CN106693070B - 一种用于牙周组织再生的膜状生物修复材料 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于牙周组织再生的膜状生物修复材料，其特征在于：将牙周膜脱细胞基质微粒与生物可降解聚合物或高分子材料混合后，通过静电纺丝工艺，得到生物可降解的静电纺丝纤维膜。本发明为改善牙周炎患者综合治疗的预后效果提供依据和新途径，从而为控制由于慢性牙周炎导致或加重的(如心血管疾病、糖尿病、肺部感染等)全身性疾病，为提高整个人群的健康水平提供一个有效手段和方法，有利于提高整个口腔公共卫生体系的效用和社会价值。

Description

一种用于牙周组织再生的膜状生物修复材料

技术领域

本发明涉及生物组织工程支架技术领域，具体地，涉及一种用于牙周组织再生的膜状生物修复材料。

背景技术

慢性牙周炎会导致牙龈炎症、牙周组织破坏、牙槽骨丢失，甚至牙齿脱落，是造成健康人失牙的最主要因素之一。2005年全国第三次口腔流行病学调查公布的数字显示，12岁未治疗的牙龈牙周疾病总患病率为69.0％，35～44岁牙龈牙周疾病的总患病率为97.2％，而67～74岁牙龈牙周疾病总患病率高达99.4％，同时调查显示，成年人群牙龈出血的比例高达77.3％。

牙周疾病不仅是引起成年人牙齿脱落的首要原因，更是影响心脏、肺、肾等重要脏器功能的重要诱因。据国外研究报道，牙周炎患者发生冠心病和中风的几率分别为牙周正常者的1.4倍和2.1倍。牙周炎患者发生慢性肺部感染及肺功能降低的几率是健康人的2倍。同时有研究报道：牙周病可引起细菌进入人体的血液循环，从而激活免疫细胞，而这些免疫细胞则能产生细胞因子，由此对全身健康产生破坏性的影响。

目前,临床治疗牙周疾病、获得牙周组织再生的方法，如应用屏障膜或骨替代材料引导性组织再生，通常不能实现已缺损牙周组织的完全再生，在恢复牙周组织的生理结构和功能上远未达到所期望的目标。

牙周膜和其他牙周支持组织的再生可以通过以支架材料为基础的治疗方法来实现。因此，必须把一些关键的因素联合起来，改进支架材料的性能使已丧失的牙周组织获得再生。

首先，需要有一定机械强度和血供的支架来为组织形成提供模板和营养源。随着静电纺丝技术和材料学的进展，许多生物可降解聚合物/高分子材料(聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、改良壳聚糖、胶原等)已成功用于电纺技术。但是其亲水性和生物相容性略差，细胞很难迁移至材料内部，影响了临床应用的前景。

牙周膜细胞是牙周组织修复的主要细胞来源。收集口腔治疗中拔除的牙齿，如：正畸治疗需要拔除的牙齿、无法治疗保留的残根残冠、智齿等，通过同源性牙周膜细胞的体外培养和扩增，是一种不需要额外创伤、获得脱细胞基质原料的有效途径。

基于高分子材料具有的良好机械性能和可降解性能，我们将其与同源性(人来源)牙周膜脱细胞基质微粒和电纺技术相结合，开发一种机械性能和生物相容性好、早期可以促进自体牙周组织长入、不容易引起免疫排斥反应的可降解牙周修复材料，为临床牙周修复再生提供新的思路。

发明内容

本发明旨在为改善牙周炎患者综合治疗的预后效果提供依据和新途径，从而为控制由于慢性牙周炎导致或加重的(如心血管疾病、糖尿病、肺部感染等)全身性疾病，为提高整个人群的健康水平提供一个有效手段和方法，有利于提高整个口腔公共卫生体系的效用和社会价值。

本发明提供的一种用于牙周组织再生的膜状生物修复材料，其特征在于：将牙周膜脱细胞基质微粒与生物可降解聚合物或高分子材料混合后，通过静电纺丝工艺，得到静电纺丝纤维膜。

在本发明中，牙周膜脱细胞基质微粒与生物可降解聚合物/高分子材料可以分别或混合后溶解于溶剂中的形成溶液、胶质、悬浮液、分散液等液体混合物，再进行混合。

该溶剂可以选自静电纺丝技术中常用溶剂，如：N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、四氢呋喃、乙醇、甲醇、丙酮、二氯甲烷、氯仿、丙酮、二乙醇二甲醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、二甲基亚砜等等溶剂、六氟异丙醇、各类培养液等。

该牙周膜脱细胞基质微粒与生物可降解聚合物/高分子材料可分别分散于相同或不同的溶剂中。当牙周膜脱细胞基质微粒与生物可降解聚合物或高分子材料为液体混合物时，该牙周膜脱细胞基质微粒与所述生物可降解聚合物或高分子材料总和的质量浓度为5-20％，优选为8-15％。

进一步地，在本发明的一种用于牙周组织再生的膜状生物修复材料，还具有这样的特点：即、上述牙周膜脱细胞基质微粒占膜状生物修复材料的总质量的25-75％；

上述生物可降解聚合物或高分子占膜状生物修复材料的总质量的75-25％。

此处，可知纯溶质(牙周膜脱细胞基质微粒：生物可降解聚合物/高分子材料)的质量比，也可以为液体混合物的质量比。

进一步地，在本发明的一种用于牙周组织再生的膜状生物修复材料，还具有这样的特点：该生物可降解高分子材料选自可降解人工合成聚酯类聚合物或天然生物可降解高分子材料中的一种或多种的混合物。

进一步地，在本发明的一种用于牙周组织再生的膜状生物修复材料，还具有这样的特点：该生物可降解聚合物或高分子材料选自聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、改良壳聚糖、胶原中的一种或多种的混合物。

进一步地，在本发明的一种用于牙周组织再生的膜状生物修复材料，还具有这样的特点：即、该牙周膜脱细胞基质微粒的生产方法如下所示：

步骤一、获取牙齿；

步骤二、通过体外分离、培养牙周膜细胞；

步骤三、通过细胞体外扩增技术，获得细胞膜片；

步骤四、通过脱细胞技术，将细胞膜片制备形成牙周膜脱细胞基质薄片；

步骤五、通过酶消化技术，将牙周膜脱细胞基质薄片形成牙周膜脱细胞基质微粒。

此外，在上述步骤三和步骤四之间，还具有如下步骤：

将步骤三获得的细胞膜片经局聚作用，通过体外灌注的方式培养形成聚合物，将该聚合物粉碎为微粒后进行步骤四的工序。

通过上述步骤可获得细胞基质含量更高、数量更多的微粒。

进一步地，在本发明的一种用于牙周组织再生的膜状生物修复材料，还具有这样的特点：即、牙齿选自口腔治疗中拔除的牙齿。如：口腔正畸治疗需要拔除的牙齿；口腔外科需拔除的阻生齿、埋伏牙；无法通过口腔内科治疗保留的残根、残冠；无法通过牙周治疗保留的牙齿等，无需额外创伤即可获取的牙齿。

进一步地，在本发明的一种用于牙周组织再生的膜状生物修复材料，还具有这样的特点：即、在该步骤三的过程中，可通过在细胞培养液中添加维生素等营养物质，来获得富含细胞和细胞外基质的细胞膜片；

该营养物质包含有维生素；该维生素的添加量为50-200μg/ml。

进一步地，在本发明的一种用于牙周组织再生的膜状生物修复材料，还具有这样的特点：即、该膜状生物修复材料能够很好地模拟人牙周组织的细胞外基质成分和结构，在牙周组织修复和牙周组织再生过程中，有利于原位细胞的黏附、增殖和分化，起到诱导牙周组织再生的作用。

本发明的作用和效果：

在本发明的研究中发现，将同源性来源(如：人体)的种子细胞(间充质干细胞，如：牙周膜干细胞)应用于组织再生，能够更好的模拟细胞外基质的组成成分和结构，有利于诱导细胞粘附和增殖，为了细胞生长和组织再生提供较好的生理微环境。

基于上述选用同源性脱细胞基质作为修复材料修复相应组织效果较好的考虑，在本发明涉及的用于牙周组织再生的膜状生物的修复材料的选择上，显然将口腔治疗中需要拔除的牙齿获得的种子细胞用于组织再生研究，将牙周膜脱细胞基质微粒作为符合支架的生物性材料来源用于制造用于牙周组织再生的膜状生物的修复材料，使其被应用于牙周组织再生时，将具有先天的优势。

具体地，当将该牙周膜脱细胞基质微粒与高分子材料和静电纺丝技术相结合时，基于高分子材料具有的良好的生物学性质和可降解性能，将其与牙周膜脱细胞基质微粒结合后，获得的生物修复材料能弥补高分子材料在水溶性和生物相容性上面的不足，从而获得一种能模拟正常的细胞外基质的结构的修复材料。

此外，在本发明中，采用从拔除的牙齿中分离培养出牙周膜细胞后经体外扩增、脱细胞、酶消化等过程来获得支架材料之一的牙周膜脱细胞基质微粒，该方法是一种不需要额外创伤即可获得种子细胞的有效途径，故而，具有实际的可操作性和现实意义。

此外，出于对支架的力学结构、生物性能等的考虑，还可通过调整脱细胞基质微粒和高分子材料组分的比例来实现更好地模拟人牙周组织的细胞外基质成分、结构、生物相容性等。

此外，通过本发明制备得到的支架材料生物降解性能佳，且降解产物完全无害，是一种绿色、环保、安全的材料。

附图说明

图1、用于牙周组织再生的膜状生物修复材料构建示意图。

具体实施方式

实施例一、

如图1所示，在本实施例中，为了利于牙周组织修复和牙周组织再生，构建了一种用于牙周组织再生的生物修复材料，具体构建方法如下所示：

步骤一、获取牙周膜脱细胞基质微粒：

(1)从治疗中获取的牙齿上取出牙周膜细胞；

(2)利用细胞体外扩增技术，通过在细胞培养液中添加适量VitC(AA)，形成富含胞外基质的细胞膜片；

(3)利用脱细胞技术，将细胞膜片制备形成牙周膜脱细胞基质薄片；

(4)将牙周膜脱细胞基质薄片，利用酶消化技术，形成牙周膜脱细胞基质微粒。

收集因正畸需要拔除的健康前磨牙，用手术刀片刮取根的牙周膜，接种于T25培养瓶，加入含15％胎牛血清的α-MEM培养液，待组织块贴壁后缓慢翻转培养瓶，标准环境(37℃，5％CO₂，95％空气，饱和湿度)静置培养。每3d换液1次，细胞生长至局部汇合时，胰酶(pH＝6.4)消化传代，标记为原代牙周膜细胞，传代培养。

然后，将第三代牙周膜细胞制成单细胞悬液，按照2.5*10⁴/cm²密度接种于培养皿，静息24小时后，在完全培养基中加入50μg/ml维生素C(此外，根据需要，该维生素的含量还可以为50-200μg/ml不等；另外，还可以加入10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10^-8mol/L地塞米松等)，培养牙周膜干细胞1.5-2周形成细胞膜片。

将经上述扩增获得的细胞膜片用PBS漂洗三次，加入含0.5-1％Triton X-100的一水合氨(浓度20mM)，常温下振荡24小时，每8小时换液一次；PBS漂洗三次，加入含DNA酶和RNA酶的CaCl₂/MgCl₂溶液中，在37℃下振荡24小时，每8小时换液一次；PBS漂洗三次,冻干处理，制得牙周膜脱细胞基质薄片。

收集冻干的牙周膜脱细胞基质薄片，研磨后溶解于1mg/ml蛋白酶溶液中，调整牙周膜脱细胞基质的浓度为5～10mg/ml，均浆机粉碎后，常温下振荡至肉眼看不到颗粒(即、均质溶液状态)，调整pH值调整为7.4，再进行冻干处理，得到牙周膜脱细胞基质微粒。

步骤二、静电纺丝纤维膜的制备：

将上述牙周膜脱细胞基质微粒与聚己内酯(或聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、改良壳聚糖、胶原中的一种或几种)混合，加入到三氯甲烷中，其中，牙周膜脱细胞基质微粒与聚已内酯的质量之和为共混液质量的10％(根据需要可以为5-20％不等)，且聚己内酯的质量与牙周膜脱细胞基质微粒质量比为1:1(根据需要该质量比可以为1:3、1:2、2:1或3:1不等)，在室温下置于磁力搅拌器上搅拌3小时至溶液呈无色透明黏稠状，制得纺丝液。在常温常压环境，将纺丝液加入纺丝管中，调节喷丝口与接收板的距离为15cm，电场强度为15kV，以10.7ml/h的流速进行静电纺丝，制得聚己内酯/牙周膜脱细胞基质微粒混合的静电纺丝支架。

实施例二、

在本实施例中，为了利于牙周组织修复和牙周组织再生，构建了一种用于牙周组织再生的生物修复材料，具体构建方法如下所示：

步骤一、获取牙周膜脱细胞基质微粒：

(1)从治疗中获取的牙齿上取出牙周膜细胞；

(2)利用细胞体外扩增技术，通过在细胞培养液中添加适量VitC(AA)，形成富含胞外基质的细胞膜片；

(3)利用脱细胞技术，将细胞膜片制备形成牙周膜脱细胞基质薄片；

(4)将牙周膜脱细胞基质薄片，利用酶消化技术，形成牙周膜脱细胞基质微粒。

收集因正畸需要拔除的健康前磨牙，用手术刀片刮取根的牙周膜，接种于T25培养瓶，加入含15％胎牛血清的α-MEM培养液，待组织块贴壁后缓慢翻转培养瓶，标准环境(37℃，5％CO₂，95％空气，饱和湿度)静置培养。每3d换液1次，细胞生长至局部汇合时，胰酶(pH＝6.4)消化传代，标记为原代牙周膜细胞。将原代牙周膜细胞制成单细胞悬液并稀释至密度为10个/ml，100μL/孔接种于96孔板，每孔约含1个细胞；细胞贴壁后在倒置显微镜下观察，挑选单细胞孔，标记后补加100μL完全培养基(含10％胎牛血清、1％双抗的α-MEM培养液)，待孔中细胞生长至占孔底面积1/3～1/2状态时，消化传代，标记为第一代牙周膜干细胞。

然后，将第三代牙周膜干细胞制成单细胞悬液，按照2.5*10⁴/cm²密度接种于培养皿，静息24小时后，在完全培养基中加入50μg/ml维生素C(此外，根据需要，该维生素的含量还可以为50-200μg/ml不等；另外，还可以加入10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10^-8mol/L地塞米松等)，培养牙周膜干细胞1.5-2周形成细胞膜片。

将经上述扩增获得的细胞膜片用PBS漂洗三次，加入含0.5-1％Triton X-100的一水合氨(浓度20mM)，常温下振荡24小时，每8小时换液一次；PBS漂洗三次，加入含DNA酶和RNA酶的CaCl₂/MgCl₂溶液中，在37℃下振荡24小时，每8小时换液一次；PBS漂洗三次,冻干处理，制得牙周膜脱细胞基质薄片。

收集冻干的牙周膜脱细胞基质薄片，研磨后溶解于1mg/ml蛋白酶溶液中，调整牙周膜脱细胞基质的浓度为5～10mg/ml，均浆机粉碎后，常温下振荡至肉眼看不到颗粒(即、均质溶液状态)，调整pH值调整为7.4，再进行冻干处理，得到牙周膜脱细胞基质微粒。

步骤二、静电纺丝纤维膜的制备：

将上述牙周膜脱细胞基质微粒与聚己内酯(或聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、改良壳聚糖、胶原中的一种或几种)混合，加入到三氯甲烷中，其中，牙周膜脱细胞基质微粒与聚已内酯的质量之和为共混液质量的5％(根据需要可以为8％不等)，且聚己内酯的质量与牙周膜脱细胞基质微粒质量比为1:1，在室温下置于磁力搅拌器上搅拌3小时至溶液呈无色透明黏稠状，制得纺丝液。在常温常压环境，将纺丝液加入纺丝管中，调节喷丝口与接收板的距离为15cm，电场强度为15kV，以10.7ml/h的流速进行静电纺丝，制得聚己内酯/牙周膜脱细胞基质微粒混合的静电纺丝支架。

实施例三、

在本实施例中，为了利于牙周组织修复和牙周组织再生，构建了一种用于牙周组织再生的生物修复材料，具体构建方法如下所示：

步骤一、获取牙周膜脱细胞基质微粒：

(1)从治疗中获取的牙齿上取出牙周膜细胞；

(2)利用细胞体外扩增技术，通过在细胞培养液中添加适量VitC(AA)，形成富含胞外基质的细胞膜片；

(3)利用脱细胞技术，将细胞膜片制备形成牙周膜脱细胞基质薄片；

(4)将牙周膜脱细胞基质薄片，利用酶消化技术，形成牙周膜脱细胞基质微粒。

收集因正畸需要拔除的健康前磨牙，用手术刀片刮取根的牙周膜，接种于T25培养瓶，加入含15％胎牛血清的α-MEM培养液，待组织块贴壁后缓慢翻转培养瓶，标准环境(37℃，5％CO₂，95％空气，饱和湿度)静置培养。每3d换液1次，细胞生长至局部汇合时，胰酶(pH＝6.4)消化传代，标记为原代牙周膜细胞，传代培养。

然后，将第三代牙周膜细胞制成单细胞悬液，按照2.5*10⁴/cm²密度接种于培养皿，静息24小时后，在完全培养基中加入50μg/ml维生素C(此外，根据需要，该维生素的含量还可以为50-200μg/ml不等；另外，还可以加入10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10^-8mol/L地塞米松等)，培养牙周膜干细胞1.5-2周形成细胞膜片。

收集细胞膜片聚合培养，经体外灌注培养形成聚合物(cell pellet)，无菌条件下剪成1*1cm²大小的片状，将获得的片状细胞聚合物用PBS漂洗三次，加入含0.5-1％TritonX-100的一水合氨(浓度20mM)，常温下振荡24小时，每8小时换液一次；PBS漂洗三次，加入含DNA酶和RNA酶的CaCl₂/MgCl₂溶液中，在37℃下振荡24小时，每8小时换液一次；PBS漂洗三次,冻干处理，制得牙周膜脱细胞基质薄片。

收集冻干的牙周膜脱细胞基质薄片，研磨后溶解于1mg/ml蛋白酶溶液中，调整牙周膜脱细胞基质的浓度为5～10mg/ml，均浆机粉碎后，常温下振荡至肉眼看不到颗粒(即、均质溶液状态)，调整pH值调整为7.4，再进行冻干处理，得到牙周膜脱细胞基质微粒。

步骤二、静电纺丝纤维膜的制备：

将上述牙周膜脱细胞基质微粒与聚己内酯(或聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、改良壳聚糖、胶原中的一种或几种)混合，加入到三氯甲烷中，其中，牙周膜脱细胞基质微粒与聚已内酯的质量之和为共混液质量的20％，且聚己内酯的质量与牙周膜脱细胞基质微粒质量比为1:1，在室温下置于磁力搅拌器上搅拌3小时至溶液呈无色透明黏稠状，制得纺丝液。在常温常压环境，将纺丝液加入纺丝管中，调节喷丝口与接收板的距离为15cm，电场强度为15kV，以10.7ml/h的流速进行静电纺丝，制得聚己内酯/牙周膜脱细胞基质微粒混合的静电纺丝支架。

Claims (3)

1.一种用于牙周组织再生的膜状生物修复材料的制造方法，其特征在于：

步骤一、获取牙周膜脱细胞基质微粒：

收集因正畸需要拔除的健康前磨牙，用手术刀片刮取根的牙周膜，接种于T25培养瓶，加入含15％胎牛血清的α-MEM培养液，待组织块贴壁后缓慢翻转培养瓶，37℃，5％CO₂，95％空气，饱和湿度的标准环境静置培养，每3d换液1次，细胞生长至局部汇合时，pH＝6.4的胰酶消化传代，标记为原代牙周膜细胞，传代培养；

然后，将第三代牙周膜细胞制成单细胞悬液，按照2.5*10⁴/cm²密度接种于培养皿，静息24小时后，在完全培养基中加入50-200μg/ml维生素C，另外，还加入10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10^-8mol/L地塞米松，培养牙周膜干细胞1.5-2周形成细胞膜片；

将经上述扩增获得的细胞膜片用PBS漂洗三次，加入含0.5-1％Triton X-100的浓度为20mM的一水合氨，常温下振荡24小时，每8小时换液一次；PBS漂洗三次，加入含DNA酶和RNA酶的CaCl₂/MgCl₂溶液中，在37℃下振荡24小时，每8小时换液一次；PBS漂洗三次,冻干处理，制得牙周膜脱细胞基质薄片；

收集冻干的牙周膜脱细胞基质薄片，研磨后溶解于1mg/ml蛋白酶溶液中，调整牙周膜脱细胞基质的浓度为5～10mg/ml，均浆机粉碎后，常温下振荡至肉眼看不到颗粒，调整pH值调整为7.4，再进行冻干处理，得到牙周膜脱细胞基质微粒；

步骤二、静电纺丝纤维膜的制备：

将上述牙周膜脱细胞基质微粒，与聚己内酯进行混合，加入到三氯甲烷中，其中，牙周膜脱细胞基质微粒与聚己内酯的质量之和为共混液质量的5-20％，且聚己内酯的质量与牙周膜脱细胞基质微粒质量比为1:1、1:3、1:2、2:1或3:1，在室温下置于磁力搅拌器上搅拌3小时至溶液呈无色透明黏稠状，制得纺丝液；

在常温常压环境，将纺丝液加入纺丝管中，调节喷丝口与接收板的距离为15cm，电场强度为15kV，以10.7ml/h的流速进行静电纺丝，制得聚己内酯/牙周膜脱细胞基质微粒混合的静电纺丝支架。

2.一种用于牙周组织再生的膜状生物修复材料的制造方法，其特征在于：

步骤一、获取牙周膜脱细胞基质微粒：

收集因正畸需要拔除的健康前磨牙，用手术刀片刮取根的牙周膜，接种于T25培养瓶，加入含15％胎牛血清的α-MEM培养液，待组织块贴壁后缓慢翻转培养瓶，37℃，5％CO₂，95％空气，饱和湿度的标准环境静置培养，每3d换液1次，细胞生长至局部汇合时，pH＝6.4的胰酶消化传代，标记为原代牙周膜细胞；

将原代牙周膜细胞制成单细胞悬液并稀释至密度为10个/ml，100μL/孔接种于96孔板，每孔含1个细胞；细胞贴壁后在倒置显微镜下观察，挑选单细胞孔，标记后补加100μL的含10％胎牛血清、1％双抗的α-MEM培养液的完全培养基，待孔中细胞生长至占孔底面积1/3～1/2状态时，消化传代，标记为第一代牙周膜干细胞；

然后，将第三代牙周膜干细胞制成单细胞悬液，按照2.5*10⁴/cm²密度接种于培养皿，静息24小时后，在完全培养基中加入50-200μg/ml维生素C，另外，还加入10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10^-8mol/L地塞米松，培养牙周膜干细胞1.5-2周形成细胞膜片；

将经上述扩增获得的细胞膜片用PBS漂洗三次，加入含0.5-1％Triton X-100的浓度为20mM的一水合氨，常温下振荡24小时，每8小时换液一次；PBS漂洗三次，加入含DNA酶和RNA酶的CaCl₂/MgCl₂溶液中，在37℃下振荡24小时，每8小时换液一次；PBS漂洗三次,冻干处理，制得牙周膜脱细胞基质薄片；

收集冻干的牙周膜脱细胞基质薄片，研磨后溶解于1mg/ml蛋白酶溶液中，调整牙周膜脱细胞基质的浓度为5～10mg/ml，均浆机粉碎后，常温下振荡至肉眼看不到颗粒，调整pH值调整为7.4，再进行冻干处理，得到牙周膜脱细胞基质微粒；

步骤二、静电纺丝纤维膜的制备：

将上述牙周膜脱细胞基质微粒，与聚己内酯进行混合，加入到三氯甲烷中，其中，牙周膜脱细胞基质微粒与聚己内酯的质量之和为共混液质量的5％或8％，且聚己内酯的质量与牙周膜脱细胞基质微粒质量比为1:1，在室温下置于磁力搅拌器上搅拌3小时至溶液呈无色透明黏稠状，制得纺丝液；

在常温常压环境，将纺丝液加入纺丝管中，调节喷丝口与接收板的距离为15cm，电场强度为15kV，以10.7ml/h的流速进行静电纺丝，制得聚己内酯/牙周膜脱细胞基质微粒混合的静电纺丝支架。

3.一种用于牙周组织再生的膜状生物修复材料的制造方法，其特征在于：

步骤一、获取牙周膜脱细胞基质微粒：

收集因正畸需要拔除的健康前磨牙，用手术刀片刮取根的牙周膜，接种于T25培养瓶，加入含15％胎牛血清的α-MEM培养液，待组织块贴壁后缓慢翻转培养瓶，37℃，5％CO₂，95％空气，饱和湿度的标准环境静置培养，每3d换液1次，细胞生长至局部汇合时，pH＝6.4的胰酶消化传代，标记为原代牙周膜细胞，传代培养；

然后，将第三代牙周膜细胞制成单细胞悬液，按照2.5*10⁴/cm²密度接种于培养皿，静息24小时后，在完全培养基中加入50-200μg/ml维生素C，另外，还加入10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10^-8mol/L地塞米松，培养牙周膜干细胞1.5-2周形成细胞膜片；

收集细胞膜片聚合培养，经体外灌注培养形成聚合物，无菌条件下剪成1*1cm²大小的片状，将获得的片状细胞聚合物用PBS漂洗三次，加入含0.5-1％Triton X-100的浓度为20mM的一水合氨，常温下振荡24小时，每8小时换液一次；PBS漂洗三次，加入含DNA酶和RNA酶的CaCl₂/MgCl₂溶液中，在37℃下振荡24小时，每8小时换液一次；PBS漂洗三次,冻干处理，制得牙周膜脱细胞基质薄片；

收集冻干的牙周膜脱细胞基质薄片，研磨后溶解于1mg/ml蛋白酶溶液中，调整牙周膜脱细胞基质的浓度为5～10mg/ml，均浆机粉碎后，常温下振荡至肉眼看不到颗粒，调整pH值调整为7.4，再进行冻干处理，得到牙周膜脱细胞基质微粒；

步骤二、静电纺丝纤维膜的制备：

将上述牙周膜脱细胞基质微粒，与聚己内酯进行混合，加入到三氯甲烷中，其中，牙周膜脱细胞基质微粒与聚聚己内酯内酯的质量之和为共混液质量的20％，且聚己内酯的质量与牙周膜脱细胞基质微粒质量比为1:1，在室温下置于磁力搅拌器上搅拌3小时至溶液呈无色透明黏稠状，制得纺丝液；

在常温常压环境，将纺丝液加入纺丝管中，调节喷丝口与接收板的距离为15cm，电场强度为15kV，以10.7ml/h的流速进行静电纺丝，制得聚己内酯/牙周膜脱细胞基质微粒混合的静电纺丝支架。

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