KR20090017528A

KR20090017528A - 치주 연조직 재생용 조성물 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR20090017528A
Application number: KR1020087028248A
Authority: KR
Inventors: 요이치 야마다; 미노루 우에다; 가즈토 오카베; 도모유키 고우고
Original assignee: 고쿠리츠 다이가쿠 호우징 나고야 다이가쿠
Priority date: 2006-04-19
Filing date: 2007-04-19
Publication date: 2009-02-18
Also published as: JPWO2007129453A1; JP5263826B2; KR101457231B1; CN101472622B; US20090274627A1; BRPI0710174A2; CN101472622A; WO2007129453A1

Abstract

치주 연조직을 저침습적으로 재생하기 위한 조성물 및 그 조성물의 제조 방법을 제공하는 것을 하나의 목적으로 한다. 미분화·간세포 및 잇몸 형성능을 갖는 아세포에서 선택되는 세포와 매트릭스 재료와 혈소판 혈장을 함유하도록, 치주 연조직 재생용 조성물을 조제한다. 이 조성물에 의하면, 저침습이고 또한 부착 잇몸뿐만 아니라 유리 잇몸도, 효과적이고 또한 양호한 심미성으로 재생할 수 있다.

Description

치주 연조직 재생용 조성물 및 그 제조 방법{COMPOSITION FOR REGENERATION OF PERIODONTAL SOFT TISSUE AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME}

본 발명은, 치주 조직 중 연조직의 재생에 사용하는 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

최근, 치주병 등에 대해 여러 가지의 구강 내외과적인 치료가 실시되고 있다. 치주병에 있어서는, 질환 그 자체나 외과적 치료에 의해 치주 조직 일부가 퇴축 또는 결손되는 경우가 있는데, 치료 후의 기능성이나 심미성을 확보하는 관점에서, 이러한 치주 조직을 수복·재생하는 요청이 높아지고 있다.

치주 조직은, 치아를 지지하는 치조골 등의 경조직과 잇몸 등의 연조직으로 구성되어 있다. 도 1 에 나타내는 바와 같이, 치주 조직 중 연조직으로는, 치조골에 지지된 부착 잇몸과 이러한 경조직에 지지되지 않은 유리(遊離) 잇몸이 있다.

치주 조직의 수복·재생으로는, 예를 들어 치조골이나 그 결합 부위의 재생에 관하여, 골아 세포 등의 세포를 이식하는 것에 의한 재생 방법이 개시되어 있다 (일본 공개특허공보 2004-201612호, 일본 공개특허공보 2004-497호). 또, 잇몸과 치근 사이에 치주 조직이 재생되기 위한 스페이스를 형성하여 새로운 결합 조직 부착, 치조골 및 결합 조직 등의 재생을 촉진하는 GTR (Guided Tissue Regeneration) 법이나 어린 돼지의 치배 (齒胚) 로부터 채취한 에나멜 매트릭스 단백질을 함유하는 치주 조직 재생 유도 재료 (엠드게인 (상품명), 생화학 공업 주식회사 제조) 를 사용하는 수법 등이 알려져 있다.

또, 잇몸 조직을 수복하는 방법으로서, 환자의 구강내 또는 다른 조직으로부터, 결합 조직편이나 상피 조직편을 채취하여 그것을 이식하거나, 잇몸을 봉합함으로써 노출된 근면 (根面) 등을 피복한다는 수법이 이용되고 있다.

발명의 개시

치주 조직 중에서도 잇몸 등의 연조직은, 심미적 관점에서의 수복이나 재생 요청이 크다. 그 중에서도, 유리 잇몸인 근연 (近緣) 잇몸 및 치간 유두부 잇몸은 치열 및 치경의 심미성에 크게 영향을 미친다 (도 1 참조). 특히, 치간 유두부가 퇴축됨으로써 생긴 공극은 블랙 트라이앵글이라고 불리며, 치열 및 치경의 외관은 현저하게 저해된다. 또, 이러한 유리 잇몸은, 치주병 외에 잘못된 오랄 케어에 의해서도 퇴축되고, 일정 기간 이상 유리 잇몸의 퇴축이 방치된 경우에는 유리 잇몸의 자연스러운 재생이 곤란해진다.

그러나, 상기 특허 문헌 1 및 2 는, 기능적으로 우선도가 높은 치조골 등의 경조직의 재생을 목적으로 한 것이며, 또 GTR 법이나 상기 치주 조직 재생 유도 재료를 이용해도 동일하여, 잇몸 조직을 충분히 회복할 수 있는 것은 아니었다. 또, 상기 조직편 이식법은, 그 조직편의 채취 및 이식에 있어서의 침습성이 문제인 것 외에, 충분한 심미성이 얻어지지 않는 경우도 있었다.

이상으로부터, 치주 연조직에 대해 저침습의 재생 방법은 현재 검토도 되어 있지 않고 또 알아내지도 못했다. 또, 치간 유두부 등의 유리 잇몸에 대해서도 효과적인 재생 방법은 검토되어 있지 않고 또 알아내지 못했다.

그래서, 본 발명은, 치주 연조직을 저침습적으로 재생하기 위한 조성물 및 그 조성물의 제조 방법을 제공하는 것을 하나의 목적으로 한다. 또, 본 발명은, 치간 유두부 등의 유리 잇몸을 효과적으로 재생하기 위한 이식용 조성물 및 그 조성물의 제조 방법을 제공하는 것을 다른 하나의 목적으로 한다. 심미성이 높은 치경을 재생하기 위한 조성물 및 그 조성물의 제조 방법을 제공하는 것을 다른 하나의 목적으로 한다.

본 발명자들은, 치주 연조직의 부착 잇몸이나 재생이 곤란하다고 여겨지는 근연 잇몸 및 치간 유두부 잇몸 등의 유리 잇몸의 재생에 있어서, 간엽계 간(幹)세포 및 섬유아세포를 사용한 재생 수법을 검토했는데, 이들 세포를 매트릭스 재료와 함께 재생시키고자 하는 연조직 부위에 주입함으로써, 치주 연조직을 효과적으로 재생할 수 있는 것을 알아내어 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명에 의하면, 상기한 과제 중 적어도 하나를 해결할 수 있는 이하의 수단이 제공된다.

본 발명에 의하면, 간엽계 간세포 및 잇몸 섬유아세포에서 선택되는 세포와, 매트릭스 재료를 함유하는 치주 연조직 재생용 조성물이 제공된다. 본 발명의 조성물에 있어서는, 세포 증식 인자를 포함할 수도 있다. 본 발명의 조성물에 있어서, 상기 치주 연조직은 부착 잇몸이어도 되고, 유리 잇몸이어도 되고, 유리 잇몸은 치간 유두부 잇몸이어도 된다. 또한, 본 발명의 조성물은, 치주 조직 국소 주입용으로 할 수 있다. 또, 상기 치주 연조직은 치간 유두부이어도 된다.

또, 본 발명의 조성물은, 상기 매트릭스 재료는, 이하의 (a)∼(d) :

(a) 히알루론산 및 그 유도체

(b) 콜라겐 및 그 유도체

(c) 피브린 및 피브리노겐

(d) 혈장 및 혈소판

에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상을 포함할 수 있다. 또, 상기 매트릭스 재료는, 적어도 상기 (a) 의 히알루론산 및 그 유도체에서 선택되어도 된다. 이 양태에 있어서, 상기 세포는 간엽계 간세포이어도 된다. 상기 매트릭스 재료는, 적어도 상기 (b) 의 콜라겐 및 그 유도체에서 선택되어도 된다. 이 양태에 있어서, 상기 세포는 잇몸 섬유아세포이어도 된다.

또, 상기 매트릭스 재료는, 적어도 상기 (d) 의 혈장 및 혈소판에서 선택되어도 된다. 또한, 상기 매트릭스 재료는, 상기 (a) 의 히알루론산 및 그 유도체, 및 상기 (d) 의 혈장 및 혈소판의 각각에서 선택되어도 된다. 이 양태에 있어서는, 상기 세포는 간엽계 간세포로 할 수 있다. 또한, 상기 매트릭스 재료는, 상기 (b) 의 콜라겐 및 그 유도체, 및 상기 (d) 의 혈장 및 혈소판의 각각에서 선택되어도 된다. 또한, 상기 (d) 의 혈장 및 혈소판의 매트릭스 재료는 다혈소판 혈장으로 할 수 있다.

본 발명에 의하면, 간엽계 간세포 및 잇몸 섬유아세포에서 선택되는 세포를 배양하는 공정과, 그 배양된 간엽계 간세포 및/또는 잇몸 섬유아세포와 매트릭스 재료를 혼합하는 공정을 구비하는 치주 연조직 재생용 조성물의 제조 방법이 제공된다. 본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 세포는 간엽계 간세포 또는 잇몸 섬유아세포로 할 수 있다. 또한, 상기 치주 연조직은 부착 잇몸이어도 되고, 상기 치주 연조직은 유리 잇몸이어도 된다. 또, 상기 치주 연조직은 치간 유두부이어도 된다.

또, 상기 혼합 공정은 상기 매트릭스 재료로서 이하의 (a)∼(d) :

(a) 히알루론산 및 그 유도체

(b) 콜라겐 및 그 유도체

(c) 피브린 및 피브리노겐

(d) 혈장 및 혈소판

에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상을 사용하는 공정이어도 된다. 또한, 상기 혼합 공정은, 상기 매트릭스 재료로서 적어도 상기 (a) 의 히알루론산 및 그 유도체에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상을 사용하는 공정으로 할 수 있다. 또, 상기 혼합 공정은, 상기 세포로서의 상기 잇몸 섬유아세포를 사용하고, 상기 매트릭스 재료로서 적어도 상기 (b) 콜라겐 및 그 유도체에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상을 사용하는 공정으로 할 수도 있다. 또한, 상기 혼합 공정은, 상기 매트릭스 재료로서 적어도 상기 (d) 의 혈장 및 혈소판으로서 다혈소판 혈장을 사용하는 공정으로 할 수도 있다.

도 1 은 잇몸 주변 조직의 모식도이다.

도 2 는 본 발명의 조성물의 피하 주입 부위 (융기 부위) 의 계측 지점의 모식도이다.

도 3 은 누드마우스 등부에 시험액을 주입하여 형성된 주입 부위의 높이의 시간 경과 변화 (수술후 0 일째, 6 일째 및 12 일째) 를 나타내는 그래프도이다.

도 4 는 누드마우스 등부에 시험액을 주입하여 형성된 주입 부위의 체적의 시간 경과 변화 (수술후 0 일째, 6 일째 및 12 일째) 를 나타내는 그래프도이다.

도 5 는 누드마우스 등부에 시험액을 주입하여 형성된 주입 부위의 장경의 시간 경과 변화 (수술후 0 일째, 6 일째 및 12 일째) 를 나타내는 그래프도이다.

도 6 은 누드마우스 등부에 시험액을 주입하여 형성된 주입 부위의 단경의 시간 경과 변화 (수술후 0 일째, 6 일째 및 12 일째) 를 나타내는 그래프도이다.

도 7 은 실시예 4 의 남성 환자에 있어서의 치간 유두부 잇몸 재생 경과를 나타내는 도면이다. a 는 수술전, b 는 수술 직후, c 는 수술후 1 주일 및 d 는 수술후 3 개월에 있어서의 치간 유두부를 나타낸다.

도 8 은 실시예 3 에 있어서의 마우스 융기부의 조직 현미경 사진을 나타내는 도면이다. a 는 HE 염색에 의한 현미경 사진 화상 (40 배) 을 나타내고, b 는 HE 염색에 의한 현미경 사진 화상 (400 배) 을 나타내고, c 는 형광 염색에 의한 현미경 사진 화상을 나타낸다. c 에 있어서, 오렌지색은 이식한 MSC 를 나타내고, 청색은 핵을 나타내고, 녹색은 생성된 콜라겐을 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 치주 연조직 재생용 조성물은, 간엽계 간세포 및 잇몸 섬유아세포에서 선택되는 세포와, 매트릭스 재료를 함유하는 것을 특징으로 하고 있다. 본 발명의 치주 연조직 재생용 조성물에 의하면, 이식용 조직의 채취 및 이식에 수반되는 환자의 부담을 회피하여 저침습적인 치주 연조직의 재생이 가능해진다. 또, 본 발명의 조성물에 의하면, 종래 곤란했던 유리 잇몸의 재생이 가능해져 심미성이 양호한 치경을 용이하게 재생할 수 있다.

또, 본 조성물은 치간 유두부의 재생에 유용하다. 치간 유두부는 염증이 생기기 쉬워 잇몸의 퇴축 등에 의해 용이하게 공극이 생기기 쉬운 반면, 치간부는 유리 이식이나 유경변 (有莖弁) 이식을 실시하기 위해서는 스페이스가 좁고, 이식편에 대한 혈액 공급이 충분하지 않은 것 및 치근이나 치관에 둘러싸여 제한되어 있기 때문에, 수술 조작이 곤란했다. 그러나, 본 발명에 의하면, 본 조성물을 치주 조직에 주입함으로써, 치조골이나 잇몸의 이식 등을 실시하지 않고 용이하게 치간 유두부를 재생할 수 있다.

이하, 본 발명의 실시형태인 치주 연조직 재생용 조성물 및 그 제조 방법 등에 대해 설명한다.

(치주 연조직 재생용 조성물)

본 발명의 치주 연조직 재생용 조성물 (이하, 간단히 본 조성물이라고도 한다) 은, 간엽계 간세포 및 잇몸 섬유아세포에서 선택되는 세포와, 매트릭스 재료를 함유하고 있다. 본 조성물은, 인간 및 비인간 포유류에 적용 가능하나, 바람직 하게는 인간용이다.

(간엽계 간세포와 잇몸 섬유아세포)

본 조성물은 간엽계 간세포를 포함할 수 있다. 간엽계 간세포란, 체성 간세포의 하나로서, 자기 복제능과 복수의 간엽계 간세포로 분화되는 다분화능을 갖는 세포이다. 간엽계 간세포는 통상적인 방법에 따라, 골수, 골막, 말초혈, 제대혈 및 지방 세포 등에서 채취하고, 배양하고, 조제함으로써 얻어진다. 골수에 대해서는, Mark F. Pittenger, et. al., Science, (1999) vol.284, pp143-147, Katia Mareschei, et. al., Haematologica (2001) vol.6, pp1099-1100, 말초혈에 대해서는, Sergei A. Kuznetsov, et al., The journal of Cell Biology, (2001) vol.153, pp1133-1139, 제대혈에 대해서는, Alejandro Erices, et al., British Journal of Haematology (2000) vol.109, pp235-242 에 기재되고, 지방 세포에 대해서는, Patricia A. Zuk, et al., Tissue Engineering (2001) vol.7(2), pp211-228 에 기재가 있다. 또, 본 발명에서는 치주 조직을 재생하는 것을 의도하는 관점 또는 채취 용이성의 관점에서, 구강 조직으로부터 채취되는 것도 바람직하다. 구강 조직으로는, 예를 들어 치조골의 골수, 구개, 치조골의 골막, 치소낭 조직, 치근막, 치조골의 골수 등을 들 수 있다. 또, 발치 등에 부수되어 취득되는 잇몸 등에서 유래되는 치낭 세포 또는 치수 (齒髓) 세포로부터 채취된 것이어도 된다.

본 조성물은, 잇몸 섬유아세포를 포함하고 있어도 된다. 잇몸 섬유아세포로는, 간엽계 간세포 등의 미분화·간세포로부터 잇몸 섬유아세포 등 잇몸 형성 능을 발현하도록 분화 유도된 것이어도 된다. 예를 들어, 염기성 섬유아세포 증식 인자 (bFGF) 에 의해 분화 유도될 수 있다.

본 발명에 있어서는, 이러한 간엽계 간세포 및 잇몸 섬유아세포로부터 1 종 또는 2 종 이상을 선택할 수 있다. 즉, 간엽계 간세포만을 포함하고 있어도 되고, 잇몸 섬유아세포만을 포함하고 있어도 되고, 쌍방을 포함하고 있어도 된다. 또, 이들 세포는 배양 세포이어도 된다. 또한, 본 발명에 있어서 사용하는 세포는, 본 조성물이 적용되는 개체의 관계에 있어서, 자가 세포, 동종 세포 및 이종 세포를 포함하는데, 바람직하게는 동종 세포이며, 보다 바람직하게는 자가 세포이다. 예를 들어, 인간의 치주 연조직을 재생하는 목적으로는, 조직 적합 항원의 일치수가 많은 타가 (他家) 세포 또는 자가 세포를 사용하는 것이 바람직하다.

(매트릭스 재료)

본 조성물에 사용하는 매트릭스 재료로는, 적용 (투여) 전 또는 생체 내에 있어서 적당한 점도를 갖는 유체 내지 겔상체를 형성 가능한 것이면 되는데, 생체 내에서 분해 흡수되어 가는 성질을 갖는 것이 바람직하다. 매트릭스 재료로는, 종래 세포의 스캐폴드로서 사용되고 있는 고분자 재료 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 락트산과 글리콜산의 공중합체, 폴리-ε-카프로락톤, ε-카프로락톤과 락트산 또는 글리콜산의 공중합체, 폴리시트르산, 폴리말산, 폴리-α-시아노아크릴레이트, 폴리-β-히드록시부티르산, 폴리트리메틸렌옥살레이트, 폴리테트라메틸렌옥살레이트, 폴리오르토에스테르, 폴리오르토카보네이트, 폴리에틸렌카보네이트, 폴리프로필렌카보네이트, 폴리-γ-벤질-L-글루타메이 트, 폴리-γ-메틸-L-글루타메이트, 폴리-L-알라닌 등의 합성 고분자, 전분, 알긴산, 히알루론산, 키틴, 펙틴산 및 이들 각각의 유도체 등의 다당, 혹은 젤라틴, 콜라겐 (콜라겐의 타입 및 그 추출법은 어느 것이어도 된다), 알부민, 피브린, 피브리노겐, 피브로넥틴 및 비트로넥틴 등의 단백질이나 펩티드 등을 들 수 있다. 또, 이들 각종의 매트릭스 재료로는, 이들의 가교체나 그 일부를 화학 수식한 유도체이어도 된다. 또, 상업적으로 입수 가능한 각종 겔제 (마트리겔 (상품명), BDPuraMatrix 펩티드 하이드로겔, 모두 BD 사 제조) 등도 사용할 수 있다. 이러한 매트릭스 재료는, 본 조성물의 주입 부위에 있어서의 세포나 증식 인자 등의 유지 담체로서 기능할 수 있다. 또한, 이들 매트릭스 재료를, 이하에 설명하는 혈액 응고계 매트릭스 재료에 대해 비혈액 응고성 매트릭스 재료라고 하기로 한다.

본 발명자들의 지견에 의하면, 이들 비혈액 응고성 매트릭스 재료는, 주입 부위에 대한 침투성 및 주입 부위에 있어서의 유지성 (유치성 (留置性)) 이 우수하여, 본 조성물을 주입 부위의 조직에 용이하게 침투시킬 수 있다. 이로써, 효과적으로 또한 매끄럽게 융기된 표면을 갖는 등 바람직한 주입 부위 형태로, 재생이 필요한 부위 또는 그 근방에 본 조성물을 도달시킬 수 있다. 본 조성물이 조직에 침투하기 어려운 경우, 주입 부위에서 표면에 복수의 작은 융기를 수반하는 융기 부위를 형성하기 쉬워지고, 조직 재생에 적합하지 않은 주입 부위를 형성함과 함께, 재생하고자 하는 결손 부위에 본 조성물을 도달시켜 조직을 재생시키는 것이 곤란하게 된다.

또, 매트릭스 재료로는, 혈장 및/또는 혈소판을 포함하는 혈액 획분에서 유 래되는 혈액 응고계 매트릭스 재료도 사용할 수 있다. 혈장에는, 연조직에 있어서의 섬유아세포나 간엽계 간세포의 스캐폴드로서 적합한 피브린, 피브리노겐이나 피브로넥틴 등의 접착 인자가 포함되어 있고, 혈소판은 피브린 겔 형성을 촉진하는 인자가 포함되어 있어 생체 내에 있어서 또는 생체 외에 있어서 소정의 자극에 의해 이들을 방출하여 점성이 있는 유체나 겔상체를 형성할 수 있다.

본 발명자들의 지견에 의하면, 혈액 응고계 매트릭스 재료는 침투성 및 유지성은 떨어지지만 조직 재생에 유효하다고 생각된다.

혈소판 및 혈장은 각각 단독으로 사용해도 되는데, 혈소판은 피브린 및/또는 피브리노겐과 조합하여 사용하는 것이 바람직하고, 또 다른 혈액 획분인 혈장과 조합하여 사용하는 것이 바람직하다. 혈장 및 혈소판을 포함하는 혈액 획분으로는, 혈소판을 농축시킨 다혈소판 혈장 (Platelet Rich Plasma : PRP) 을 바람직하게 사용할 수 있다. 다혈소판 혈장은, 혈장 유래의 피프린, 피브리노겐 등의 접착 인자를 포함하고, 염화칼슘/트롬빈 등의 첨가에 의해 용이하게 점성이 향상되며, 겔화됨과 함께, 생체 내에 있어서 혈소판이나 세포의 유지 담체를 형성할 수 있다.

PRP 는, 예를 들어 Whitman 등의 방법 (Dean H. Whitman et al. : J Oral Maxillofac Surg, 55, 1294-1299 (1997)) 에 준하여, 채취한 혈액을 원심 분리 처리에 제공함으로써 조제할 수 있다. PRP 는, Platelet-derived Growth Factor (PDGF), Transforming growth factor β1 (TGF-β1), Transforming growth factor β2 (TGF-β2) 등의 성장 인자를 풍부하게 포함하는 것이 알려져 있다 (Jarry J. Peterson : Oral surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 85, 638-646 (1998)).

이하에 PRP 의 조제 방법의 일례를 나타낸다. 먼저, 채취한 혈액에 시트르산나트륨 등의 응고 방지제를 첨가하고, 실온에서 소정 시간 방치한다. 그 후, 혈구 및 연막이 분리되는 조건 (예를 들어 약 5,4000rpm) 으로 원심 처리한다. 이로써, 2 층 (상층은 Platelet-poor Plasma 로 불린다. 하층에는, 혈구 및 연막이 포함된다) 으로 분리된다. 상층을 제거한 후, 추가로 적혈구가 분리되는 조건 (예를 들어, 약 2,400rpm) 에서 원심 처리한다. 그 결과 얻어진 적혈구를 실질적으로 포함하지 않는 획분 (Platelet-rich Plasma : PRP) 을 채취한다. PRP 의 조제 방법은 당해 방법에 한정되는 것은 아니고, 필요에 따라 수정을 가한 방법에 의해 조제할 수 있다. 바람직하게는 자기혈의 PRP 를 사용한다. 이로써, 독성 내지 면역 거절 반응의 우려가 없어진다.

PRP 에 포함되는 혈소판의 수 (혈소판 농축률) 에 대한 일반적인 정의는 없지만, 채취한 혈액과 비교하여 약 150 배∼약 1500 배의 혈소판을 함유하는 혈장을 본 발명에 있어서의 PRP 로서 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서 PRP 의 「혈소판 농축률」 은 다음의 식으로 나타낸다.

혈소판 농축률 (%)=(PRP 중의 평균 혈소판수/출발 재료인 전체 혈중 평균 혈소판수)×100

따라서, 예를 들어 PRP 중의 평균 혈소판수가 1,000,000 으로서, 전체 혈중 평균 혈소판수가 300,000 일 때의 혈소판 농축률은 약 333% 가 된다. PRP 의 혈소판 농축률은, 바람직하게는 약 150%∼약 1500% (평균 혈소판수로 환산한 경우에는 통상 약 240,000 개/㎕∼약 6,150,000 개/㎕ 에 상당한다) 의 범위이다. 더욱 바람직하게는 혈소판 농축률이 약 300%∼약 600% (평균 혈소판수로 환산한 경우에는 통상 약 480,000 개/㎕∼약 2,460,000 개/㎕ 에 상당한다) 의 범위이다.

또한, PRP 의 혈소판 농축률은, PRP 를 조제할 때의 원심 처리 조건을 적절히 조절함으로써 조정할 수 있다. 예를 들어, 이미 기재한 바와 같이 2 단계의 원심 처리를 실시하는 것으로 하고, 최초의 원심 처리를 약 500rpm∼약 1500rpm (예를 들어 1,100rpm), 약 5 분간∼약 15 분간 (예를 들어 약 5 분) 의 조건에서 실시하고, 2 단계째의 원심 처리를 약 2000rpm∼약 5000rpm (예를 들어 약 2,500rpm), 약 5 분간∼약 15 분간 (예를 들어 약 5 분) 의 조건에서 실시함으로써, 혈소판 농축률이 약 300%∼약 600% 의 범위에 있는 PRP 를 얻을 수 있다. 또한, PRP 의 혈소판 농축률의 계측은 통상적인 방법 (예를 들어, 실시예에 나타내는 바와 같이 시판되는 Sysmex XE-2100 (Sysmex, 동경, 일본) 을 사용) 을 이용하여 실시할 수 있다.

PRP 는, 본 조성물을 적용하고자 하는 개체로부터 채취한 말초혈로부터 조제할 수 있는 자가 재료인 점에서도 바람직하다. 또, 후술하는 바와 같이 PRP 는 세포 증식 인자를 풍부하게 포함하고 있는 점에 있어서도 바람직하다. PRP 는 채취한 말초혈 등으로부터 통상적인 방법에 의해 조제할 수 있는 것 외에, 당업자이면, 필요에 따라 개변을 더할 수 있다. 또한, PRP 를 자가 재료로서 조제하는 경우에는, 적용 개체의 말초혈로부터 자기 트롬빈이나 자기 혈청을 채취하여 첨 가하는 것이 바람직하다. 또, PRP 는 CaCl₂/트롬빈과 1:1∼10:1 의 혼합물로서 사용할 수 있다. 또한, PRP 대신에, 혈소판, 혈소판과 피브린 및/또는 피브리노겐의 혼합물, 혈소판과 혈장의 혼합물 (다혈소판 혈장 이외의 형태로의) 등의 혈액 응고계를 유도 가능한 조성물도 PRP 상당물로서 사용할 수 있다.

이러한 매트릭스 재료로는, 상기한 매트릭스 재료를 단독으로 또는 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명자들의 지견에 의하면, 치주 조직에 있어서의 양호한 조직 침투성이나 주입 부위에 있어서의 유지성을 효과적으로 얻기 위해서는, 매트릭스 재료로서 비혈액 응고계 매트릭스 재료를 사용하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 (a) 히알루론산 및 그 유도체, (b) 콜라겐 및 그 유도체, (c) 피프린 및 피브리노겐에서 선택할 수 있다. 더욱 바람직하게는, (a) 히알루론산 및 그 유도체, (b) 콜라겐 및 그 유도체에서 매트릭스 재료를 선택한다. 한편, 치주 조직에 있어서의 세포 증식·조직 재생능을 효과적으로 얻기 위해서는, (d) 혈소판 및 혈장, 바람직하게는 PRP 등의 혈액 응고계 매트릭스 재료에서 매트릭스 재료를 선택하는 것이 바람직하다.

또, 심미성이 높은 잇몸을 얻기 위해서는, 매트릭스 재료를 상기 (a) 히알루론산 및 그 유도체에서 선택하는 것이 바람직하다. 히알루론산 등을 사용함으로써, 매트릭스 재료 자체에 의한 착색을 억제하여 본래의 잇몸 색이 나타난 잇몸 조직을 빠르게 재생시킬 수 있다. 이 경우에는, 간엽계 간세포를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 히알루론산과 간엽계 간세포를 조합하는 경우에는, 후술 하는 바와 같이 PRP 등의 혈액 응고성 매트릭스 재료를 합쳐 사용하는 것이 바람직하다.

또, 특히 유리 잇몸의 재생의 관점에서는, 매트릭스 재료를 상기 (b) 콜라겐 및 그 유도체에서 선택하는 것이 바람직하다. 이 경우에는, 잇몸 섬유아세포를 사용하는 것이 바람직하다. 후술하는 실시예에서 나타내는 바와 같이, 매트릭스 재료로서 상기 (b) 콜라겐 및 그 유도체와 잇몸 섬유아세포를 포함하는 조성물은, 상기 (d) 의 혈액 응고성 매트릭스 재료를 포함하지 않아도 높은 잇몸 재생량을 나타내고 있다. 이것은 콜라겐과 잇몸 섬유아세포의 조합의 상승 효과에 의한 것으로서, 어느 하나만으로는 얻을 수 없는 효과이다. 이러한 조성물에 의하면, 블랙 트라이앵글 등의 치간 잇몸 등 결손 부위라도 용이하게 충전할 수 있다.

또, 동일하게 유리 잇몸 재생의 관점에서는, 매트릭스 재료를 상기 (a) 히알루론산 및 그 유도체 그리고 (b) 콜라겐 및 그 유도체에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상과, (d) PRP 등 혈장 및 혈소판에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상을 사용하는 것이 바람직하다. 이 경우, 세포는 간엽계 간세포 및/또는 잇몸 섬유아세포를 사용할 수 있는데, 매트릭스 재료가 (a) 히알루론산 및 그 유도체에서 선택되는 경우, 간엽계 간세포가 바람직하고, 매트릭스 재료가 (b) 콜라겐 및 그 유도체에서 선택되는 경우, 잇몸 섬유아세포가 바람직하다. 이 경우에 있어서, (a) 히알루론산 및 그 유도체와, (b) 콜라겐 및 그 유도체의 각각에서 매트릭스 재료를 선택할 수도 있고, 일방에서만 선택해도 된다. 유리 잇몸의 재생과 심미적 관 점에서는, (a) 히알루론산 및 그 유도체에서 선택되는 매트릭스 재료와 (d) PRP 등의 혈장 및 혈소판에서 선택되는 매트릭스 재료를 사용하는 것이 바람직하다.

혈액 응고성 매트릭스 재료는, 간엽계 간세포 및/또는 잇몸 섬유아세포와 조합되는 것만으로 잇몸을 재생할 수도 있지만, 바람직하게는 비혈액 응고계 매트릭스 재료와 조합하여 사용하는 것이 바람직하다. 그렇게 함으로써, 혈액 응고성 매트릭스 재료는, 세포가 목적 부위에 침투, 도달 및 유지되고 비로소 그 작용을 발휘하기 때문이다.

따라서, 본 조성물에 있어서는, 매트릭스 재료로서 (d) 의 혈액 응고계 매트릭스로서 PRP 및/또는 PRP 상당물 (이하, 간단히 PRP 등이라고 한다) 을 포함함과 함께, 다른 매트릭스 재료 (비혈액 응고계 매트릭스 재료) 를 포함하는 것이 바람직하다. 비혈액 응고계 매트릭스 재료로는, (a) 히알루론산 및 그 유도체 그리고 (b) 콜라겐 및 그 유도체에서 선택되는 것이 바람직하다. 세포와 PRP 등의 혈액 응고계 매트릭스 재료와 비혈액 응고계 매트릭스를 포함하고, 이들을 균일하게 혼합하여 얻어지는 조성물을 조제함으로써, 주입에 적절한 점성을 용이하게 얻을 수 있다.

이러한 조성물에 있어서는, PRP 등의 혈액 응고계 매트릭스 재료와 비혈액 응고계 매트릭스 재료를 혼합한 복합 매트릭스 재료를 가지므로, 본 조성물을 주입 부위의 조직에 용이하게 침투시킬 수 있다. 이로써, 효과적으로 또한 매끄럽게 융기된 표면을 갖는 등 바람직한 주입 부위 형태로, 재생이 필요한 부위 또는 그 근방에 본 조성물을 도달시킬 수 있다. 또, PRP 등과 다른 매트릭스 재료로 이 루어지는 복합 매트릭스를 가지므로, 주입 부위에 있어서 세포와 함께 PRP 등도 양호하게 유지된다. 이 결과, 본 조성물의 주입 부위에 있어서, 양호한 세포의 증식능·조직 재생능을 확보할 수 있고, 부착 잇몸뿐만 아니라 유리 잇몸이어도 효과적으로 재생시킬 수 있다. 이상으로부터, PRP 등과 다른 매트릭스 재료로 이루어지는 복합 매트릭스를 갖는 경우에는, 블랙 트라이앵글 등의 치간의 잇몸 등 결손 부위라도 용이하게 충전할 수 있다.

이상으로부터, PRP 등의 혈액 응고성 매트릭스 재료와 비혈액 응고성 매트릭스 재료를 포함하는 본 조성물에는, 본 조성물을 조직에 주입했을 때 침투성과 유지성을 확보할 수 있을 정도로 혈액 응고성 매트릭스 재료와 비혈액 응고성 매트릭스 재료를 함유하고 있는 것이 바람직하다. 비혈액 응고계 매트릭스 재료가 지나치게 적거나 또는 혈액 응고성 매트릭스 재료가 지나치게 많으면, 주입시에 있어서 조직에 대한 침투성이 얻어지기 어렵기 때문에, 미세한 요철을 갖는 주입 부위 형상 그리고 조직을 형성하는 경향이 있고, 또 세포나 PRP 등이 주입 부위에 유지되기 어렵기 때문에 주입 부위에서의 조직 재생능이 저하되는 경향이 있기 때문이다.

본 조성물에 있어서의 PRP 등의 혈액 응고성 매트릭스 재료와 비혈액 응고성 매트릭스 재료의 바람직한 혼합비는, 예를 들어 본 조성물을 주입하여 형성되는 주입 부위의 높이나 체적을 지표로 하는 피하 주입 부위의 융기 형상 유지능에 기초하여 결정할 수 있다 (후단에서 기재한다). 바람직하게는, 예를 들어 1∼3% 의 콜라겐 용액 (바람직하게는 2% 콜라겐 용액) 또는 3㎎/㎖∼15㎎/㎖ 의 히알루론산 용액 (바람직하게는 10㎎/㎖) 에 대해 정상 범위의 혈소판 함유량의 PRP 를 10v/v% 이상 900v/v% 이하의 비율로 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 100v/v% 이상이고, 더욱 바람직하게는 200v/v% 이상이다. 100v/v% 이상이면, 다른 매트릭스 재료와 PRP 의 병용 효과를 확실하게 얻을 수 있고, 200v/v% 이상이면, 본 조성물의 주입시에 있어서 양호한 조직 상태가 얻어지기 쉽다. 또, 바람직하게는 250v/v% 이하이다. 250v/v% 를 초과해도 병용 효과가 얻어지기 어렵기 때문이다. 또한, PRP 를 병용하는 경우에 있어서는, 비히클 또는 조성물 중의 콜라겐 농도로는 0.2% 이상 1.8% 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1% 이하이고, 더욱 바람직하게는 0.6% 이하이다. 또, 비히클 또는 조성물 중의 히알루론산 농도로는, 1㎎/㎖ 이상 9㎎/㎖ 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5㎎/㎖ 이하이고, 더욱 바람직하게는 3㎎/㎖ 이하이다.

본 조성물에 있어서 바람직한 매트릭스 조성을 표 1 에 예시한다. 이 조성은 치주 연조직에 바람직한데, 그 중에서도 유리 잇몸, 특히 치간 유두부 잇몸의 재생에 바람직한 조성이다. 또, 간엽계 간세포, 히알루론산 및 PRP 등의 조합 그리고 섬유아세포 및 콜라겐의 조합은 유리 잇몸을 효율적으로 재생할 수 있다. 또한, 표 1 의 각 조성에 있어서는, 간엽계 간세포와 섬유아세포를 동시에 함유하고 있어도 된다.

세포의 종류	매트릭스 재료
	비혈액 응고성 매트릭스 재료	혈액 응고성 매트릭스 재료
간엽계 간세포	히알루론산, 그 유도체, 콜라겐, 그 유도체, 바람직하게는 히알루론산	있음 : 혈소판, PRP, PRP 상당물, 바람직하게는 PRP
잇몸 섬유아세포	히알루론산, 그 유도체, 콜라겐, 그 유도체, 바람직하게는 콜라겐	없음
		있음 : 혈소판, PRP, PRP 상당물, 바람직하게는 PRP

(세포 증식 인자)

본 조성물은, 세포 증식 인자를 포함할 수 있다. 세포 증식 인자로는, 본 조성물에 포함시키는 세포에 의한 잇몸 재생을 촉진하는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 세포 증식, 창상 치유를 촉진하는 것을 들 수 있고, 예를 들어 혈소판의 α 과립 중에 포함되어 있다고 여겨지는 증식 인자인 것이 바람직하다. 이러한 증식 인자로는 예를 들어 세포 증식을 촉진하는 PDGF, 세포 사이클을 자극하는 Ⅳ 형 콜라겐의 생성을 촉진하는 TGF-β 외에, VEGF 및 EGF 외에, bFGF 등의 증식 인자를 들 수 있다.

본 조성물은, 이러한 증식 인자로서 혈소판을 포함하고 있어도 되고, 혈장과 혈소판을 포함하고 있어도 되고, 바람직하게는 PRP 를 포함하고 있다. PRP 는 이미 설명한 바와 같이, 본 조성물에 있어서 매트릭스 재료로서 이용할 수 있는 반면, 세포 증식 인자원으로도 이용할 수 있다.

본 발명의 조성물에 의하면, 잇몸 형성능을 갖는 세포를 매트릭스 재료와 함께 포함하기 때문에, 재생을 필요로 하는 부위에 용이하게 도달됨과 함께, 당해 부위에 있어서 양호하게 세포가 유지된다. 이 결과, 치주 연조직을 용이하게 재생할 수 있다. 본 발명의 조성물을 치주 연조직 중에서도 유리 잇몸의 재생에 사용하는 경우에는, 주입 부위의 융기 형상 유지능을 갖는 것이 바람직하다. 유리 잇몸은 자립 내지 융기상의 형태를 취하고 있기 때문이다. 주입 부위의 융기 형상 유지능은, 예를 들어 마우스나 래트 등 설치류, 바람직하게는 설치류 실험 동물의 등부 피하에 본 발명의 조성물을 주입하여 형성되는 주입 부위의 높이나 체적을 지표로 할 수 있다.

지표의 하나로는, 주입 부위의 주입시의 높이에 대한 소정 기간 경과 후의 주입 부위의 높이의 비율을 들 수 있다. 높이는 이식 조직의 융기성이나 자립성의 바람직한 지표이기 때문이다. 이 높이의 비율은 예를 들어 이하와 같이 하여 구할 수 있다.

(a) 설치류의 등부 피하에 상기 조성물을 주입했을 때 형성되는 융기 부위의 주입시의 높이에 대한 조성물의 주입 144 시간 경과 후의 상기 융기 부위의 높이의 비율로 한다.

이 계측 방법에 있어서는, 설치류는 바람직하게는 실험 동물, 보다 바람직하게는 누드마우스이다. 또한, 본 발명의 조성물의 주입량은 0.5㎖∼3.0㎖ 로 할 수 있는데, 바람직하게는 1.0㎖ 이다. 또한, 융기 부위의 높이는 등부의 피하에 조성물을 주입하여 융기된 영역의 최고부로 하고 마킹 후, 버니어캘리퍼스를 이용하여 계측하는 것으로 한다.

이렇게 하여 구한 높이의 비율이 15% 이상인 것이 바람직하다. 15% 이상이면, 융기 형태를 그 후에 있어서도 유지하기 쉽기 때문이다. 보다 바람직하게는 30% 이상이다.

높이 비율의 다른 양태는, 상기 융기 부위의 주입시의 높이에 대한 본 발명의 조성물의 주입 288 시간 경과 후의 융기 부위 높이의 비율이다. 계측 방법은 상기와 동일하다. 이 높이 비율이 15% 이상인 것이 바람직하다. 15% 이상이면, 융기 형태를 보다 유지하기 쉽기 때문이다. 보다 바람직하게는 30% 이상이다. 이 양태의 본 발명의 조성물은, 나아가 상기 융기 부위의 주입시의 높이에 대한 상기 조성물의 주입 288 시간 경과 후의 상기 융기 부위 높이의 비율이 10% 이상인 것이 바람직하다.

다른 지표로는, 피하 주입 부위의 주입시의 체적에 대한 소정 기간 경과 후의 주입 부위의 체적의 비율을 들 수 있다. 체적은 이식 조직의 융기성이나 자립성의 바람직한 지표이기 때문이다. 이 체적의 비율은 예를 들어 이하와 같이 하여 구할 수 있다.

(b) 설치류의 등부 피하에 상기 조성물을 주입했을 때 형성되는 융기 부위의 주입시의 체적에 대한 조성물의 주입 144 시간 경과 후의 상기 융기 부위의 체적의 비율로 한다.

체적의 계측 방법에 있어서도 상기 높이의 계측시에 있어서와 동일한 양태를 채용할 수 있다. 체적의 계측에 있어서는, 본 발명의 조성물을 주입하여 융기된 부위의 윤곽에 4 지점 이상의 마킹을 부여해 두고, 이 마킹에 기초하여 융기 부위의 장경과 단경을 계측함과 함께 높이를 계측한다. 융기 부위를 반구체 또는 반타원구체 등의 형상으로 간주하여, 그 직경 또는 장경 및 단경의 데이터를 기초로 융기 부위의 체적의 근사값을 산출하는 것으로 한다. 바람직하게는 마킹은 장경과 단경과 융기 부위의 윤곽이 교차하는 부위에 형성하는 것으로 한다. 장경이나 단경은 버니어캘리퍼스 등 적절한 장치로 계측하면 된다.

이러한 구한 체적의 비율은 10% 이상인 것이 바람직하고, 이 비율이 20% 이상인 것이 보다 바람직하다. 더욱 바람직하게는 30% 이상이다.

본 조성물은, 사용시에 있어서 치주 조직 국소, 즉 국소 피하에 주입 가능한 것이 바람직하다. 본 조성물에 있어서, 특히 세포 이외의 성분은 용시(用時) 용해성의 분말이어도 되고, 미리 액체 또는 겔상 등 주입 가능한 유동성을 갖도록 조제되어 있어도 되고, 용시에 있어서 희석을 전제로 하여 조제된 유동성체 (流動性體) 이어도 된다. 또한, 용시에 있어서 혼합하여 사용하는 2 제 이상으로 이루어지는 키트이어도 된다. 본 조성물은, 주입시에 사용하는 적당한 액 매체를 포함할 수 있다. 이러한 액 매체는, 예를 들어 생리적으로 적합한 완충액, 생리 식염수, 각종 주사용 용매를 들 수 있다. 또, 본 조성물의 세포 이외의 성분은, 필요에 따라 안정화제, 보존제, pH 조정제, 증점제 등을 포함할 수 있다.

(본 조성물의 제조 방법)

본 조성물의 조제 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 본 조성물을 구성하는 구성 성분인 세포와 매트릭스 재료, 또한 필요에 따라 세포 증식 인자 등을 단지 혼합하는 것만으로도 되고, 필요에 따라 완충액, 생리 식염수, 주사용 용매를 포함하고 있어도 된다. 본 조성물에 포함되는 세포수는, 바람직하게는 1.0×10⁴cells/㎖∼1.0×10¹⁰cells/㎖ 정도이다.

세포를 현탁하는 매트릭스로는, 이미 설명한 각종 매트릭스 재료를 사용할 수 있는데, 바람직하게는 (a) 히알루론산 및 그 유도체, (b) 콜라겐 및 그 유도체, (c) 피브린 및 피브리노겐, (d) 혈장 및 혈소판 (전형적으로는 PRP) 에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상을 사용한다. 또, 본 조성물에 사용하는 매트릭스 재료 용액은, 예를 들어 히알루론산은 3㎎/㎖∼15㎎/㎖ 의 농도, 바람직하게는 10㎎/㎖ 의 농도의 것을 사용할 수 있고, 콜라겐은 0.5∼5wt% 의 농도, 바람직하게는 1∼3wt% 의 농도의 것을 사용할 수 있다.

또한, 본 조성물을 조제하는 데에 있어서는, 사용하는 세포를 채취하고, 필요량을 미리 준비해 둘 필요가 있다. 채취한 세포를 배양하여 증식시키기 위해서는 취득한 세포의 종류에 따라 통상적인 방법에 따라 배양하면 된다. 즉, 미분화 간엽계 간세포 및 잇몸 섬유아세포에서 선택되는 세포를 배양하고, 그 배양한 미분화 간엽계 간세포 및 잇몸 섬유아세포에서 선택되는 세포와, 매트릭스 재료를 혼합해도 된다.

(세포의 채취, 분리, 배양 등)

세포의 채취, 분리, 배양 등에 대해서는 통상적인 방법에 따르면 되는데, 예를 들어 간엽계 간세포에 대해서는 다음과 같이 하여 실시할 수 있다.

(1) 골수 유래 간엽계 간세포의 분리 채취 방법

인간 또는 실험 동물의 골수는, 예를 들어 장골 (腸骨) 등에서 통상적인 방법에 따라 채취할 수 있다. 또, 구강 골수로부터 채취하는 경우에는, 치조골을 골수액이 스며 나올 때까지 천공하여 골수액을 채취하면 된다. 이렇게 하여 채취한 골수액은 적당한 배지 (예를 들어 10% FBS 또는 자기 혈청 함유 DMEM 배지) 와 함께 조직 배양용 배양 접시에 파종하여, 몇일 후 배양 접시에 접착된 세포만을 배양하고, 부유 세포는 세정하여 없앤다.

(2) 구강 골막 세포의 분리 채취 방법

인간 또는 실험 동물의 구개 혹은 상악 또는 하악의 치조점막을 박리하여 치조골 상의 골막을 노출시켜 적당한 크기로 채취하고, 채취한 골막을 미세하게 잘게 자른 후, 37℃ 에서 콜라게나아제와 함께 인큐베이트한다. 이어서, 예를 들어 피페팅 등에 의해 세포를 분산시키고, 여과 또는 원심 분리에 의해 세포를 수집한다. 얻어진 세포수를 계측하여 적당한 배지 (예를 들어 10% FBS 또는 자기 혈청 함유 DMEM 배지) 와 함께 조직 배양용 배양 접시에 파종한다.

(3) 치수 조직 또는 치낭 조직 유래 간세포의 분리 채취 방법

치수 조직 또는 치낭 조직으로부터 채취하는 경우에는, 발치에 수반하여 치배를 채취한 후, 육안으로 이들 조직을 떼어낸 후에 외식편 배양에 제공하여 부착 세포만을 배양하고, 부유 세포를 세정하여 없앤다.

(4) 간엽계 간세포의 배양

이렇게 하여 얻어진 각종 간엽계 간세포는 그 세포의 배양에 적합한 임의의 배지를 이용하면 된다. 또한, 필요에 따라 bFGF 등의 세포 증식 인자를 첨가하여 배양할 수도 있다 (J. Bone Mineral Res. 20, (2005), p399-409, Biochm. Biophys. Res. Commun. 288 (2001), p413-419). 배양은 포유 동물의 배양에 적합한 임의의 조건에서 실시할 수 있는데, 일반적으로는 37℃ 에서 5% 탄산 가스 존재하에서 실시하는 것이 바람직하다. 간세포의 계대 배양은 당해 세포 배양 분야에 있어서 공지된 적합한 방법으로 실시하면 된다.

(5) 잇몸 섬유아세포의 분리, 채취, 배양 방법

잇몸 섬유아세포는, 예를 들어 인간 또는 실험 동물의 잇몸으로부터 채취한 잇몸 소편을, 트립신으로 처리하여 세포 분산시킨 후, 상청을 제거하여 세포 부유액을 조제하고, 세포수를 카운트한 후, 세포수가 적당한 개수 (예를 들어, 1×10²개/㎖) 가 되도록 배양액으로 희석하거나 익스플랜트 컬처에 의해 샬레 등에 파종하고, 37℃, 5% CO₂ 의 인큐베이터에 옮겨 배양하고, 단층 시트를 형성하면 계대된다. 섬유아세포의 계대 배양은 당해 세포 배양 분야에 있어서 공지된 적합한 방법으로 실시하면 된다.

본 조성물은, 치주 조직 국소 주입용으로서 사용하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 인간 치주 조직 국소 주입용이다. 투여 부위는 치주 연조직의 축퇴 또는 결손 부위의 근방으로 할 수 있고, 또 종래의 경조직 주체의 재생술 후에 있어서 유리 잇몸이 부족한 부위 등의 근방이어도 된다. 구체적으로는, 잇몸의 퇴축에 의해 노출된 근면 부위의 근방이나 블랙 트라이앵글 등 결손된 치간 유두부의 근방을 들 수 있다.

본 조성물은, 투여 부위 1 지점당, 세포를 1.0×10⁴∼1.0×10¹⁰cells/㎖ 함유하는 농도로, 50∼5000㎕, 보다 바람직하게는 500∼2000㎕ 를 투여한다. 투여 부위는 또한 볼측, 혀측 중 어느 것이어도 되고, 쌍방이어도 된다. 투여는 경피적으로 피하에 주입해도 되고, 투여 부위를 절개한 후, 본 조성물을 주입 또는 충전하고, 그 후 봉합하도록 해도 된다. 또한, 절개 부위에 있어서 별도 스캐폴드가 될 수 있는 매트릭스 재료를 별도 충전해도 된다. 또, 동시에 2 지점 이상에 투여해도 된다.

본 발명의 치주 국소 주입용 조성물은, 근연 잇몸이나 치간 유두부 잇몸 등 미소한 재생 부위를 재생하는데 바람직하다. 또, 본 조성물을 절개를 수반하지 않고 경피적으로 피하에 주입했을 때로서, 본 조성물을 단독으로 투여한 경우 또는 잇몸 표면에 다른 시술의 흔적을 수반하지 않는 경우에는, 잇몸 표면의 외관은 크게 흐트러지지 않고, 치료 중에 있어서도 심미성이 유지되도록 되어 있다. 특히, 매트릭스 재료로서 히알루론산을 사용하는 경우에는, 주입 당초부터 잇몸의 외관 (색 등) 에 대한 영향이 거의 없어 바람직한 심미성이 유지된다. 또, 본 발명의 조성물이 매트릭스 재료를 함유할 때, 세포 등의 조직 침투성 및 유지성이 우수하므로, 다수회의 투여를 하지 않아도 충분한 조직 재생 효과를 얻을 수 있다. 따라서, 이와 같은 점에 있어서도 저침습성이다. 또한, 국소 주입하는 경우, 단회 투여로도 양호하게 부착 잇몸이나 유리 잇몸을 재생할 수 있음과 함께, 치간 유두부를 충전할 수 있다.

또, 본 조성물은, 종래의 GTR 법이나 에나멜 매트릭스를 사용하는 방법, 조직편 이식법이나 노출 근면 피복술과 독립적으로 투여 부위에 투여해도 되고, 이러한 종래법을 보완하는 것으로서 종래법을 실시하는 것과 동시에 투여해도 되고 또는 이러한 종래법의 시술 후, 치조골이나 부착 잇몸이 어느 정도 수복된 후에 투여해도 된다.

본 조성물에 의하면, 치주 연조직, 즉 부착 잇몸 및 유리 잇몸 등의 치간 유두부 잇몸의 재생·수복에 저침습이며 또한 유효하다. 또한, 본 조성물에 의하면, 종래 재생이 곤란 또는 불충분했던 근연 잇몸이나 치간 유두부 잇몸 등의 유리 잇몸을 효과적으로 재생할 수 있다. 이 결과, 본 조성물에 의하면, 심미적으로 양호한 치경을 재생할 수 있다. 따라서, 본 조성물은, 유리 잇몸 재생용 조성물, 개별적으로는 근연 잇몸 재생용 조성물 및 치간 유두부 잇몸 재생용 조성물로서 사용할 수 있다.

(치주 연조직의 재생 방법)

본 조성물의 실시형태의 하나로서 치주 연조직의 재생 방법을 들 수 있다. 즉, 본 조성물을 인간 등 치주 연조직의 재생을 필요로 하는 개체의 치주 연조직 퇴축 부위 또는 결손 부위에 투여함으로써, 이들 부위에 있어서 부착 잇몸이나 유리 잇몸을 재생하고, 기능적이고 심미성이 양호한 치경을 재건할 수 있다. 본 조성물의 재생 방법은, 축퇴 부위나 결손 부위 그 자체에 투여하는 것은 아니고, 실제로는 공간을 둘러싸는 잔존하는 조직에 본 조성물을 투여하여, 이들 결손 부위 등을 충전하도록 치주 연조직을 재생한다. 따라서, 결손 부위 등의 공간 자체에 조성물을 공급하여 당해 부위를 재생하는 것과는 근본적으로 상이하다. 특히 본 발명의 조성물, 그 중에서도 콜라겐과 섬유아세포, 또는 히알루론산과 간엽계 간세포와 PRP 를 사용함으로써, 치간 유두부 잇몸을 효과적으로 재생할 수 있다. 또한, 이러한 재생 방법의 실시에 있어서는, 치조골을 중심으로 하는 경조직의 재생술 (예를 들어, GTR 법, 에나멜 매트릭스법, 세포 이식, 조직편 이식) 과 조합하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 이들 재생술과 동시에 또는 이들 시술 후에 실시해도 된다. 또, 재생 방법에 사용하는 본 조성물의 조성, 투여 방법 등은 이미 서술한 바와 같다.

또한, 치주 조직의 재생 방법에서는 본 조성물을 사용했지만, 본 조성물에 포함되는 개별의 구성 성분을 조성물로서가 아니라 별개의 약제로서 따로 따로 또는 2 종 이상을 조합하여 주입 등을 해도 된다. 예를 들어, 미리 매트릭스 재료를 주입한 후, 세포 현탁액 또는 세포와 증식 인자를 포함하는 액을 주입해도 되고, 그 반대이어도 된다. 본 조성물의 구성 성분의 1 종 또는 2 종 이상을 별개로 투여하는 방법은 적절히 설정되면 된다.

(치주 조직 재생용 조성물의 평가 방법)

본 발명에 의하면, 치주 조직 재생용 조성물의 평가 방법도 제공된다. 즉, 이미 설명한 유리 잇몸 또는 치간 유두부 잇몸의 재생 지표를 사용함으로써, 각종 조성물에 대해 유리 잇몸의 재생능 평가 공정을 실시하여, 유리 잇몸의 재생에 적합한 조성물을 얻을 수 있다. 평가 대상은 본 발명의 조성물로 할 수 있다. 평가 지표는 이미 서술한 피하 주입시의 융기 부위의 「높이 비율」 및/또는 「체적의 비율」 로 하는 것이 바람직하다. 그리고, 평가도 이들 지표에 대해 이미 설명한 수치를 사용한다. 예를 들어, 높이 비율이 상기 수치 이상일 때, 유리 잇몸 형성능을 긍정하는 것으로 하고, 높이 비율이 상기 수치 미만일 때에는, 유리 잇몸 형성능을 부정하는 것으로 할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 이러한 평가 방법의 평가 공정을 구비하는 유리 잇몸 재생용 조성물의 제조 방법이 제공된다. 즉, 이러한 평가 방법에 의해 어느 조성물의 유리 잇몸 형성능이 긍정되었을 때에는, 당해 조성물의 조성에 기초하여 유리 잇몸 재생용 조성물을 제조할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1 : 인간 간엽계 간세포의 조제)

수술전에 환자의 장골로부터 통상적인 방법에 따라 채취하였다. 채취한 골수액을 적당한 배지와 함께 조직 배양용 배양 접시에 파종하였다. 부유 세포를 제거하고, 일정 기간마다 배양액을 교환하여 세포를 배양 증식시켰다.

(실시예 2 : 인간 잇몸 섬유아세포의 조제)

수술전에 환자의 잇몸으로부터 채취하고, 익스플랜트 컬처에 의해 배양 접시에 파종하고, 37℃, 5% CO₂ 의 인큐베이터로 옮겨 배양한다. 통상적인 방법 (미분화 간엽계 간세포와 동법) 으로 배양 증식, 세포 덩어리를 조정하였다.

(실시예 3 : 세포 이식)

본 실시예에서는, 마우스에 각종 계열의 매트릭스 재료와 세포를 주입하고, 융기 부위에 있어서의 사이즈의 시간 경과 변화를 측정하여, 부착 잇몸이나 유리 잇몸의 재생 재료로서 사용할 수 있는지를 평가하였다.

(1) 실험 동물의 준비

누드마우스에 디에틸에테르에 의해 마취 도입 후, 미리 10 배 희석해 둔 펜트바르비탈나트륨 (상품명 솜노펜틸) 을 투베르쿨린 접종용 시린지에서 복강내 주사 (단, 한도량은 10 배 희석을 0.6㎖ 로 한다) 하여 마취 상태를 유지하였다. 마취 후, 시판되는 제모 크림으로 제모하였다.

(2) 재생용 조성액의 조제

실험 동물에게 이식하는 재생용 조성액을 미리 조제해 둔 인간 간엽계 간세포 (MSCs) 또는 인간 잇몸 섬유아세포 (FB) 를 이용하여 전체량 1.0㎖ 의 조성액을 조제하였다. 또한, 각 계열은 각각 세포 성분 이외의 성분 (콜라겐, 히알루론산, PRP 그리고 히알루론산 및 PRP) 만의 액을 대조로서 포함하고 있다. 또, 주입 전에 PKH26 염색을 실시하였다.

조제한 각 액을 표 2 에 함께 나타내는 바와 같이, 각 일체의 누드마우스의 등부에 3 종류의 액을 22G 바늘의 실린지에서 각각 1.0㎖ 주입하였다. 주입 부위를 명시하기 위해 주입 부위의 주위에 먹물로 마킹하였다. 즉, 도 2 에 나타내는 바와 같이, 주입 부위 (종창 부위) 의 근연 상의 종창 부위의 기부의 장경 및 단경이 직교하는 부위에 마킹하고, 주입 부위의 장경, 단경 및 높이를 각각 계측하고, 수술후 0 일째의 계측값으로 하였다. 또한, 각 치수의 계측에는 버니어캘리퍼스를 사용하였다.

(3) 수술후 6 일째

주입시와 동일하게 하여 각 누드마우스를 마취하고, 주입시에 있어서의 마킹에 부위에 기초하여 주입 부위의 사이즈를 계측하였다.

(4) 수술후 12 일째

각 누드마우스에 디에틸에테르를 과흡입시켜 도살하였다. 주입 부위의 사이즈를 계측 후, 마우스 등부로부터 꺼내어 적출 절편을 현미경하에서 관찰하였다.

수술후 0 일째, 6 일째 및 12 일째에 있어서의 각 계측값으로부터 얻어지는 주입 부위의 높이, 체적, 장경 및 단경의 변화를 각각 도 3∼6 에 나타낸다. 융기 부위를 반구체 또는 반타원구체 등의 형상으로 간주하여, 그 직경 또는 장경 및 단경의 데이터를 기초로 융기 부위의 체적의 근사값을 산출하였다.

도 3∼도 6 에 나타내는 바와 같이, 모든 계열에 있어서, 시험액 주입 후, 당초 종창되어 있던 주입 부위는 축소되고, 그 높이, 단경 및 장경은 감소되었다.

(높이에 대해)

도 3 에 나타내는 바와 같이, 매트릭스 재료로서 콜라겐을 사용한 콜라겐 계열에 있어서는, 간엽계 간세포 함유액 및 섬유아세포 함유액의 어느 것에 있어서도 수술후 6 일 후 (144 시간 후) 시점에서는 거의 동정도의 주입 부위 높이 (50∼65%) 를 유지하고 있었지만, 수술후 12 일 후 (288 시간 후) 시점에서 간엽계 간세포 함유액에서는 퇴축되고 (10%), 섬유아세포 함유액에서는 40% 를 유지하고 있었다. 즉, 콜라겐과 섬유아세포는 높이 유지율에 바람직한 조성이라고 할 수 있다. 또, 히알루론산 계열에서는, 간엽계 간세포이어도 섬유아세포이어도, 수술후 6 일째에 있어서 이미 높이는 10% 이하이고, 거의 주입 부위의 높이는 소실되어 있었다. PRP 계열에서도 히알루론산 계열과 동일한 경향이 관찰되었다. 이에 대하여, (히알루론산+PRP) 계열에서는, 수술후 6 일째 (144 시간 후) 에 있어서, 간엽계 간세포 함유액에서는 약 60%, 섬유아세포 함유액에서는 약 20%, 수술후 12 일째 (288 시간 후) 에는 간엽계 간세포 함유액에서 약 50%, 섬유아세포 함유액에서는 10% 미만의 유지율이었다. 즉, (히알루론산+PRP) 계열에서는, 간엽계 간세포 및 섬유아세포가 쌍방 양호한 높이 유지율을 나타내는데, 간엽계 간세포가 높이 유지율에 있어서 보다 바람직한 것을 알았다.

(체적에 대해)

도 4 에 나타내는 바와 같이, 매트릭스 재료로서 콜라겐을 사용한 콜라겐 계열에 있어서는, 간엽계 간세포 함유액 및 섬유아세포 함유액 중 어느 것에 있어서도 수술후 6 일 후 시점에서는 거의 동일한 주입 부위 체적을 유지하고 있었지만, 수술후 12 일 (288 시간 후) 에 간엽계 간세포 함유액에서는 주입 부위는 거의 퇴축되었다. 이것에 대해 섬유아세포 함유액에서는, 수술후 0 일 후의 체적에 대해 30% 정도의 체적을 유지하고 있었다. 즉, 콜라겐과 섬유아세포는 체적 유지율에 바람직한 조성이라고 할 수 있다. 또, 히알루론산 계열에서는, 간엽계 간세포이어도 섬유아세포이어도, 수술후 6 일째 (144 시간 후) 에 있어서 이미 거의 주입 부위의 체적은 소실되어 있었다. PRP 계열에서도 히알루론산 계열과 동일한 경향이 관찰되었다. 이에 대하여, (히알루론산+PRP) 계열에서는, 수술후 6 일째 (144 시간 후) 에 있어서, 간엽계 간세포 함유액에서는 약 40%, 섬유아세포 함유액에서는 약 16%, 수술후 12 일째 (288 시간 후) 에는 간엽계 간세포 함유액에서 10% 초과, 섬유아세포 함유액에서는 5% 미만의 유지율이었다. 즉, (히알루론산+PRP) 계열에서는, 간엽계 간세포 및 섬유아세포가 쌍방 양호한 유지율을 나타내는데, 간엽계 간세포가 체적 유지율에 있어서 보다 바람직한 것을 알았다.

(장경 및 단경에 대해)

또한, 도 5 및 도 6 에 나타내는 바와 같이, 어느 계열에 있어서도 단경 및 장경 모두 감소되었지만, 모든 계열에 있어서 일정 이상 유지되어 있고, 높이나 체적만큼 계열 내에 있어서 또한 계열간에 있어서 차이가 없었다.

이상의 결과로부터, 간엽계 간세포 또는 잇몸 섬유아세포와 매트릭스 재료를 적어도 함유하는 조성물은, 융기 부위의 단경 및 장경이 일정 이상 유지되어 있으므로 치주 연조직 중 부착 잇몸을 재생할 수 있는 것을 알았다. 또, 특히 콜라겐과 섬유아세포의 조합, 히알루론산과 PRP 를 포함하는 조합 (특히 간엽계 간세포와의 조합) 에 대한 융기 부위의 높이 및 체적의 유지율이 다른 조합보다 명확하게 유효하며, 이들 융기 부위의 프로파일에 의하면 부착 잇몸뿐만 아니라 자립하는 유리 잇몸 등의 치간 유두부 잇몸의 재생에 바람직한 것을 알았다. 또, 주입 부위의 높이와 체적이 대응하고 있고, 주입 부위의 체적 외에 주입 부위의 높이는 간단한 지표로서 유리 잇몸의 재생 효과의 지표로서 사용할 수 있는 것을 알았다.

또, 피하의 주입 부위를 관찰한 결과로부터, 히알루론산을 사용함으로써 점막 표면의 색이 주위와 거의 다르지 않은 외관이 양호한 재생 부위를 형성할 수 있는 것을 알았다.

(실시예 4 : 치간 유두부 잇몸의 재생)

본 실시예는, 치간 유두부 잇몸이 결손되어 블랙 트라이앵글을 발생시킨 환자 3 명에게 간엽계 간세포를 함유하는 시험액을 주입하여 치간 유두부 잇몸을 재생한 예이다. 환자는, 하악 치아의 치간 유두부 (상세하게는 하악 임플란트 보철 후의 주위 치간 유두부) 가 결손되어 블랙 트라이앵글이 생긴 남성 A (54 세), 상악 전치의 치간 유두부가 결손되어 블랙 트라이앵글이 생긴 남성 B (22 세), 상악 치아의 치간 유두부가 결손되어 블랙 트라이앵글이 생긴 여성 (48 세) 이었다. 수술전, 각 환자의 골수로부터 채취한 MSCs 를 배양하였다. 또, 술 당일, 각 환자로부터 50㎖ 채혈하고, 채취한 혈액을 원심 분리하여 PRP 를 준비하였다. 히알루론산 용액 (히알루론산나트륨 10㎎/㎖) 에 대해 PRP 가 100v/v%∼230v/v%, MSCs 가 1×10⁷cells/㎖ 가 되도록 조제한 혼액에 대해 10wt% CaCl₂+트롬빈을 첨가하고 혼합하여 시험액을 조제하였다. 각 시험액 조제 후 신속하게 각 환자의 상기 결손 부위 근방에 대해 각각 합계 1.0㎖ 를 주입하였다. 어느 환자에 있어서도 주입으로부터 6 일간 경과 후, 상기 결손 부위에 있어서 치간 유두부 잇몸이 재생되기 시작하고, 블랙 트라이앵글은 소실되어 있었다.

54 세의 남성 A 에 대해 수술전 및 수술후 경과의 관찰 결과를 도 7 에 나타낸다. 도 7 에 나타내는 바와 같이, 수술전에는 블랙 트라이앵글이 생겼지만 (도 7 중 a 참조), 수술후 일수를 더할수록 잇몸이 재생되기 시작하고, 치간 유두부가 재생 잇몸에 의해 충전되고, 블랙 트라이앵글은 소실되었다.

(실시예 5 : 실시예 3 의 마우스 피하 주입 부위의 조직 관찰)

실시예 3 에서 제조한, 히알루론산+PRP 계열인 (MSCs/HA/PRP) 의 조성물 및 (FB/HA/PRP) 의 조성물을 각각 주입한 누드마우스의 각 주입 부위로부터 채취한 조직 절편의 HE 염색 및 형광 염색에 의한 염색 결과를 도 8 및 도 9 에 나타낸다. 도 8 의 a 및 b 는 HE 염색에 의한 현미경 사진 화상이고, 도 8c 는 형광 염색에 의한 현미경 사진 화상이다. 도 8 의 a∼c 에 나타내는 바와 같이, (MSCs/HA/PRP) 의 주입 부위는 양호한 조직을 형성하고 있음과 함께, 이식한 MSCs (오렌지색) 의 주위에 있어서 Ⅰ 형 콜라겐이 잘 생성되어 있는 것을 알았다. 이것에 대해, 동일한 히알루론산+PRP 계열인 (FB/HA/PRP) 의 주입 부위로부터 채취한 조직은, 도 9 에 나타내는 바와 같이 Ⅰ 형 콜라겐의 생성은 (MSc/HA/PRP) 에 비교하여 적었다. 이상의 결과로부터, (MSc/HA/PRP) 조성물은, 주입 부위에 있어서의 콜라겐 생성량이 우수한 것 및 콜라겐 생성량과 주입 부위에 있어서의 높이 비율 및 체적 비율 (도 3 및 도 4 참조) 의 결과에 대응하고 있는 것을 알았다.

이상의 결과로부터, 양호한 융기 형상 유지능을 갖는 재생용 조성물을 사용함으로써, 치간 유두부 잇몸 등 재생이 곤란한 부위라도 간단하게 또한 심미적으로 양호하게 재생할 수 있는 것을 알았다.

본 출원은, 2006 년 4 월 19 일에 출원된 일본국 특허출원 특원 2006-115932호를 우선권 주장의 기초로 하고 있고, 그 내용 전부가 본 명세서에 포함된다.

Claims

간엽계 간(幹)세포 및 잇몸 섬유아세포에서 선택되는 세포와,

매트릭스 재료를 함유하는 치주 연조직 재생용 조성물.
제 1 항에 있어서,

세포 증식 인자를 포함하는 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 매트릭스 재료는, 이하의 (a)∼(d) :

(a) 히알루론산 및 그 유도체

(b) 콜라겐 및 그 유도체

(c) 피브린 및 피브리노겐

(d) 혈장 및 혈소판

에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상을 포함하는 조성물.
제 3 항에 있어서,

상기 매트릭스 재료는, 적어도 상기 (a) 의 히알루론산 및 그 유도체에서 선택되는 조성물.
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,

상기 세포는 간엽계 간세포인 조성물.
제 3 항에 있어서,

상기 매트릭스 재료는, 적어도 상기 (b) 의 콜라겐 및 그 유도체에서 선택되는 조성물.
제 3 항 또는 제 6 항에 있어서,

상기 세포는 잇몸 섬유아세포인 조성물.
제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 매트릭스 재료는, 적어도 상기 (d) 의 혈장 및 혈소판에서 선택되는 조성물.
제 3 항에 있어서,

상기 매트릭스 재료는, 상기 (a) 의 히알루론산 및 그 유도체, 및 상기 (d) 의 혈장 및 혈소판의 각각에서 선택되는 조성물.
제 9 항에 있어서,

상기 세포는 간엽계 간세포인 조성물.
제 10 항에 있어서,

상기 (d) 의 혈장 및 혈소판의 매트릭스 재료는 다혈소판 결정인 조성물.
제 11 항에 있어서,

상기 매트릭스 재료는, 상기 (b) 의 콜라겐 및 그 유도체, 및 상기 (d) 의 혈장 및 혈소판의 각각에서 선택되는 조성물.
제 12 항에 있어서,

상기 세포는 잇몸 섬유아세포인 조성물.
제 13 항에 있어서,

상기 매트릭스 재료는, 상기 (b) 의 콜라겐 및 그 유도체, 및 상기 (d) 의 혈장 및 혈소판의 각각에서 선택되는 조성물.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,

설치류의 등부 피하에 상기 조성물을 주입했을 때 형성되는 융기 부위의 주입시 높이에 대한 상기 조성물의 주입으로부터 144 시간 경과 후의 상기 융기 부위의 높이의 비율이 15% 이상인 조성물.
제 15 항에 있어서,

상기 높이의 비율이 30% 이상인 조성물.
제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,

설치류의 등부 피하에 상기 조성물을 주입했을 때 형성되는 융기 부위의 주입시 높이에 대한 상기 조성물의 주입으로부터 288 시간 경과 후의 상기 융기 부위의 높이의 비율이 15% 이상인 조성물.
제 17 항에 있어서,

상기 높이의 비율이 30% 이상인 조성물.
제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,

설치류의 등부 피하에 상기 조성물을 주입했을 때 형성되는 융기 부위의 주입시의 체적에 대한 조성물의 주입 144 시간 경과 후의 상기 융기 부위의 체적의 비율이 10% 이상인 조성물.
제 19 항에 있어서,

상기 비율이 20% 이상인 조성물.
제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 치주 연조직은 부착 잇몸인 조성물.
제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 치주 연조직은 유리(遊離) 잇몸인 조성물.
제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 치주 연조직은 치간 유두부인 조성물.
제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,

치주 조직 국소 주입용인 조성물.
간엽계 간세포 및 잇몸 섬유아세포에서 선택되는 세포를 배양하는 공정과,

그 배양된 간엽계 간세포 및/또는 잇몸 섬유아세포와 매트릭스 재료를 혼합하는 공정을 구비하는 치주 연조직 재생용 조성물의 제조 방법.
제 25 항에 있어서,

상기 세포는 간엽계 간세포 또는 잇몸 섬유아세포인 제조 방법.
제 25 항 또는 제 26 항에 있어서,

상기 치주 연조직은 부착 잇몸인 제조 방법.
제 25 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 치주 연조직은 유리 잇몸인 제조 방법.
제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 혼합 공정은, 상기 매트릭스 재료로서 이하의 (a)∼(d) :

(a) 히알루론산 및 그 유도체

(b) 콜라겐 및 그 유도체

(c) 피브린 및 피브리노겐

(d) 혈장 및 혈소판

에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상을 사용하는 공정인 제조 방법.
제 29 항에 있어서,

상기 혼합 공정은, 상기 매트릭스 재료로서 적어도 상기 (a) 의 히알루론산 및 그 유도체에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상을 사용하는 공정인 제조 방법.
제 29 항에 있어서,

상기 혼합 공정은, 상기 세포로서의 상기 잇몸 섬유아세포를 사용하고, 상기 매트릭스 재료로서 적어도 상기 (b) 콜라겐 및 그 유도체에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상을 사용하는 공정인 제조 방법.
제 29 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 혼합 공정은, 상기 매트릭스 재료로서 적어도 상기 (d) 의 혈장 및 혈소판으로서 다혈소판 혈장을 사용하는 공정인 제조 방법.
치주 연조직 재생용 조성물의 평가 방법으로서,

간엽계 간세포 및 잇몸 섬유아세포에서 선택되는 세포와, 매트릭스 재료를 구비하는 피험용 치주 연조직 재생용 조성물을 조제하는 공정과,

상기 치주 연조직 재생용 조성물은, 설치류의 등부 피하에 상기 피험용 치주 연조직 재생용 조성물을 주입했을 때 형성되는 융기 부위의 주입시 높이에 대한 상기 피험용 조성물의 주입으로부터 소정 시간 경과 후의 상기 융기 부위의 높이의 비율 및/또는 상기 융기 부위의 주입시 체적에 대한 상기 피험용 조성물의 주입으로부터 소정 시간 경과 후의 상기 융기 부위의 체적의 비율을 취득하는 공정과,

상기 취득한 높이의 비율 및/또는 체적의 비율에 기초하여 유리 잇몸 재생능을 평가하는 공정을 구비하는 방법.
치주 연조직 재생용 조성물의 제조 방법으로서,

간엽계 간세포 및 잇몸 섬유아세포에서 선택되는 세포와, 매트릭스 재료를 구비하는 피험용 상기 치주 연조직 재생용 조성물을 조제하는 공정과,

설치류의 등부 피하에 상기 피험용 치주 연조직 재생용 조성물을 주입했을 때 형성되는 융기 부위의 주입시 높이에 대한 상기 피험용 조성물의 주입으로부터 소정 시간 경과 후의 상기 융기 부위의 높이의 비율 및/또는 상기 융기 부위의 주입시 체적에 대한 상기 피험용 조성물의 주입으로부터 소정 시간 경과 후의 상기 융기 부위의 체적의 비율을 취득하는 공정과,

상기 취득한 높이의 비율 및/또는 체적의 비율에 기초하여 유리 잇몸 재생능을 평가하는 공정과,

상기 유리 잇몸 재생능에 기초하여 상기 치주 연조직 재생용 조성물의 조성을 결정하고, 당해 결정된 조성에 기초하여 상기 치주 연조직 재생용 조성물을 제조하는 공정을 구비하는 방법.