CN115006428A - 一种可注射生物水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种可注射生物水凝胶及其制备方法与应用，本发明通过将牙髓进行脱细胞处理，得脱细胞牙髓基质；脱细胞牙髓基质经干燥制粉、酶解消化，得脱细胞牙髓基质消化液；调节脱细胞牙髓基质消化液的pH和离子强度，制得可注射生物水凝胶。本发明脱细胞牙髓基质消化液在成胶之前具有很好的流动性，将其注射到根管系统中在体温的温度条件下能够固化成凝胶，从而解决现有根管内再生组织的精确尺寸、形状和三维填充等技术难题，且本发明水凝胶能够诱导功能性牙髓的再生。

Description

一种可注射生物水凝胶及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种可注射生物水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术

牙髓病和根尖周病是常见的口腔疾病，发病率高、流行度广，占口腔门诊量60％以上。牙髓病和根尖周病的病因多与感染或外伤相关，其发生不仅会引起咀嚼器官的疼痛与肿胀，还会导致患牙的牙髓组织不可逆性坏死与功能丧失。牙髓病和根尖周病的传统治疗手段是根管治疗，包括对根管进行清理、成形、消毒及充填，治疗目的是控制感染与终止炎症，但无法实现牙髓组织再生与功能恢复。正常的牙髓具有形成、营养、感觉及防御4种基本功能，无髓牙则丧失牙髓的生理功能，牙齿发育终止，容易折断，最终导致患牙丢失，严重影响患者的生活质量及心理健康。因此，促进牙髓的再生与功能恢复具有重要的临床意义。

目前临床上可用的牙髓再生治疗法是“牙髓血运重建术”，该方法应用根管锉刺激根尖乳头出血引导干细胞进入根管系统，同时血凝块充当生物支架促进干细胞的增殖和分化。虽然“牙髓血运重建术”能实现部分病例根尖周炎的愈合和牙根的形成，但组织学研究发现，根管内再生的组织并非真正的牙髓组织，而是骨组织和类牙骨质等牙周组织。因此，目前再生功能性牙髓仍然是牙体牙髓病学的一个重大挑战和尚未攻克的难点。

牙髓再生需依靠干细胞移植来提供充足的种子细胞。然而，单纯的干细胞移植细胞存活率低，缺乏调控的细胞会分化为骨样组织或牙周样组织，而非牙髓样组织。因此，目前临床上可用的“牙髓血运重建术”不能再生真正的牙髓组织。因此，牙髓再生需联合应用支架材料作为干细胞移植的载体，为干细胞提供适合特定组织再生的微环境。此外，根管系统是细窄的管道结构，管径可小至几十微米，要实现支架材料在根管系统的三维填充，要求支架材料具有流动性和可注射性。

为此，国内外众多学者通过组织工程的方法，为干细胞移植寻找合适的载体支架材料。目前应用于牙髓再生研究的支架材料主要有人工合成高分子材料及天然材料两大类。人工合成高分子材料通常具有较好的力学强度及加工性能，但亲水性和细胞活性较差，体内降解缓慢。如胶原、明胶、透明质酸等天然高分子材料与细胞外基质相似度高，或本身就是细胞外基质的组成部分，但在促进牙髓组织再生或作为干细胞移植载体方面的作用较局限。而天然材料如牙髓，由于牙髓形态固定，不具有形态可适应性，难以填充到形态细小且复杂多变的根管系统，不能为细胞提供三维生长环境，严重限制了其临床转化及应用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明旨在提供一种可注射生物水凝胶及其制备方法与应用，本发明通过将牙髓组织中的细胞成分去除获得脱细胞牙髓基质，并通过酶解消化以及pH、离子强度的调控，使脱细胞牙髓基质消化液发生凝胶化转变，本发明水凝胶能够在牙齿根管系统中固位，并呈现天然牙髓组织的三维微纳结构，为牙髓再生提供稳定的局部微环境，诱导功能性牙髓的再生。

基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种可注射生物水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)将牙髓进行脱细胞处理，得脱细胞牙髓基质；

(2)脱细胞牙髓基质经干燥制粉，得脱细胞牙髓基质粉末；

(3)脱细胞牙髓基质粉末经酶解消化，得脱细胞牙髓基质消化液；

(4)调节脱细胞牙髓基质消化液的pH和离子强度，制得可注射生物水凝胶，即脱细胞牙髓基质水凝胶。

本发明通过将牙髓组织中的细胞成分去除获得脱细胞牙髓外基质，进一步通过干燥制粉、酶解、pH、离子强度的调控，使脱细胞牙髓基质消化液在体温的温度下即可发生凝胶化转变，调节pH和离子强度的脱细胞牙髓基质消化液在成胶之前具有很好的流动性，将其注射到根管系统中在体温的温度条件下能够固化成凝胶，从而解决现有根管内再生组织的精确尺寸、形状和三维填充等技术难题。

本发明水凝胶能够在牙齿根管系统中固位，并呈现天然牙髓组织的三维微纳结构，为牙髓再生提供稳定的局部微环境，如合适的营养与再生信号，诱导功能性牙髓的再生。

优选地，步骤(1)将牙髓进行脱细胞处理的方法如下：将牙髓经胰酶酶解、洗涤得脱细胞牙髓基质。

通过将牙髓组织中的细胞成分去除获得牙髓细胞外基质，并对脱细胞效果进行鉴定，最大限度降低脱细胞牙髓基质的免疫原性。

优选地，牙髓经胰酶酶解包括如下步骤：将牙髓浸泡于含0.1％胰酶和0.25％乙二胺四乙酸的磷酸缓冲液，于37℃酶解1h。

由本发明所述酶解方法能够有效去除牙髓中的细胞成分，以最大限度降低脱细胞牙髓基质的免疫原性。

优选地，洗涤包括如下步骤：将胰酶酶解后的牙髓经水浸洗后，再利用含0.1％十二烷基硫酸钠的磷酸缓冲盐溶液进行洗涤，再经水浸洗得脱细胞牙髓基质。

本发明进一步通过水洗、表面活性剂洗涤以及水洗等步骤，充分去除酶解后的细胞组分，以最大限度降低脱细胞牙髓基质的免疫原性。

优选地，步骤(1)中的牙髓为猪牙髓。

猪牙髓与人牙髓的组成成分相似，猪牙髓来源广泛，经脱细胞处理后，猪牙髓仅保留细胞外基质成分，免疫原性消除，形成水凝胶网络后，干细胞能在其中均匀混合，脱细胞牙髓基质水凝胶不但能发挥保护干细胞的作用，还能稳定干细胞，为干细胞的增殖与分化提供多种牙髓来源的生长因子。

优选地，步骤(3)脱细胞牙髓基质粉末经酶解消化的方法如下：

将脱细胞牙髓基质粉末按照(28～32)mg:1ml的固液比溶解于胃蛋白酶溶液，于室温、消化处理，至消化液的粘度不再增加，停止消化，收集脱细胞牙髓基质消化液。

优选地，步骤(4)调节脱细胞牙髓基质消化液的pH至7.0～7.5。

本发明通过将脱细胞牙髓基质消化液的pH调整至7.0～7.5，一方面有助于促使牙髓基质消化液的凝胶化转变，另一方面，该pH值范围为促使功能性牙髓再生的适宜pH范围。

优选地，步骤(4)调节脱细胞牙髓基质消化液的pH的方法如下：

先将步骤(3)所得脱细胞牙髓基质消化液调节至碱性，促使胃蛋白酶失活，再加酸调节其pH至7.0～7.5。

优选地，步骤(4)通过向脱细胞牙髓基质消化液中加入10×DMEM培养基，以调节脱细胞牙髓基质消化液的离子强度。

本发明在调节pH的基础上，进一步调节脱细胞牙髓基质消化液的离子强度，促使pH和离子强度调节后的脱细胞牙髓基质水凝胶在体温(36℃～38℃)范围内可发生凝胶化转变。

优选地，干燥为冷冻干燥。

本发明采用将脱细胞牙髓基质冷冻干燥的方式有助于保持脱细胞牙髓基质中功能性成分的活性。

第二方面，本发明提供一种由上述方法制得的可注射生物水凝胶。

第三方面，本发明提供上述水凝胶在制备促进牙髓再生与功能恢复的药物中的应用。

第四方面，本发明提供上述水凝胶在制备治疗牙髓病、根尖周病药物中的应用。

本发明可注射生物水凝胶经细胞实验和动物实验证实，其具有诱导牙髓干细胞成牙本质向、成血管向与成神经向分化的能力，结合本发明水凝胶在凝胶前极好的流动性以及在体温的温度下即可凝胶化转变的特性，使得本发明水凝胶解决了现有根管内再生组织的精确尺寸、形状和三维填充等技术难题，具有较高的临床应用前景。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)本发明提供一种具有促进功能性牙髓再生的可注射生物水凝胶，为牙髓细胞提供天然的再生微环境，利用脱细胞牙髓基质水凝胶在凝胶化前良好的流动性，可注射性，使用时无需特定的形状和尺寸，能够三维填充根管系统，当脱细胞牙髓基质的温度由室温上升为体温(36℃～38℃)后，缓慢成胶，无需预先得到精确尺寸也能完美契合根管形态，凝胶化后与根管系统能够很好黏附，无需加压。

(2)本发明脱细胞牙髓基质水凝胶中混合多种生长因子，能够很好模拟组织微环境，有利于细胞黏附、生长及分化，能够包裹细胞，促进组织再生；同时具有可降解性，可逐渐被再生的牙髓组织取代。

(3)本发明水凝胶不仅可以同种子细胞均匀混合，而且在成胶之后多孔结构能够保证营养物质的运输和吸收，减少对细胞的破坏；本发明水凝胶还能够与种子细胞、生长因子、药物等均匀混合，作为细胞、营养因子和药物释放的载体，进一步增加水凝胶的促修复效果；还可以向水凝胶中添加辅助成分，调整水凝胶的机械强度与降解速度以增加再生组织与原组织的匹配性。

(4)本发明脱细胞牙髓基质水凝胶能够三维填充形态复杂的根管系统并原位固化形成三维空间网络，促进细胞的多向分化，分化成组成天然牙髓的不同成分，再生的牙髓更接近天然组织；本发明脱细胞牙髓基质水凝胶能很好地模拟牙髓组织微环境，具有良好的生物相容性，能够促进牙髓组织再生，能够在治疗时同时保留牙齿的软硬组织，而目前的根管治疗只能保存牙齿的硬组织。

(5)本发明水凝胶的制备方法简单、快速、易实现，脱细胞牙髓基质水凝胶来源广，极大满足临床使用需求。

附图说明

图1为脱细胞前(左)后(右)的牙髓基质；

图2为脱细胞牙髓基质水凝胶实物图；

图3为脱细胞牙髓基质水凝胶扫描电镜图；

图4为脱细胞牙髓基质水凝胶促进牙髓细胞成牙本质向分化；

图5为脱细胞牙髓基质水凝胶促进牙髓细胞成血管分化；

图6为脱细胞牙髓基质水凝胶促进牙髓细胞成神经分化；

图7为注射脱细胞牙髓基质水凝胶的牙本质环于裸鼠皮下植入4周(A)和8周(B)HE染色结果，注射胶原的对照组牙本质环于裸鼠皮下植入4周(C)和8周(D)的HE染色结果(比例尺＝50μm)。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例提供一种可注射生物水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1.取猪上颌骨7个，取出猪牙髓38g，切碎至5mm×5mm大小(图1)。

2.制备脱细胞牙髓：

a)将猪牙髓浸泡于400ml含有0.1％胰酶及0.25％乙二胺四乙酸的磷酸缓冲盐溶液中，37℃水浴加热1小时。

b)取出猪牙髓，使用400ml双蒸水浸洗，浸洗4次，每次15分钟，全程置于4℃摇床上。

c)取出猪牙髓，将其浸泡于含300ml 0.1％十二烷基硫酸钠的磷酸缓冲盐溶液中，浸泡4次，每次12小时，全程置于4℃摇床上。

d)取出猪牙髓，使用400ml双蒸水浸洗至无泡，1小时换液一次，全程置于4℃摇床上，至此，得到脱细胞牙髓基质。

对脱细胞前后的牙髓进行HE染色，如图1所示，染色结果表明经上述处理后，脱细胞牙髓中的细胞成分已被去除。

3.冻干：将脱细胞后的猪牙髓基质于-50℃、0.01mbar真空无菌冻干3天。

4.打粉：使用研磨机将冻干后的脱细胞猪牙髓组织研磨成粉末，获得粉末0.7g。

5.消化：从上一步的冻干粉末中取出粉末60mg，按照30mg:1mL的固液比将其溶解于2ml含有0.3％胃蛋白酶的0.1M盐酸溶液中，室温搅拌，每隔15min观察消化液状态，观察到消化液粘度逐渐增加，酶解处理9h 30min时粘度略微下降，将其置于4℃冰箱中暂停消化，得到浓度为3％脱细胞牙髓基质消化液。

6.调pH：取上一步获得的3％脱细胞牙髓基质消化液，加入0.1M盐酸将其稀释，分别得到浓度为1％和0.5％脱细胞牙髓基质消化液。使用5M氢氧化钠溶液将三种浓度(0.5％、1％和3％)的脱细胞牙髓基质消化液滴定至pH＝7.0，再用1M氢氧化钠溶液调至pH＝8.0使胃蛋白酶失活，最后用1M盐酸溶液将pH调至7.4。

7.平衡离子强度：向每毫升pH＝7.4的脱细胞牙髓基质消化液中加入115μl的10×DMEM培养基。

8.成胶：将经步骤7处理后的脱细胞牙髓基质消化液置于37℃恒温箱中1小时使其成胶，得到0.5％、1％和3％三种浓度的脱细胞牙髓基质水凝胶。

本发明水凝胶的实物图如图2所示，由上述方法制得的三种水凝胶的扫描电镜照片如图3所示，均可观察到上述水凝胶呈现三维微纳结构。

实施例2细胞实验

本实施例提供一种脱细胞牙髓基质水凝胶的制备方法，并通过细胞实验对本发明水凝胶对促进牙髓再生的效果进行分析，实验方法如下：

1、脱细胞牙髓基质水凝胶的制备

取猪上颌骨9个，取出猪牙髓46g，切碎至5mm×5mm大小。将猪牙髓浸泡于500ml含有0.1％胰酶及0.25％乙二胺四乙酸的磷酸缓冲盐溶液中，37℃水浴加热1小时，取出猪牙髓，于4℃摇床上使用500ml双蒸水浸洗，浸洗4次，每次15分钟；将猪牙髓浸泡于含500ml0.1％十二烷基硫酸钠的磷酸缓冲盐溶液中，4℃摇床上浸泡4次，每次12小时；取出猪牙髓，4℃摇床上浸泡于500ml双蒸水浸洗至无泡，1小时换液一次，得到脱细胞牙髓基质。将脱细胞后的猪牙髓基质于-50℃、0.01mbar真空无菌冻干3天，使用研磨机将冻干后的脱细胞猪牙髓基质组织研磨成粉末，获得粉末1.1g。取冻干粉末60mg，按照30mg:1mL的固液比将其溶解于2ml含有0.3％胃蛋白酶的0.1M盐酸溶液中，室温搅拌，每隔15min观察消化液状态，观察到消化液粘度逐渐增加，并在9h 45min时观察到粘度开始下降，立即将其置于4℃冰箱中暂停消化。使用5M氢氧化钠溶液滴定至pH＝7.0，用1M氢氧化钠溶液调至pH＝8.0，使胃蛋白酶失活，用1M盐酸溶液将pH调至7.4，加入230μl的10×DMEM培养基平衡离子强度。置于37℃恒温箱中1小时成胶，得到脱细胞牙髓基质水凝胶。

2、脱细胞牙髓基质水凝胶的效果验证

三维培养诱导牙髓干细胞(DPSCs)分化实验，方法如下：

取3％脱细胞牙髓基质消化液，用0.1M盐酸溶液稀释至0.5％，使用5M氢氧化钠溶液滴定至pH＝7.0，用1M氢氧化钠溶液调至pH＝8.0，使胃蛋白酶失活，用1M盐酸溶液将pH调至7.4，加入总液体1/9体积的10×DMEM培养基平衡离子强度。

取I型胶原原液并使用双蒸水稀释至0.5％，用1M氢氧化钠溶液调至pH＝7.4，加入总液体1/9体积的10×DMEM培养基平衡离子强度。取P3至P5DPSCs，胰酶消化，分别使用上述配好的0.5％脱细胞牙髓基质消化液及0.5％I型胶原液以1×10⁶个/ml的密度重悬细胞，将混合液接种于24孔板或共聚焦皿中，置于5％CO₂、37℃细胞培养箱中1小时，待其成胶后加入含1％青链霉素和10％FBS的DMEM培养基，2～3天更换一次培养液。待细胞融合至70％～80％时，分别更换为成牙本质诱导液(0.1μM地塞米松、10m Mβ-甘油磷酸钠、0.05M维生素C、1％青链霉素和10％FBS的DMEM)、成血管诱导液(50ng/ml内皮细胞生长因子、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、1％青链霉素和10％FBS的DMEM)、成神经诱导液(含1μM二甲基亚砜，200μM b-丁羟茴醚，10μM毛喉素，0.1μMβ-巯基乙醇、1％青链霉素和10％FBS的DMEM)继续培养。隔天更换一次诱导液，直到7天后终止培养。成牙本质向分化进行DSPP免疫荧光染色、DSPP与DMP1的Western blot检测，成血管向分化进行CD31的免疫荧光染色与Western blot检测，成神经向分化进行TUJ-1和MAP2的免疫荧光染色。结果如图4、图5和图6所示，结果表明本发明脱细胞牙髓基质水凝胶诱导牙髓干细胞成牙本质向、成血管向与成神经向分化的能力均强于胶原组。

实施例3动物实验

本实施例提供一种脱细胞牙髓基质水凝胶的制备方法，并通过动物实验对本发明水凝胶的效果进行验证，实验方法如下：

1、脱细胞牙髓基质水凝胶的制备

取新鲜猪上颌骨6个，拔牙，取出猪牙髓，称重为32g，将其剪碎至5mm×5mm大小。将剪碎的猪牙髓浸泡于350ml含有0.1％胰酶及0.25％乙二胺四乙酸的磷酸缓冲盐溶液中，37℃水浴加热1小时；取出猪牙髓，于4℃摇床上浸洗在350ml双蒸水中，15分钟×4次；取出猪牙髓，继续置于4℃摇床上，于含350ml 0.1％十二烷基硫酸钠的磷酸缓冲盐溶液中浸泡，12小时×4次；取出猪牙髓，4℃摇床上在350ml双蒸水中浸洗，每小时换液一次，直至浸洗液无泡，得到脱细胞牙髓基质。将脱细胞牙髓基质于-50℃、0.01mbar真空无菌冻干3天。使用研磨机将冻干后的脱细胞猪牙髓组织研磨成粉末，收集粉末，称重为0.6g。从冻干粉末中取出60mg，按照30mg:1mL的固液比将其溶解于2ml含有0.3％胃蛋白酶的0.1M盐酸溶液中，室温搅拌，每隔15min观察消化液状态，可见消化液粘度逐渐增加，9h 20min时粘度略微下降，将其置于4℃冰箱中暂停消化。加入5M氢氧化钠溶液滴定至pH＝7.0，用1M氢氧化钠溶液调至pH＝8.0失活胃蛋白酶，用1M盐酸溶液将pH调至7.4，加入230μl 10×DMEM培养基平衡离子强度。最后置于37℃恒温箱中1小时使其成胶，得到脱细胞牙髓基质水凝胶。

2、脱细胞牙髓基质水凝胶的效果验证

裸鼠皮下植入方法如下：

收取成人第三磨牙，制备厚度1-2mm的牙本质环，120℃高压蒸汽灭菌20min。无菌条件下，在髓腔内注入已调节pH和离子强度的1％脱细胞牙髓基质消化液或1％I型胶原液，置于37℃恒温箱中1h成胶后，将其植入4～6周雄性Balb/c nude小鼠背部皮下。植入4周和8周后取出牙片，4％多聚甲醛固定液中室温固定4h，EDTA脱钙液室温脱钙8周，梯度脱水，石蜡包埋切片，HE染色后显微镜下观察。结果如图7所示，注射脱细胞牙髓基质水凝胶的牙本质环于裸鼠皮下植入4周(A)和8周(B)，HE染色可见有类成牙本质细胞及血管形成；对照组为注射胶原的牙本质环于裸鼠皮下植入4周(C)和8周(D)，胶原组的新生血管数量明显减少(比例尺＝50μm)。染色结果显示脱细胞牙髓基质水凝胶组有类成牙本质细胞及血管形成，新生血管的数量较多，而胶原组可见新生的血管明显更少。

综上，现有技术多以牙髓细胞的培养、扩增等为目的，并未述及牙髓细胞外基质的分离及凝胶化利用，本发明首次通过将牙髓组织中的细胞成分去除获得牙髓细胞外基质，并对脱细胞效果进行鉴定，最大限度降低脱细胞牙髓基质的免疫原性，进一步通过pH、离子浓度以及温度的调控，使脱细胞牙髓基质发生凝胶化转变，利用脱细胞牙髓基质在凝胶化之前的流动性以及体温凝胶固化的特性，实现脱细胞牙髓基质在牙齿根管系统中的固位，重现天然牙髓的三维微纳结构，为牙髓再生提供稳定的局部微环境，为细胞提供合适的营养与再生信号，促进功能性牙髓再生，为牙髓病、根尖周病的治疗提供新思路。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种可注射生物水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将牙髓进行脱细胞处理，得脱细胞牙髓基质；

(2)脱细胞牙髓基质经干燥制粉，得脱细胞牙髓基质粉末；

(3)脱细胞牙髓基质粉末经酶解消化，得脱细胞牙髓基质消化液；

(4)调节脱细胞牙髓基质消化液的pH和离子强度，制得可注射生物水凝胶。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)将牙髓进行脱细胞处理的方法如下：将牙髓经胰酶酶解、洗涤得脱细胞牙髓基质。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤(3)脱细胞牙髓基质粉末经酶解消化的方法如下：

将脱细胞牙髓基质粉末按照(28～32)mg:1ml的固液比溶解于胃蛋白酶溶液，于室温、消化处理，至消化液的粘度不再增加，停止消化，收集脱细胞牙髓基质消化液。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤(4)调节脱细胞牙髓基质消化液的pH至7.0～7.5。

5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤(4)调节脱细胞牙髓基质消化液的pH的方法如下：

先将步骤(3)所得脱细胞牙髓基质消化液调节至碱性，促使胃蛋白酶失活，再加酸调节其pH至7.0～7.5。

6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤(4)通过向脱细胞牙髓基质消化液中加入10×DMEM培养基，以调节脱细胞牙髓基质消化液的离子强度。

7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述干燥为冷冻干燥。

8.一种可注射生物水凝胶，其特征在于，所述水凝胶由权利要求1～7任一项所述制备方法制得。

9.权利要求8所述水凝胶在制备促进牙髓再生与功能恢复的药物中的应用。

10.权利要求8所述水凝胶在制备治疗牙髓病、根尖周病药物中的应用。

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