的技术有自体骨移植、同种异体骨移植和人工骨移植。自体骨移植是目前骨缺损修复的金标准，自体骨移植骨材料生物来源与宿主是一致的，所以不用考虑组织相容性和移植后的排异反应，是目前临床最常用的治疗骨缺损的材料，与其他骨移植材料相比，自体骨具有生物相容性好，成骨能力强，骨诱导活性高等优点；与自体骨移植相比，异体骨移植具有使用方便，来源相对丰富，骨细胞经处理后已被灭活，免疫原性低，可以提供结构支持等诸多优点。临床上多采用冻干、辐照或化学处理降低免疫原性；口腔临床现常用的人工骨材料常以骨粉形式存在，其特点是将动物的骨头打碎成粉后去抗原处理。
口腔临床中传统的骨缺损修复方法中，自体骨移植往往受到供体来源限制，且手术时间长，造成附加创伤，并发症多；同种异体骨移植常发生植入的异体骨吸收，而且容易感染，排斥反应重等缺点；口腔临床上人工骨移植材料常因为其颗粒、粉末状，修复骨缺损时需与GBR技术相结合，且成骨困难。
公开号为CN108114313A的中国专利，公开了一种人工骨材料及其人工骨的制备方法，步骤为：取质量分数为5％浓度的双氧水80-100份，加入1-2份的生长激素释放肽和4-6份的缓释制剂，得到混合物A；取100-120份的聚乳酸羟基乙酸共聚物、20-30份的贝壳粉、4-8份的鱼鳞粉进行混合，加入200-220份的去离子水，得到混合物B；将混合物A和混合物B进行混合，使用高速搅拌器进行搅拌，温度控制在50-60℃，直至搅拌均匀成为糊状，得到混合物C；将混合物C缓慢的挤压入到模具中，将模具置入零下的温度环境中，直至模具中的人工骨成型，得到人工骨初件。但该专利公开的人工骨仍然存在排异反应的风险。
公开号为CN102319450A的中国专利，公开了一种自体骨粉回收利用的方法，包括以下步骤：在骨骼上钻孔，产生骨粉和血液等的混合物；收集所述混合物；对所收集的混合物进行离心或过滤处理，分离出自体骨粉和血浆；向分离出的自体骨粉和血浆内加入骨用活性物；重新植入患者骨折处。利用本方法对骨钻孔过程中产生的骨粉和血液等的混合物进行收集提取，将自体骨粉和血浆重新植入患者骨折处，避免了自体资源的浪费，但是该专利提供的方法制造的骨材料少，适用范围受限。
综上所述，现有技术还缺少一种不会产生排斥反应且能广泛使用的骨修复材料。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种不会产生排斥反应且能广泛使用的骨修复材料、方法及用途。
本发明的一个方面，一种制备骨修复材料的方法，包括以下步骤：
A1)将已去除牙髓的离体牙用盐酸进行脱钙处理；
A2)用高、低渗NaCl溶液交替浸泡脱钙后的离体牙；
A3)将步骤A2)处理的离体牙用胰蛋白酶和EDTA消化，TritonX-100浸泡，交联剂交联。
优选地，所述盐酸浓度为0.3-1mol/L；进一步优选地，所述盐酸浓度为0.5mol/L。
优选地，所述盐酸与离体牙重量比25:1-15:1；进一步优选地，所述盐酸与离体牙重量比为20:1。
优选地，所述交联剂为戊二醛。
优选地，步骤A2)高渗NaCl溶液和低渗NaCl溶液交替浸泡的循环次数不少于3次。
优选地，所述脱钙处理为：向离体牙加入浓度为0.5mol/L的盐酸溶液，且盐酸与离体牙重量比为20:1；将离体牙和盐酸溶液置于恒温振荡器上，25℃条件下20转/min的速度振荡；1h后倒掉原盐酸溶液，换相同体积和浓度的盐酸溶液，继续震荡；经过1h的反应后，用盐酸溶液的20倍体积的水在1000转/min的离心速度下漂洗15min，弃去上清，重新加水离心重复5次，共75min。
本发明还包括一种骨修复材料，采用本发明所述的制备骨修复材料的方法制造。
优选地，本发明所述的骨修复材料可以根据需求制作成不同形状。
优选地，本发明的骨修复材料用于修补骨缺损中的应用。
优选地，所述离体牙为自体牙齿，目前每年都有大量患者因智齿冠周炎拔出智齿，而拔掉的牙齿一般默认为医疗废弃物，本发明能够减少能源的浪费，将被废弃的牙齿重新利用。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
1、采用本发明方法制作的骨修复材料进行骨修复，修复效果优于现有技术的骨修复材料，并且，本发明的骨修复材料可以被广泛应用；
2、本发明的离体牙可为自体废弃的骨组织为拔掉的智齿；一方面可以更大限度避免自体资源的浪费，另一方面可以避免排斥反应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1的骨修复材料制备方法；
图2是本发明实施例2的H-E染色结果；
图3是本发明实施例3的Micro-CT图；
图4是本发明实施例3的Micro-CT定量分析；
图5是本发明实施例3的颅盖骨染色结果；
图6是本发明实施例3的颅盖骨免疫组化结果。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
本发明所述的高渗NaCl为浓度大于0.9％的NaCl溶液。
本发明所述的低渗NaCl为浓度小于0.9％的NaCl溶液。
实施例1制备骨修复材料
制备本发明的骨修复材料的方法，如图1所示，包括以下步骤：
1、收集患者拔牙后废弃的牙齿；
2、配置盐酸溶液：盐酸溶液浓度为0.5mol/L，盐酸溶液量为，盐酸溶液与牙齿的重量比为20:1；
3、将盐酸溶液和牙齿加入容器内置于恒温振荡器上，25℃条件下20转/min的速度促进脱钙反应；
4、1h后重新换盐酸溶液继续振荡；
5、经过1h的反应后，用20倍体积水在1000转/min的离心速度下漂洗15min，弃去上清，重新加水离心重复5次共75min；得到脱钙的骨修复材料；
6、用高、低渗NaCl溶液交替浸泡；
7、用胰蛋白酶和EDTA消化；
8、再用TritonX-100浸泡，戊二醛交联；得到脱细胞脱钙牙的骨修复材料。
实施例2
将12只SD大鼠随机分成A、B两组(每组6只)。将A、B两组大鼠进行颅顶骨成骨实验，具体实验方法如下：
1、3％戊巴比妥钠溶液(0.15-0.2ml/100g)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后大鼠取俯卧位，并固定于固定板上；
2、大鼠手术区域备皮，消毒，铺无菌手术巾。
3、沿颅骨顶正中线纵向切开约3cm切口，依次切开皮肤、皮下组织，仔细分离骨膜；
3、采用直径为5mm的种植机环钻在顶骨区域的正中位置两侧，小心钻磨颅骨，同时用探针探查深度，当颅骨接近钻透时，可用小镊子进行钝性撬拔，将骨片完全取下，避免损伤下方的硬脑膜和其表面血管。
4、A组左侧缺损处植入实施例1制备的脱钙骨修复材料；右侧不放置材料，为空白对照；
5、B组左侧植入实施例1制备的脱细胞脱钙骨修复材料，右侧不放置材料，为空白对照；
6、术中充分止血，依次缝合各层组织，关闭伤口后碘伏消毒切口，术中注意观察大鼠呼吸、心率等生命体征；
7、术后待大鼠麻醉苏醒后，耳标标记所有大鼠并将其分笼饲养，术后连续3天颈部皮下注射青霉素20万U/天，4周后随机处死A、B组各3只，8周后处死剩余大鼠；
8、Micro-CT检测取出大鼠颅盖骨，分离骨周围软组织，进行Micro-CT扫描。扫描参数为70kV，114mA,扫描厚度为50μm。对术后4周和8周后的大鼠颅盖骨进行Micro-CT扫描结果三维重建后，进行骨量分析，定量评估新骨生成情况。
实验结果如下:
1.皮下包埋大体形态学结果，皮下包埋实验4周后，所有动物术后伤口愈合良好，无症表现，无材料暴露情况，大鼠均愈合良好，处死大鼠取出腹部皮下包埋的牙齿均与腹部皮下脂肪粘连。
2.皮下包埋H-E染色结果，如图2所示，A为脱钙牙，B为脱细胞脱钙牙，在光学显微镜下B中炎症细胞明显少于A。因此，H-E染色显示腹部皮下包埋的脱钙牙与皮下组织周围炎症细胞明显多于脱细胞脱钙牙。
实施例3
采用实施例1的方法制备脱细胞脱钙的骨修复材料，采用实施例2的方法制备出大鼠双侧颅顶骨缺损，将脱细胞脱钙的骨修复材料充填大鼠一侧颅顶骨缺损，其余一侧不填充。对术后4周和8周后的大鼠颅盖骨进行Micro-CT扫描结果三维重建后，进行骨量分析，定量评估新骨生成情况。
结果如图3所示，左图为4周大鼠Micro-CT图，右图为8周大鼠Micro-CT图，可见，术后4周和8周，植入脱细胞脱钙牙齿的骨缺损处修复的程度明显高于未植入材料修复的空白对照处。如图4所示，Micro-CT定量分析，A为植入脱细胞脱钙牙的骨缺损修复，B为空白对照组(*P＜0.05)。
上述结果具体分析如下：大鼠均愈合良好，分4周和8周处死大鼠观察显示实验组牙齿切块均在位。Micro-CT显示：4周大鼠颅盖骨比较，植入脱细胞脱钙牙骨缺损处新骨生成量明显增加，空白组新骨生成量无明显增加(如图3所示)。对实验组与空白对照组中的新骨体积百分数分析，两组的新骨体积百分数有统计学差异(如图4所示)。8周大鼠颅盖骨比较，植入脱细胞脱钙牙骨缺损处新骨生成量明显增加，空白组新骨生成量无明显增加(如图3所示)。对实验组与空白对照组中的新骨体积百分数分析，两组的新骨体积百分数有统计学差异(如图4所示)。
进一步，对颅盖骨进行染色检测大鼠颅盖骨4周炎症反应，结果如图5所示：4周大鼠颅盖骨H-E染色，A为脱细胞脱钙牙，B为空白对照。在光学显微镜下A与B炎症细胞的数量无明显差异。
进一步，颅盖骨免疫组化，Osteocalcin免疫组化检测4周大鼠颅盖骨，结果如图6所示：A为脱细胞脱钙牙，B为空白对照。箭头代表骨钙素，在光学显微镜下B中骨钙素明显少于A。B组大鼠颅顶骨免疫组化显示植入脱细胞脱钙牙骨缺损处的骨钙素明显多于空白对照，说明植入脱细胞脱钙牙骨缺损处的成骨细胞明显多于空白对照。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种制备骨修复材料的方法，包括以下步骤：
A1)将已去除牙髓的离体牙用盐酸进行脱钙处理；
A2)用高渗NaCl溶液和低渗NaCl溶液交替浸泡脱钙后的离体牙；
A3)将步骤A2)处理的离体牙用胰蛋白酶和EDTA消化，TritonX-100浸泡，交联剂交联。
2.如权利要求1所述的方法，所述盐酸浓度为0.3-1mol/L。
3.如权利要求2所述的方法，所述盐酸浓度为0.5mol/L。
4.如权利要求1-3任意一项所述的方法，所述盐酸与离体牙重量比为25:1-15:1。
5.如权利要求4所述的方法，所述盐酸与离体牙重量比为20:1。
6.如权利要求1所述的方法，所述交联剂为戊二醛。
7.如权利要求1所述的方法，步骤A2)高渗NaCl溶液和低渗NaCl溶液交替浸泡的循环次数不少于3次。
8.如权利要求1-7任意一项所述的方法，所述脱钙处理为：向离体牙加入浓度为0.5mol/L的盐酸溶液，且盐酸与离体牙重量比为20:1；将离体牙和盐酸溶液置于恒温振荡器上，25℃条件下20转/min的速度振荡；1h后倒掉原盐酸溶液，换相同体积和浓度的盐酸溶液，继续震荡；经过1h的反应后，用盐酸溶液的20倍体积的水在1000转/min的离心速度下漂洗15min，弃去上清，重新加水离心重复5次，共75min。
9.一种骨修复材料，其特征在于，采用权利要求1-8所述的方法制造。
10.权利要求9所述的骨修复材料用于修补骨缺损中的应用。
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