JP4842579B2 - 歯周組織再生用ゲル化組成物 - Google Patents
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好ましくは、自己血清培地又は無血清培地により培養した口腔内細胞を用いる。
好ましくは、本発明の歯周組織再生用ゲル化組成物は、歯周欠損または抜歯した歯の周囲に注入または塗布し、長期にわたり被験者の歯の機能を維持するために使用される。
好ましくは、トロンビンとフィブリノゲンを混合することによってフィブリンが形成される。
好ましくは、フィブリンとして、被験者と同種のフィブリン又は自己血由来のフィブリンを使用する。
好ましくは、被験者と同種の血漿又は自己血漿を用いてフィブリンを形成する。
本発明の歯周組織再生用ゲル化組成物は、細胞(好ましくは、口腔内細胞)を、薬剤的に許容される生体吸収性ゲル化材料に懸濁することによって得られるものであるか、あるいは薬剤的に許容される生体吸収性ゲル化材料を形成できる材料に懸濁し、次いで、得られた混合物を用いて生体吸収性ゲル化材料を形成することによって得られるものであることを特徴とする。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
生後3〜5ヶ月齢のミニブタより、無菌的に埋伏歯を取り出し、10%の抗生剤を含むPBS溶液にて保存した。埋伏歯を取り出す際、ミニブタを吸入麻酔下におき、疼痛管理を行った後、埋伏歯の取り出しを行った。歯胚中の石灰化した部分を取り除き、メスにて組織を約2mmの小片にした。PBS溶液にて小片にした組織を5回洗浄した。
(1)細胞の準備方法
成犬のビーグル犬より無菌的に第二小臼歯を抜歯し、10%抗生剤を含むPBS溶液にて保存した。
抜歯をする際、ビーグル犬を全身麻酔下におき、疼痛管理を行った後、抜歯を行った。抜歯を行った歯より、歯根膜組織、歯髄組織を取り出し、メスにて組織を2mmの小片にした。PBS溶液にて小片した組織を5回洗浄した。
2mg/mlコラゲナーゼをDMEM培地に溶解した酵素溶液を用いて、洗浄した組織を50分間酵素処理した。
回収した細胞は、培養用の皿に播種し、目的の細胞数(2×106個)になるまで培養を行った。
目的の細胞数を確保できたら、培養用の皿から細胞を剥離し、遠心分離(1500rpm、5分)を行い、細胞をペレット状にした。
細胞を採取した同一のビーグル犬より採血を行った。採血を行う際、シリンジには抗凝固剤であるCitrate phosphate dextroseを予め入れていた。
採血後、全血を遠心分離(327×g、15分)を行い、血球成分と血漿成分を分離した。
血漿成分のみを取り出し、トロンビン生成用血漿とフィブリノゲン生成用血漿に分注した。通常50mlの採血を行った際、血漿成分は25〜30ml採取できるので、トロンビン精製には2.5mlの血漿を使用し、残りはフィブリノゲン精製用に使用した。
血漿にトラネキサム酸2〜3ml添加し、その後、終濃度10%の99%エタノールを加え混合した。20〜30分氷上にて反応させ、遠心分離(0〜4℃、3000×g、8分)を行った。上澄みを取り除き、37℃にて再溶解した。
血漿にクエン酸22.5ml添加し、混合した後、遠心分離(4℃、3000×g、5分)を行った。上澄みを取り除き、163μlの塩化カルシウムを添加し、沈殿物を溶解した。さらに炭酸水素ナトリウムを100μl加えた。
溶液の中にフィブリンの塊ができてくるので、それを取り除いた。
通常、フィブリノゲン溶液は生理食塩水にて2倍に希釈し、トロンビン溶液は、塩化カルシウム溶液にて10倍に希釈し、それぞれを同量混合することによってフィブリンが完成した。
歯根膜から採取した細胞をトロンビン溶液に懸濁してから第一臼歯の周囲に塗布すると同時にフィブリノゲン溶液も塗布をし、第一臼歯の周囲に細胞の懸濁したフィブリンをコートした。
元第一臼歯存在した場所に、歯科用のバーで欠損を作製し、フィブリンをコートした第一臼歯を移植した。移植部は歯肉で覆い、縫合を行った。
移植物は、移植後6週にて摘出した。μCTを撮影したところ、顎骨と歯牙の間に一定の距離があることが確認できた(図4)。
実施例2と同様の手順にて歯根膜由来の細胞を得た。実験に用いた細胞は、2継代目にてバンバンカー(GENETICS)を用いて凍結保存した。
冷凍保存した細胞は、37℃にて速やかに解凍し、DMEM培地にて希釈した。遠心分離(1500rpm 5分)を行い、上澄みに含まれているバンバンカーを取り除いた。DMEM培地にて3回洗浄を行い、培養容器に細胞を播種した。実験には、凍結から起して一回継代を行ったものを使用した。
図5の結果より自己血清を使用した培養では、牛血清を用いた培養と同様、もしくはそれ以上の細胞の増殖が確認された。
Claims (6)
- 口腔内細胞とトロンビンとフィブリノゲンとを混合することによって得られる、細胞とフィブリンのみからなる歯周組織再生用ゲル化組成物。
- 細胞をトロンビンとフィブリノゲンの一方に懸濁し、次いで、トロンビンとフィブリノゲンの他方を添加して生体吸収性ゲル化材料を形成することによって得られる、請求項1に記載の歯周組織再生用ゲル化組成物。
- 自己血清培地又は無血清培地により培養した口腔内細胞を用いる、請求項1又は2に記載の歯周組織再生用ゲル化組成物。
- 歯周欠損または抜歯した歯の周囲に注入または塗布し、長期にわたり被験者の歯の機能を維持するために使用される、請求項1から3の何れかに記載の歯周組織再生用ゲル化組成物。
- フィブリンとして、被験者と同種のフィブリン又は自己血由来のフィブリンを使用する、請求項1から4の何れかに記載の歯周組織再生用ゲル化組成物。
- 被験者と同種の血漿又は自己血漿を用いてフィブリンを形成する、請求項5に記載の歯周組織再生用ゲル化組成物。
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