BR112019008392B1 - Uso de uma composição bioativa óssea para promover a osteogênese e composição bioativa óssea que compreende uma solução salina à base de água - Google Patents

Abstract

Uma composição bioativa óssea e kits compreendendo a composição, meios para a sua aplicação e/ou um implante metálico são providos. A composição bioativa óssea compreende uma solução salina à base de água compreendendo di-hidrogenofosfato de sódio e cloreto de sódio, e pode também compreender elementos adicionais. A composição e os kits são úteis para promover osteogênese, particularmente quando um implante metálico é usado, mas também no caso de doenças periodontais.

Description

CAMPO DE INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se ao campo da biomedicina e particularmente a composições para uso na promoção da osteogênese. Especificamente, a presente invenção inclui composições para regeneração do tecido ósseo dentário quando é utilizado um implante e/ou no caso de doenças periodontais.

TÉCNICA ANTERIOR

[002] Um dos principais problemas que o campo de implantes enfrenta é a falha do enxerto adequado do implante no osso, levando à perda do implante. A fim de reduzir a falha do implante, várias modificações de propriedades superficiais específicas como estrutura, química, carga de superfície e molhabilidade TÊM SIDO investigadas para melhorar a ligação de proteínas e osteointegração de implantes de titânio (Albrektsson T, et al. “Osseointegrated titanium implants Requirements for ensuring a long-lasting, direct bone-to-implant anchorage in man” Acta Orthop Scand 1981,52:155-170).

[003] Alguns peptídeos e proteínas, incluindo colágeno e fibronectina, têm sido usados para melhorar a bioatividade dos materiais. Ambas as proteínas fazem parte das proteínas da matriz extracelular e foi provado promoverem a adesão celular a substratos (Mohan S, et al. “Bone growth fators” Clin Orthop Relat Res 1991,263:3048). Para a maioria dos tipos de células, incluindo as células do tecido conjuntivo, como osteoblastos e seus precursores, a adesão à matriz extracelular é essencial para a sobrevivência (Urist MR, et al. “Bone cell differentiation and growth fators” Science 1983,220:680-686; Wozney JM, et al. “Growth fators influencing bone development” J Cell Sci Suppl 1990,13:149-156; Anselme K “Osteoblast adhesion on biomaterials” Biomaterials 2000,21:667).

[004] Além disso, foi previamente demonstrado que a carga líquida negativa do óxido de superfície da liga aumentou a capacidade intrínseca da proteína de se ligar aos receptores de integrinas de células osteogênicas e promover a disseminação celular (Anselme K “Osteoblast adhesion on biomaterials” Biomaterials 2000,21:667; Scotchford CA, et al. “Chemically patterned, metal-oxide-based surfaces produced by photolithographic techniques for studying protein- and cell-interactions. II: Protein adsorption and early cell interactions” Biomaterials 2003,24:1147; Steele JG, et al. “Attachment of human bone cells to tissue culture polystyrene and to unmodified polystyrene: the effect of surface chemistry upon initial cell attachment” J Biomater Sci Polym Ed 1993,5:245; Howlett CR, et al. “Mechanism of initial attachment of cells derived from human bone to commonly used prosthetic materials during cell culture” Biomaterials 1994,15:213; Kilpadi KL, et al. “Hydroxylapatite binds more serum proteins, purified integrins, and osteoblast precursor cells than titanium or steel” J Biomed Mater Res 2001,57:258; García AJ “Get a grip: integrins in cell-biomaterial interactions” Biomaterials 2005,26:7525).

[005] US20070213832 (Wen Hai B) descreve um implante de fosfato de cálcio que é imerso em HBSS (solução salina tamponada de Hank) ou PBS comum por 5 dias, enxaguado com água destilada e então seco ao ar por 24 horas, resultando na observação microscópica de uma camada mineral nanoporosa. O documento não descreve nenhum efeito biológico derivado do processo acima. A camada mineral é usada como veículo de entrega para composições bioativas. Nesse sentido, o documento revela que uma capacidade osteogênica pode ser alcançada incorporando nos agentes bioativos da camada mineral, como fatores de crescimento. Assim, o efeito osteogênico não está ligado à camada mineral em si ou ao uso da composição do PBS, mas aos agentes bioativos incorporados na camada mineral.

[006] Lindahl C, 2012 descreve um método para formar uma superfície semelhante à apatita em substratos de titânio para imitar o osso natural, compreendendo a etapa de imersão do substrato de titânio em PBS ou SBF (Fluido Corporal Simulado - Kokubo) normalmente a 37 °C por um período de dias a semanas, secando e esterilizando. O resultado é uma superfície semelhante à apatite que pode ser ainda modificada ou funcionalizada para melhorar as propriedades do revestimento de implante, por exemplo, por incorporação de drogas promotoras do osso como o bifosfonato (Lindahl C. "Biomimetic deposition of hydroxyapatite on titanium implant materials" Uppsala Univ. 1 Janeiro de 2012, páginas 978-91).

[007] Da mesma forma, Lindberg F et al., 2008 descreve um método para formar uma superfície semelhante à apatita em material de titânio, compreendendo imersão em solução de PBS pré-aquecida a 37 °C de 1 a 4 semanas, enxaguando com água deionizada e secando ao ar. Após esse processo, a hidroxiapatita precipitada pode ser observada por DRX (Lindberg F. et al., "Hydrohylapatite growth onf single crystal rutile substrates" Biomaterials, Elsevier Science Publishers BV, Barking GB, vol. 29, no 23, 1 Agosto de 2008, páginas 3317-23)

[008] Além disso, outro grande problema enfrentado na odontologia é o tratamento e a prevenção da peri-implantite e periodontite. Peri-implantite é definida como um processo inflamatório destrutivo que afeta os tecidos moles e duros implantes circundantes ao implante dentário produzido ou induzido por bactérias que colonizam implantes dentários e seus arredores. Por outro lado, a periodontite é caracterizada pela destruição do tecido conjuntivo e do suporte ósseo dentário após uma resposta de hospedeiro inflamatória secundária à infecção por bactérias periodontais. Ambas as doenças são atualmente tratadas com antibióticos e com higiene dental aumentada ou melhorada. No entanto, elas ainda levam algumas vezes à perda do implante ou do dente e/ou danos severos no tecido circundante (tecido conectivo e osso dental).

[009] Assim, permanece a necessidade de fornecer meios para evitar a falha do implante e, assim, promover um enxerto adequado do implante, mais especificamente, com implantes dentários que são geralmente implantes de titânio. Além disso, tal como acima referido, permanece também a necessidade de encontrar composições para uso no tratamento ou prevenção das doenças periodontais com perda de tecido ósseo tal como periodontite e peri-implantite.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[010] Um problema a ser resolvido pela presente invenção pode ser visto como relacionado à provisão de meios capazes de evitar a falha do implante e promover apropriadamente o enxerto do implante com os tecidos circundantes, especificamente quando são utilizados implantes dentários.

[011] A solução é baseada na provisão de composições e kits que foram surpreendentemente encontrados os quais promovem a osteogênese. Especificamente, eles promovem, aumentam e aceleram a osteogênese do tecido ósseo circundante do implante, regenerando ou remodelando o tecido ósseo, promovendo o enxerto do implante e evitando a perda do implante.

[012] Uma vez que as composições e kits da invenção promovem a osteogênese por si mesmos, eles também são úteis no tratamento de doenças periodontais com perda de tecido ósseo, como periodontite e peri-implantite.

[013] Por conseguinte, um primeiro aspecto da invenção refere-se a uma composição bioativa óssea compreendendo uma solução salina à base de água compreendendo hidrogenofosfato dissódico e cloreto de sódio, para uso na promoção da osteogênese.

[014] O termo "composição bioativa óssea" significa que a composição é ativa ou reativa com o tecido ósseo; isto é, que tem um efeito, interage ou provoca uma resposta do tecido ósseo. Em outras palavras, isso significa que a composição interage e reage com o tecido ósseo em alguma extensão. A extensão máxima dessa "bioatividade" ou reação seria o reparo ósseo. O termo "bioativo" é normalmente usado no campo de implantes e próteses; por exemplo, "vidros bioativos" são um grupo de biomateriais vitrocerâmicos reativos à superfície. Eles são biocompatíveis e bioativos, sendo, portanto, úteis como materiais de implantes no corpo humano para reparar e substituir ossos doentes ou danificados.

[015] O termo "promoção da osteogênese" tem o significado geralmente entendido na técnica; isto é, promovendo o desenvolvimento e a formação de osso. A osteogênese é também conhecida como ossificação e é o processo de estabelecer novo material ósseo por células chamadas osteoblastos.

[016] Outro aspecto da invenção refere-se a uma composição bioativa óssea compreendendo uma solução salina à base de água compreendendo hidrogenofosfato dissódico em uma concentração de 8 a 12 mM na solução, cloreto de sódio em uma concentração de 130 a 140 mM na solução, hidrogenofosfato de potássio em uma concentração de 1,4 a 2,2 mM na solução, cloreto de potássio em uma concentração de 2,3 a 3,1 mM na solução, um sal de cálcio em uma concentração de 7 a 15 mM na solução, um sal de um metal divalente diferente de cálcio em uma concentração de 2 a 12 mM na solução e um agente quelante.

[017] Outro aspecto da invenção é a composição bioativa óssea como descrita acima para uso na promoção da osteogênese.

[018] Outro aspecto da invenção é um kit compreendendo uma composição como descrita acima e um implante.

[019] Outro aspecto da invenção é o uso dos kits mencionados acima na promoção da osteogênese.

[020] Outro aspecto da invenção é um processo para preparar a composição de acordo com o primeiro aspecto compreendendo a mistura de todos os elementos na forma sólida da composição com água até a completa homogeneização.

[021] Um outro aspecto da invenção refere-se ao uso de uma composição bioativa óssea, de acordo com o primeiro aspecto, para tratar a superfície de um implante metálico antes da implantação.

[022] Acredita-se que a presente invenção proporciona a primeira composição líquida que promove a osteogênese, com uma aplicação muito fácil e particularmente útil quando se utiliza um implante metálico. Por conseguinte, com a composição da invenção não é necessário modificar a superfície do implante para melhorar a ligação às proteínas e a osteointegração dos implantes; que são as estratégias atualmente utilizadas na técnica. Sem se limitar à teoria, acredita-se que as composições aqui propostas promovem a osteogênese, favorecendo a formação óssea, aumentando a produção de tecido ósseo e melhorando a qualidade do osso produzido. Isto é observado no Exemplo 1 fornecido abaixo, onde é estudada a influência da composição bioativa óssea na expressão de marcadores ósseos em culturas de células in vitro. A expressão diferente dos genes mostrados nas Figuras 1 e 2 está correlacionada com o favorecimento da formação óssea. Além disso, quando o implante é tratado com a composição bioativa óssea da presente invenção, a produção de osso é aumentada e a qualidade do osso produzido é maior.

[023] Como segundo ponto vantajoso, a composição bioativa óssea acelera enormemente o processo de formação óssea. Esta descoberta é confirmada com o estudo no Exemplo 2 e a FIG. 3 da influência da composição bioativa óssea na excreção de cálcio e na atividade da Fosfatase Alcalina (ALP) durante a formação óssea em culturas celulares in vitro. Pode ser visto que, no caso de culturas celulares com discos de implante tratadas com a composição bioativa óssea, o pico de excreção de cálcio pode ser visto mais cedo (vide aumento no dia 3), mostrando uma formação anterior do osso (FIG. 3). Em relação à ALP, um aumento na atividade da referida proteína também está relacionado com a formação óssea. Os resultados obtidos para a atividade de ALP aparecem resumidos na FIG. 4. Uma tendência semelhante à que se vê na FIG. 3 pode ser vista na FIG. 4, isto é, o pico precoce no dia 3 da atividade de ALP mostrando a formação óssea inicial. Portanto, os resultados obtidos para a concentração de cálcio e a atividade de ALP se correlacionam perfeitamente e são consistentes com uma formação óssea precoce induzida pela composição bioativa óssea da presente invenção.

[024] Estas observações são confirmadas in vivo quando se estuda a influência da composição bioativa óssea no enxerto de implante-osso em coelhos (Exemplo 3). Para este estudo foram utilizados 60 implantes dentários divididos em três grupos: Um implante sem tratamento; Implante B + composição ativa óssea a pH 7,4; e implante C + composição ativa óssea a pH 7,6. Em termos gerais, das FIGs. 5 a 7, pode-se observar que uma formação anterior do osso é induzida nos Grupos B e C (ainda mais cedo e maior no último). Esta diferença foi mantida durante todo o período experimental (isto é, até o dia 60). Além disso, da tabela 3 é também derivado um BIC mais precoce e aumentado (Contato Osso-Implante) nos grupos B e C em comparação ao grupo A. Além disso, e surpreendentemente, como também visto nas FIGs 5 a 7, o grupo C mostrou também um aumento em todos os pontos de tempo quando comparado com o grupo B.

[025] Assim, notavelmente, sem as composições e kits da invenção, um implante dentário leva três meses para enxertar apropriadamente, enquanto ao utilizar as composições e kits da invenção, o enxerto é grandemente acelerado e demora apenas 15 dias. Isso representa uma grande vantagem para o paciente e para o médico.

[026] Foi observado nas experiências aqui apresentadas (por exemplo, Exemplo 4 e Figura 9) que diferentes composições descritas acima são úteis na promoção da osteogênese. Especificamente a FIG. 9 mostra que a composição básica de PBS aumenta o crescimento ósseo. Dois diferentes PBS comerciais foram testados adicionalmente e todos eles deram resultados semelhantes. O PBS comercial, que contém baixas concentrações de CaCl2 + MgCl2, também melhora o crescimento ósseo. Além disso, a combinação PBS + EDTA aumenta o crescimento ósseo em uma extensão similar ao PBS. No entanto, notadamente, a combinação PBS + CaCl2 + MgCl2 com maiores concentrações de CaCl2 + MgCl2 apresenta maior capacidade osteogênica em comparação ao tratamento apenas com PBS ou PBS + EDTA e a combinação de PBS + CaCl2 + MgCl2 + EDTA mostra e ainda mais surpreendente capacidade em comparação com os outros tratamentos.

[027] Além disso, o exemplo 6 mostra que a composição bioativa óssea é capaz de promover a osteogênese em combinação com uma grande variedade de materiais, também ao usar biomateriais para reconstrução óssea (como xenoenxertos ou material de dentes desgastados) em vez de implantes metálicos.

[028] Notavelmente, a composição bioativa óssea é capaz de promover a osteogênese sem a presença de implante. Os resultados do exemplo 7 mostram, devido ao uso da composição bioativa óssea, uma melhor calcificação das células semelhantes a cementoblastos juntamente com uma recuperação das fibrilas de colágeno do ligamento periodontal, que é o principal defeito na periodontite.

[029] As composições da invenção também mostram vantagens relevantes do ponto de vista prático. Todos os elementos da composição bioativa óssea são usados na condição GMP; a composição pode ser usada para qualquer tipo de superfície de titânio; sua fabricação não é complicada e não é cara; o procedimento é muito fácil porque o implante é submerso apenas 2 minutos na composição bioativa óssea antes da inserção no osso, assim, a manipulação da composição bioativa óssea é fácil em procedimentos cirúrgicos para regeneração óssea ou peri-implantite.

[030] A descrição detalhada e os exemplos mostrados abaixo são apresentados com o objetivo de proporcionar aos versados na técnica uma explicação suficientemente clara e completa desta invenção, mas não devem ser considerados limitações aos aspectos essenciais nela contemplados, como apresentados nas seções anteriores desta descrição.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Composição compreendendo solução salina à base de água e sua preparação

[031] A invenção proporciona uma composição bioativa óssea compreendendo uma solução salina à base de água compreendendo hidrogenofosfato dissódico e cloreto de sódio, que é útil para uso na promoção da osteogênese.

[032] Em uma modalidade particular, o hidrogenofosfato dissódico está em uma concentração de 8 a 12 mM na solução e o cloreto de sódio está em uma concentração de 130 a 140 mM na solução. Particularmente, hidrogenofosfato dissódico está em uma concentração de 9 a 11 mM na solução. De preferência, a concentração de hidrogenofosfato dissódico está em um valor ou em um subintervalo entre 8 e 12 mM, isto é, em 8 mM, 8,5 mM, 9 mM, 9,5 mM, 10 mM, 10,5 mM, 11 mM, 11,5 mM ou 12 mM. Mais preferivelmente, a concentração de hidrogenofosfato dissódico é de 10 mM e, mais preferivelmente, de 10,14 mM.

[033] Independentemente, em uma modalidade particular, o cloreto de sódio está em uma concentração de 130 a 140 mM na solução. Particularmente, o cloreto de sódio está em uma concentração de 132 a 138 mM na solução. De preferência, a concentração de cloreto de sódio está em um valor ou em um subintervalo entre 130 a 140 mM, isto é, em 130 mM, 130,5 mM, 131 mM, 131,5 mM, 132 mM, 133,5 mM, 133,5 mM 134 mM, 134,5 mM, 135 mM, 135,5 mM, 136 mM, 136,5 mM, 137 mM, 137,5 mM, 138 mM, 138,5 mM, 139 mM, 139,5 mM ou 140 mM. Mais preferivelmente, a concentração de cloreto de sódio é 137 mM e, mais precisamente, de 136,99 mM.

[034] Em uma modalidade particular, a solução salina à base de água adicionalmente compreende hidrogenofosfato de potássio ou cloreto de potássio.

[035] Em outra modalidade particular, a solução salina à base de água adicionalmente compreende hidrogenofosfato de potássio e cloreto de potássio.

[036] Em uma modalidade mais particular, hidrogenofosfato de potássio está em uma concentração de 1,4 a 2,2 mM na solução. Particularmente, o hidrogenofosfato de potássio está em uma concentração de 1,6 a 2 mM na solução. De preferência, a concentração de hidrogenofosfato de potássio está em um valor ou em um subintervalo entre o intervalo de 1,4 a 2,2 mM, isto é em 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,1 mM ou 2,2. mM. Mais preferivelmente, a concentração de hidrogenofosfato de potássio é 1,8 mM e mais preferivelmente 1,76 mM.

[037] Em uma outra modalidade particular, o cloreto de potássio está em uma concentração de 2,3 a 3,1 mM na solução. Mais particularmente, o cloreto de potássio está em uma concentração de 2,5 a 2,9 mM na solução. De preferência, a concentração de cloreto de potássio está em um valor ou em um subintervalo entre o intervalo 2,3 a 3,1 mM, isto é em 2,3 mM, 2,4 mM, 2,5 mM, 2,6 mM, 2,7 mM, 2,8 mM, 2,9 mM, 3,0 mM. ou 3,1 mM. Mais preferivelmente, a concentração de cloreto de potássio é 2,7 mM e, mais precisamente, 2,68 mM.

[038] Em uma modalidade particular, o pH da solução está entre 7,0 e 8,0. Mais particularmente, o pH está entre 7,0 e 7,8. Particularmente, o pH está em um valor ou em um subintervalo entre o intervalo de 7,0 e 8,0, ou seja, em 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 ou 8,0. Mais preferivelmente, o pH está entre 7,4 e 7,8. Mais preferivelmente, o pH está entre 7,5 e 7,7. Mais preferivelmente, o pH da solução é 7,6. É digno de nota que, surpreendentemente, a composição da presente invenção a pH 7,6 mostra efeitos ainda maiores, como será evidente a partir dos exemplos incluídos abaixo. Mais especificamente, a composição da presente invenção, quando utilizada no referido pH, mostrou uma formação óssea ainda mais precoce e uma formação óssea aumentada.

[039] Em uma modalidade particular, a solução salina à base de água adicionalmente compreende cloreto de magnésio e cloreto de cálcio. Alternativamente, a solução pode compreender um sal de magnésio e um sal de cálcio com um contraíon diferente mas equivalente ao cloreto, que não interfere na solução. Em outra modalidade particular, a solução compreende um sal de cálcio e um sal de um metal divalente diferente do cálcio. O metal divalente pode ser, por exemplo, berílio, magnésio, estrôncio, bário, rádio, zinco, cobre, níquel, manganês (2+), ferro (2+), cromo (2+), platina (2+) ou mercúrio (2+). Em uma modalidade particular, o cloreto de magnésio ou o sal de um metal divalente diferente do cálcio está em uma concentração de 2 a 12 mM na solução e o cloreto de cálcio ou o sal de cálcio está em uma concentração de 7 a 15 mM na solução. De preferência, o cloreto de magnésio ou o sal de um metal divalente diferente do cálcio está em uma concentração de 4 a 10 mM. Preferivelmente, a concentração de cloreto de magnésio ou o sal de um metal bivalente diferente de cálcio está em um valor ou em um subintervalo entre o intervalo 2 a 12 mM, isto é 2,0 mM, 2,5 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, 5,5 mM, 6,0 mM, 6,5 mM, 7,0 mM, 7,5 mM, 8,0 mM, 8,5 mM, 9,0 mM, 9 0,5 mM, 10,0 mM, 10,5 mM, 11,0 mM, 11,5 mM ou 12,0 mM. Mais preferivelmente, a concentração de cloreto de magnésio ou o sal de um metal divalente diferente do cálcio na solução é de 8,4 mM.

[040] Independentemente, em uma modalidade particular, o cloreto de cálcio ou o sal de cálcio está em uma concentração de 7 a 15 mM na solução. Particularmente, o cloreto de cálcio ou o sal de cálcio está em uma concentração de 9 a 12 mM na solução. De preferência, a concentração de cloreto de cálcio ou sal de cálcio está em um valor ou em um subintervalo entre o intervalo 7 a 15 mM, isto é, em 7,0 mM, 7,5 mM, 8,0 mM, 8,5 mM, 9,0 mM, 9,5 mM, 10,0 mM, 10,5 mM, 11,0 mM, 11,5 mM, 12,0 mM, 12,5 mM, 13,0 mM, 13,5 mM, 14,0 mM, 14,5 mM ou 15,0 mM. Mais preferivelmente, a concentração de cloreto de cálcio ou sal de cálcio é de 10,81 mM.

[041] Em uma modalidade particular, a solução salina à base de água adicionalmente compreende um agente quelante. Em uma modalidade mais particular, o agente quelante é EDTA. Em uma modalidade particular, a concentração de EDTA na composição é de 25 mM a 100 mM. Particularmente, o EDTA está em uma concentração de 40 a 80 mM na solução. Preferivelmente, a concentração de EDTA esté em um valor ou em um subintervalo entre o intervalo de 25 mM a 100 mM e, preferivelmente, a 68,44 mM.

[042] Em outro aspecto, a invenção provê uma composição bioativa óssea compreendendo uma solução salina à base de água compreendendo hidrogenofosfato dissódico em uma concentração de 8 a 12 mM na solução, cloreto de sódio em uma concentração de 130 a 140 mM na solução, hidrogenofosfato de potássio em uma concentração de 1,4 a 2,2 mM na solução, cloreto de potássio em uma concentração de 2,3 a 3,1 mM na solução, um sal de cálcio em uma concentração de 7 a 15 mM na solução, um sal de um metal divalente diferente de cálcio em uma concentração de 2 a 12 mM na solução e um agente quelante.

[043] Em uma modalidade particular, o sal de cálcio é o cloreto de cálcio e o sal de um metal divalente diferente do cálcio é o cloreto de magnésio.

[044] Em uma modalidade particular, a composição bioativa óssea para promoção da osteogênese compreende uma solução salina à base de água compreendendo hidrogenofosfato dissódico, cloreto de sódio, hidrogenofosfato de potássio, cloreto de potássio, cloreto de magnésio, cloreto de cálcio e EDTA. Em uma modalidade particular, a composição compreende uma solução salina à base de água compreendendo uma solução salina à base de água compreendendo di-10 mM de hidrogenofosfato de sódio, 137 mM de cloreto de sódio, 1,8 mM de hidrogenofosfato de potássio, 2,7 mM de cloreto de potássio, 8,4 mM de cloreto de magnésio 10,8 mM de cloreto de cálcio e 68,4 mM de EDTA. Em uma modalidade mais particular, a composição compreende uma solução salina à base de água compreendendo 136,99 mM de NaCl, 2,68 mM de KCl, 10,14 mM de Na2HPO4, 1,76 mM de KH2PO4, 8,4 mM de MgCl2, 10,81 mM de CaCl2 e 68,44 mM de EDTA, em um pH entre 7,0 e 7.8, e mais preferivelmente de 7.6.

[045] Assim, uma composição bioativa óssea particularmente útil para os objetivos da invenção compreende uma solução salina à base de água compreendendo 10 mM de hidrogenofosfato dissódico, 137 mM de cloreto de sódio, 1,8 mM de hidrogenofosfato de potássio, 2,7 mM de cloreto de potássio, 8,4 mM de cloreto de magnésio, 10,8 mM de cloreto de cálcio e 68,4 mM de EDTA. Em uma modalidade particular, o pH da solução é 7,6.

[046] Outro aspecto da invenção refere-se a uma composição bioativa óssea como definida acima, para uso na promoção da osteogênese. Os exemplos apresentados demonstram que diferentes composições são úteis na promoção da osteogênese para os fins da invenção. Estas incluem particularmente composições baseadas apenas em hidrogenofosfato dissódico e cloreto de sódio; composições adicionalmente compreendendo hidrogenofosfato de potássio e/ou cloreto de potássio; composições adicionalmente compreendendo cloreto de magnésio e cálcio e composições adicionalmente compreendendo EDTA.

[047] Alguns exemplos de soluções comercialmente disponíveis são aqui descritos como exemplos de composições que também podem ser utilizadas para os propósitos da invenção. A solução salina à base de água utilizada na invenção é frequentemente referida como "Solução Salina Tamponada com Fosfato" (abreviada como PBS). PBS refere-se a uma solução tamponada contendo pelo menos um fosfato e que é habitualmente utilizado para realizar técnicas de biologia molecular e em cultura de células, para realizar lavagens e/ou preparar reagentes. Os componentes básicos são hidrogenofosfato dissódico e cloreto de sódio e, em algumas formulações, cloreto de potássio e di-hidrogenofosfato de potássio. A osmolaridade e as concentrações de íons das soluções combinam com as do corpo humano (isotônico). O PSB pode ser armazenado à temperatura ambiente.

[048] Existem muitas maneiras diferentes de preparar soluções PBS. Algumas formulações não contêm potássio e magnésio, enquanto outras contêm cálcio e/ou magnésio. Alguns exemplos de PBS são descritos aqui. Tabela A. A composição mais comum de PBS (1X)

[049] Método de preparação: Comece com 800 mL de água destilada para dissolver todos os sais. Ajuste o pH para 7,4 com HCl. Adicione água destilada a um volume total de 1 litro. O 1x PBS resultante deve ter uma concentração final de 10 mM de PO43-, 137 mM de NaCl e 2,7 mM de KCl. Tabela B. Protocolo Cold Spring Harbor:

[050] O pH da solução de estoque 10x de PBS é ~ 6,8, mas quando diluído com água para 1x PBS deve mudar para 7,4. Ao fazer soluções tamponada, é recomendável sempre medir o pH diretamente usando um medidor de pH. Se necessário, o pH pode ser ajustado usando ácido clorídrico ou hidróxido de sódio.

[051] A maneira mais simples de preparar uma solução de PBS é usar comprimidos ou bolsas de tampão PBS. Eles são formulados para fornecer uma solução PBS pronta para uso após a dissolução em uma quantidade especificada de água destilada. Eles estão disponíveis nos volumes padrão: 100, 200, 500 e 1000 mL e 10, 25, 50 e 100 L.

[052] O PBS pode ser armazenado em temperatura ambiente ou na geladeira. Contudo, as soluções concentradas podem precipitar quando arrefecidas e devem ser mantidas à temperatura ambiente até o precipitado ter se dissolvido completamente antes do uso. Tabela C. Solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Cold Spring Harbor)

[053] O PBS pode ser feito como uma solução de 1x ou como um estoque de 10x. Para preparar 1 L de 1 x ou 10 x PBS, dissolver os reagentes listados acima em 800 mL de H2O. Ajustar o pH para 7,4 (ou 7,2, se necessário) com HCl, e depois adicionar H2O a 1 L. Dispensar a solução em alíquotas e esterilizá-las em autoclave por 20 min a 15 psi (1,05 kg/cm2) no ciclo líquido ou esterilização por filtro. Armazenar o PBS à temperatura ambiente.

[054] Para um estoque de 10 litros de 10x PBS pode ser preparado dissolvendo: 800 g de NaCl, 20 g de KCl, 144 g de Na2HPO4 • 2H2O 24 g de KH2PO4 8 L de água destilada.

[055] Após a mistura completa, completar a solução final para 10 L. O pH do estoque de 10X será de aproximadamente 6,8, mas quando diluído para 1x PBS deve mudar para 7,4. Ao fazer soluções tamponadas, é recomendável sempre medir o pH diretamente usando um medidor de pH. Se necessário, o pH pode ser ajustado usando ácido clorídrico ou hidróxido de sódio.

[056] Na diluição, o 1x PBS resultante deve ter uma concentração final de 137 mM de NaCl, 10 mM de fosfato, 2,7 mM de KCl e um pH de 7,4.

[057] O pH é ajustado com um ácido ou uma base, por exemplo com ácido clorídrico ou ácido fosfórico e hidróxido de sódio.

[058] O PBS também é referido como 10 mM de PBS porque a concentração de Na2HPO4 é 10 mM (PBS 1 x 1L).

[059] Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco (DPBS): Não existe diferença significativa entre PBS e DPBS, a menos que DPBS tenha menos concentração de fosfato; a concentração de Na2HPO4 é 10 mM em PBS e 8,1 mM em DPBS e a concentração de KH2PO4 é 1,8 mM em PBS e 1,41 mM em DPBS.

Formas de produto

[060] A composição de acordo com a invenção é geralmente em forma líquida pronta a ser utilizada; por conseguinte, pode ser vendida comercialmente como líquido em um recipiente adequado, em doses únicas (por exemplo, 1 ml, 2 ml, 3 ml, 5 ml, 10 ml ou mais, ou em um volume superior (por exemplo, 25 ml, 50 ml, 100 ml, 1 litro, 10 litros).

[061] A composição também pode adotar formas adequadas para facilitar a aplicação, por exemplo, na forma de gel a ser aplicado na área a ser tratada ou nos tecidos que circundam o implante. Assim, em modalidades particulares, a composição está na forma líquida, na forma de um gel, um verniz ou um spray.

[062] Em uma modalidade particular, os elementos da composição estão na forma sólida, com todos os elementos da composição juntos em um único recipiente ou em diferentes recipientes (por exemplo, um frasco) ou na forma de comprimido sólido, em ambos os casos, para ser reconstituído imediatamente antes de usar. Para este fim, o produto comercial pode compreender os elementos da composição em um recipiente / recipientes ou na forma de comprimido, e um volume de água em um recipiente, perfeitamente medido para ser misturado com os elementos sólidos, conseguindo assim as concentrações de solução final especificadas em outras seções desta descrição. Adicionalmente, a água pode ser acidificada ou basificada de forma a obter o pH desejado quando se mistura com os elementos da composição.

[063] O especialista irá rotineiramente selecionar as quantidades dos elementos da composição para obter uma composição final compreendendo uma solução salina à base de água, dependendo dos volumes finais de composição.

[064] O termo "recipiente" aqui é usado para denotar qualquer recipiente, tendo um fecho que é adequado para embalar uma quantidade de dosagem unitária de uma composição sólida ou líquida. Será entendido que formas equivalentes de embalagem, tais como um frasco, uma ampola, uma seringa descartável, um cartucho de seringa ou uma seringa pré-cheia, são englobados por esta modalidade da invenção. Os recipientes devem ser feitos de um material para preservar a estabilidade dos elementos da composição para, de preferência, armazená-los à temperatura ambiente, mas também refrigerados.

[065] Um aspecto da invenção como acima mencionado é um kit compreendendo uma composição como definida acima e um implante.

[066] O termo "implante" é entendido amplamente como qualquer material ou estrutura para restaurar ossos ausentes, em parte ou em um todo. Implante é entendido como sinônimo de prótese. Dependendo do material, os implantes usados na engenharia de tecido ósseo podem ser classificados em implantes de metais e ligas (titânio, ligas de Cobalto-Cromo-Molibdênio) e implantes não metálicos feitos basicamente de cerâmica, que podem ser cerâmicas inertes (alumina, carbono, zircônia) e cerâmicas bioativas (vidros e cerâmicas bioativas, fosfatos de cálcio e hidroxiapatita). Os implantes não metálicos também podem ser feitos de polímeros.

[067] Particularmente, o implante é um implante de metal. O implante de metal ou a prótese de metal pode ser qualquer um usado em odontologia e traumatologia. Em uma modalidade particular, o implante de metal é um implante dentário. Os implantes dentários são geralmente feitos de titânio com tolerâncias muito específicas e precisas. As ligas de titânio mais importantes para aplicações clínicas são Ti-6Al-4V, Ti-3Al-2.5V e Ti-6Al-7Nb. Os implantes dentários também são feitos de óxido de zircônio monolítico. Particularmente, o implante de metal dentário é um implante de titânio dentário.

[068] Em uma modalidade particular, o implante é feito de um biomaterial. Os biomateriais de substituição de tecido ósseo disponíveis comumente usados incluem autoenxertos, aloenxertos, xenoenxertos e aloplastos. Os aloenxertos são derivados de um doador da mesma espécie, que pode ser um osso fresco / congelado, liofilizado ou osso liofilizado desmineralizado. Os xenoenxertos são obtidos de outra espécie e são amplamente utilizados em aplicações regenerativas periodontais clínicas. Os materiais aloplásticos incluem cerâmicas e polímeros e são naturais ou sintéticos. Exemplos de aloplastos são vidros bioativos, fosfatos de cálcio (hidroxiapatita, fosfato tricálcico e outros fosfatos de cálcio - brushita, monetita, polifosfatos de cálcio / CPP -) e sulfato de cálcio. Exemplos particulares de enxertos ósseos comercialmente disponíveis para aplicações de reconstrução óssea são descritos em Sheikh Z, et al. "Natural graft tissues and synthetic biomaterials for periodontal and alveolar bone reconstructive applications: a review" Biomater Res. 2017; 21: 9.

[069] Em uma modalidade particular, o kit compreende o implante e a composição da invenção em partes separadas. Contudo, em uma modalidade particular, a apresentação comercial é o implante submerso na composição líquida em um recipiente. Em uma modalidade particular, o kit adicionalmente compreende meios para aplicar a composição; os referidos meios são explicados a seguir.

[070] A proposta da invenção também pode ser útil para promover a regeneração óssea de áreas que não estão em contato com um implante, mas com a presença de perda óssea. Exemplos dos itens acima são no caso de doenças periodontais. Em alguns casos, o artigo de fabricação é apenas a composição na forma líquida ou sólida, porque o profissional tem à sua disposição os outros elementos para preparar a composição e usar e aplicar a composição ao paciente (por exemplo, água e meios para aplicação). No entanto, outro aspecto da invenção é um kit compreendendo uma composição de acordo com o primeiro aspecto e meios para aplicar a composição à área a ser tratada. Particularmente, os meios para aplicar a composição são uma seringa, uma barra de algodão e uma gaze têxtil. Em uma modalidade particular, os meios são para aplicar a composição à cavidade bucal.

[071] Os meios preferidos para aplicar a composição em caso de peri- implantite ou periodontite (isto é, que é necessária uma aplicação à bolsa óssea) são um protetor bucal, também conhecido como placas oclusais, boquilha, protetor de gengiva, protetor de bruxismo, ou contentor dentário. Este é um aparelho dental removível para encaixar os arcos superiores ou inferiores dos dentes.

[072] Em outra modalidade, também para facilitar o uso, o kit adicionalmente compreende meios para adicionar água ao recipiente com a composição na forma sólida. Os meios são de preferência uma seringa equipada com uma agulha perfurante descartável que é usada para puxar água do seu recipiente e colocar no recipiente com a composição na forma sólida.

[073] Outro aspecto da invenção é o uso dos kits descritos acima para uso na promoção da osteogênese.

[074] Além dos elementos citados nesta descrição conformando a solução à base de água, a composição da invenção pode compreender elementos adicionais, veículos ou excipientes, adequados a ter uma composição biocompatível. Esses produtos podem adotar a forma de um produto farmacêutico, um medicamento, um suplemento alimentar ou um produto de higiene bucal.

[075] Os versados na técnica utilizarão outras formas de apresentação apropriadas para a composição da invenção, normalmente utilizadas nas indústrias de reagentes farmacêuticos e químicos.

Aplicações das Composições e kits

[076] Como discutido acima, um aspecto da invenção refere-se a uma composição bioativa óssea como descrita acima, para uso na promoção da osteogênese. Este aspecto pode ser alternativamente formulado como o uso de qualquer uma das composições da invenção para a fabricação de um produto farmacêutico, um medicamento, um suplemento alimentar ou um produto de higiene oral para promover a osteogênese. Este aspecto também pode ser alternativamente formulado como um método para promover a osteogênese, compreendendo administrar ao objeto que dele necessite uma quantidade eficaz de qualquer uma das composições da invenção. Alternativamente, também pode ser formulado como o uso de uma composição bioativa óssea, como descrito acima, na promoção da osteogênese. O mesmo aspecto pode também ser formulado como um método de promoção da osteogênese usando uma composição bioativa óssea como descrito acima.

[077] Assim, a invenção proporciona uma composição bioativa óssea para uso de um medicamento.

[078] Em uma modalidade particular, a composição bioativa óssea é utilizada na promoção da osteogênese quando é utilizada um implante.

[079] Em uma modalidade particular, o implante de metal é um implante de titânio dentário. O uso da composição ou dos kits da presente invenção favorece um enxerto precoce do implante de metal, induzindo a formação anterior do osso em torno do implante e, também aumentando a quantidade assim como a qualidade do osso formado. Além disso, o osso formado é de maior qualidade. Todas as características acima contribuem para um enxerto mais precoce e mais forte do implante, bem como para uma menor perda de implantes. Sem as composições e kits da invenção, um implante dentário leva três meses para enxertar apropriadamente, enquanto usa as composições e kits da invenção, o enxerto é grandemente acelerado e leva apenas 15 dias. Isso representa uma grande vantagem para o paciente e para o médico.

[080] Assim, as composições ou kits da presente invenção são utilizados para melhorar o enxerto de implantes metálicos (preferivelmente implantes de titânio dentário).

[081] Além disso, uma vez que a composição da presente invenção induz a ossificação precoce e/ou aumentada, também foi considerada útil no tratamento de doençãs periodontais, tais como periodontite e peri-implantite, duas doenças associadas a infecções bacterianas que afetam o tecido conjuntivo e o osso dentário, levando à sua destruição e perda de implantes ou dentes, respectivamente. A referida composição, devido à sua capacidade de geração precoce e acelerada e aumentada dos ossos, é também útil para promover a osteogênese no tratamento de uma doença periodontal, tal como a peri-implantite e a periodontite. Ela pode ser alternativamente formulada como um método para a prevenção e/ou tratamento de uma doença periodontal, compreendendo a administração ao indivíduo que dela necessite de uma quantidade eficaz de qualquer uma das composições da invenção. Notavelmente, a composição bioativa óssea é capaz de promover a osteogênese por si só, sem a presença de um material como ocorre na periodontite.

[082] Outro aspecto da invenção refere-se ao uso de uma composição bioativa óssea, para tratar a superfície de um implante metálico antes da implantação.

[083] O versado selecionará os volumes apropriados de composição de acordo com a superfície e condição a ser tratada. Em uma modalidade particular, a composição é aplicada à área até o sangramento da referida área, o que significa que as células estaminais surgiram. Em uma modalidade particular, alguns mililitros de composição são aplicados à área.

[084] Ao longo da descrição e reivindicações, a palavra "compreende" e suas variações não se destinam a excluir outras características técnicas, aditivos, componentes ou etapas. Objetos, vantagens e características adicionais da invenção tornar-se-ão evidentes para os versados na técnica após exame da descrição ou podem ser aprendidos pela prática da invenção. Além disso, a presente invenção abrange todas as combinações possíveis de modalidades particulares e preferidas aqui descritas. Os seguintes exemplos e desenhos são fornecidos aqui para fins ilustrativos, e sem pretender limitar-se à presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[085] FIG. 1. Análise da expressão gênica RT-PCR de marcadores de diferenciação (OC, COL I, RUNX2, ALP e ITGα4) na segunda semana de diferenciação celular. GAPDH foi usado como um gene de limpeza. A: Disco de titânio Ti-6Al-4V (AB/AE) tratado com composição bioativa óssea. B: Disco de titânio Ti-6Al- 4V com fosfato de cálcio (placa) tratado com composição bioativa óssea.

[086] FIG. 2. Análise por RT-PCR de marcadores osteogênicos (COL I, BMP2 e OCN) de DPPSC aos 21 dias de diferenciação celular. GAPDH foi usado como um gene de limpeza.

[087] FIG. 3. Atividade de ALP. Análise de atividade de cálcio de DPPSC e DPMSC aos dias 3,11 e 20 de diferenciação celular em discos de titânio tratados com composição bioativa óssea. GAPDH foi usado como um gene de limpeza.

[088] FIG. 4. Análise de atividade de ALP de DPPSC e DPMSC nos dias 3, 11 e 20 de diferenciação celular em discos de titânio tratados com composição bioativa óssea. GAPDH foi usado como um gene de limpeza.

[089] FIG. 5. Análise histomorfométrica de coelhos experimentais com o grupo A aos 15, 30, 45 e 60 dias.

[090] FIG. 6. Análise histomorfométrica de coelhos experimentais com o grupo B aos 15, 30, 45 e 60 dias.

[091] FIG. 7. Análise histomorfométrica de coelhos experimentais com o grupo C aos 15, 30, 45 e 60 dias.

[092] FIG. 8. Quantificações de neoformação óssea de coelhos experimentais com grupo A, B e C aos 15, 30, 45 e 60 dias.

[093] FIG. 9. Análise por Q RT-PCR de marcadores osteogênicos (OC, OCN e ALP) de DPPSC no dia 7 de diferenciação celular em discos de titânio tratados. GAPDH foi usado como um gene de limpeza. Expressão não relacionada a nenhum disco de tratamento.

[094] FIG. 10. Procedimento cirúrgico para o estudo in vivo em cães. A. Preenchimento dos 3 defeitos ósseos com biomaterial (Straumann® XenoGraft) e composição bioativa óssea. B: Área cirúrgica com membrana. C. Área cirúrgica com sutura de 3/0. Esta figura está relacionada ao exemplo 6.

[095] FIG. 11. Evolução do estudo in vivo em cães com Straumann® XenoGraft com a composição bioativa óssea, 60 dias após a cirurgia. A: Amostragem após 60 dias usando uma trefina de 5 mm (a imagem inferior esquerda corresponde a 2 meses com apenas Straumann® XenoGraft). B: Análise RX. C: Análise histológica. Esta figura está relacionada ao exemplo 6.

[096] FIG. 12. Exame radiológico da amostra. Comparação entre o controle (sem biomaterial), Straumann® XenoGraft sozinho e o Straumann® XenoGraft com a composição óssea bioativa (BBL), após 2 meses de cirurgia. Esta figura está relacionada ao Exemplo 5.

[097] FIG. 13. Estudo histológico. A. Grupo de teste: Dentum com composição bioativa óssea (BBL). B. Grupo de controle: Dentum sozinho. Esta figura está relacionada ao exemplo 6.

[098] FIG. 14. SEM de diferenciação 3D de DPPSCs em P4 usando um sequestrante de raiz dental humana por 21 dias em tecidos periodontais. Superfície tratada do grupo DPPSC (A1, A2, A3) com BBL. Após 3 semanas de diferenciação, fibras colágenas (setas brancas), alguns vasos sanguíneos (setas pretas), tecido fibroso e algumas células do tipo cemento-blastos (seta amarela) foram produzidos na amostra. Grupo de controle (B1, B2, B3) tecido periodontal humano em diferentes aumentos (5000X, 15000X e 30000X). Grupo de controle (C1, C2, C3) onde não é mostrada a presença de células ou tecidos. Esta figura está relacionada ao exemplo 7.

[099] FIG. 15. Seções de análise histológica do grupo DPPSC (A2-3; B2-3; C2-3) comparando com o grupo de controle (A1, B1, C1) com 3 corantes diferentes: coloração tricrômica de Masson (A1, A2, A3); azul alciano (B1, B2, B3) e hematoxilina e eosina (H & E) (C1, C2, C3). O grupo DPPSC (A2-3; B2-3; C2-3) mostrou a formação de fibras de colágeno (setas pretas) inseridas perpendicularmente aos tecidos semelhantes a cemento, que se assemelham às fibras de Sharpey em contraste com os controles (A1, B1 , C1). Esta figura está relacionada ao exemplo 7. EXEMPLOS Exemplo 1. Influência da composição bioativa óssea na expressão de marcadores ósseos em culturas celulares in vitro. Isolamento celular:

1. Cultura em meio DPPSC

[0100] As células foram cultivadas em frasco de 75 cm2 com meio DPPSC contendo como meio base 60% de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) - glicose inferior (Sigma, Estados Unidos) e 40% de MCDB-201 (Sigma, Estados Unidos) suplementado com 1x de transferrina - insulina - selênio (doravante, ITS; Sigma, Estados Unidos), 1x ácido linoléico - albumina sérica bovina (doravante, LA- BSA; Sigma, Estados Unidos), dexametasona 10-9 M (Sigma, Estados Unidos), 10-4 M de 2-fosfato de ácido ascórbico (Sigma, Estados Unidos), 100 unidades de penicilina, 1000 unidades de estreptomicina (PAA, Life Technologies, EUA), 2% de soro bovino fetal (doravante, FBS; Sigma, Estados Unidos), 10 ng/ml de Fator de Crescimento BB derivado de plaquetas humanas (daqui em diante, hPDGF-BB; R&D Systems, Estados Unidos) e 10 ng/ml de Fator de Crescimento Epidérmico (doravante, EGF; R&D Systems, Estados Unidos). Os frascos foram previamente cobertos com 10 ml de 100 ng/ml de fibronectina (Life Technologies, EUA) e incubados a 37 °C, concentração de CO2 a 5% durante 1 hora.

[0101] Durante as duas semanas de cultura primária, o meio foi trocado a cada 3 dias e a confluência das células foi mantida em 30%, uma vez que maiores taxas de confluência levam à maturação celular e mudanças na morfologia e genótipo.

2. Cultura em meio de DPMSC (doravante, células cultivadas sob estas condições são referidas como DPMSCs)

[0102] As células foram cultivadas em frasco de 75 cm2 com meio DPMSC contendo meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Biochrom, Reino Unido) suplementado com 2 ng/ml de Fator de Crescimento de Fibroblastos básico (doravante, bFGF) e 10% de FBS (Hyclone, EUA). Os frascos foram previamente cobertos com 10 ml de 100 ng/ml de fibronectina (Life Technologies, EUA) e incubados a 37 °C, concentração de CO2 a 5% durante 1 hora.

[0103] As células foram semeadas a 300.000 células/cm2 de densidade e o meio foi trocado a cada três dias. A confluência foi estabelecida em 50-80%, a fim de manter a morfologia celular e multipotência.

3. Cultura em meio Saos (doravante, células cultivadas sob estas condições são referidas como células Saos)

[0104] 12 Células de subcultura P foram semeadas a 500.000 células/cm2 de densidade e o meio foi trocado a cada três dias. A confluência foi estabelecida a 80% sem descongelamento e semeadas em frascos de 75 cm2 com meio de cultura Saos contendo DMEM (Invitrogen, Estados Unidos), suplementado com 10% de SFB ([Hyclone, EUA]), 2mm L-Glutamina (Sigma USA), 100 Penicilina u/ml (Life Technologies, EUA), 1000 u/ml de estreptomicina (Life Technologies, EUA). Os frascos foram previamente cobertos com 10 ml de 100 ng/ml de fibronectina (Life Technologies, EUA) e incubados a 37 °C, concentração de CO2 a 5 % durante 1 hora.

[0105] O meio foi trocado a cada três dias. As subculturas foram feitas quando as células estavam em 80% de confluência.

Preparação dos implantes:

[0106] Para analisar a influcia da composição bioativa do osso da presente invenção na interação entre as culturas de células e implantes de metal acima mencionados (mais precisamente implantes de titânio dentário), os discos dos implantes foram preparados e tratados como se segue:

[0107] Os discos de titânio foram obtidos cortando-se a liga de titânio comercialmente disponível Ti6Al4V (Ti-6Al-4V), também outros discos obtidos de outras ligas de titânio, em particular Ti-6Al-4V Eli e Ti-5Al-2.5Sn. Não houve diferenças no comportamento entre os discos. Os discos mediam 2,0 mm de espessura e tinham um diâmetro de 14,0 mm. A superfície dos referidos discos foi então jateada com alumina e jateada com ácido (doravante, AB/AE) que proporcionou rugosidade e aumentou a área da superfície do implante (disco). A forma das sondas (seja discos, placas ou qualquer outra forma) não tem influência nos resultados.

Preparação da composição bioativa óssea:

[0108] 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4, 0,80 g de MgCl2, 1,20 g de CaCl2 e 20 g de EDTA foram dissolvidos em 800 ml de água. Depois que todos os componentes foram dissolvidos corretamente, o volume da solução foi levado a 1 litro. Antes de contatar os discos acima mencionados com as culturas de células, os discos foram tratados com 100 microlitros da composição bioativa óssea, incubados à temperatura ambiente (37 °C durante 1 dia). Este tratamento de superfície foi dividido em três grupos: avaliação do tratamento de superfície em 1 dia, 1 mês de cultura celular e sem tratamento de superfície.

Diferenciação de osteoblastos:

[0109] Para analisar a diferenciação dos osteoblastos, as três populações celulares mencionadas acima foram cultivadas, independentemente, nos discos de titânio. As células foram semeadas em discos de titânio de discos Ti6Al4V (tratados como mencionado acima, isto é discos tratados com AB/AE e incubados ou não com a composição bioativa óssea da presente invenção) em placas de 24 poços a uma densidade de 1x103 células por cm2. Para os diferentes tipos celulares utilizados, as condições de cultura para diferenciação dos osteoblastos foram: - DPPSCs e DPMSCs: Passagem de cinco DPPSCs e DPMSCs do mesmo clone foram utilizadas para diferenciação óssea com meio osteogênico, que continha; como meio base α-MEM (Gibco) e RPMI, suplementado com 10% de FBS, 10 mM de fosfato de β-glicerol (Sigma, Estados Unidos), 50 mM de ácido L-ascórbico (Sigma, Estados Unidos)), 0,01 mM de dexametasona e solução de penicilina / estreptomicina a 1 %. A suspensão foi despejada em frascos de 75 cm2 incluindo os discos de titânio com os diferentes tratamentos mencionados acima. O meio foi trocado a cada 3 dias. - As células Saos foram cultivadas sob as mesmas condições, exceto para o meio, que foi o mesmo mencionado acima para essas células.

[0110] Considerando as condições de cultura cellular acima, os seguintes grupos foram gerados e analisados para ver se havia diferenças na expressão de vários marcadores de osteodiferenciação, principalmente OC, COL I, RUNX-2, ALP e ITGα4. Como gene de limpeza, a expressão de GAPFH também foi analisada: - DPPSCs cultivadas com disco de implante não tratado (isto é, sem a composição bioativa óssea) e sob condições não diferenciadas. - DPMSCs cultivadas com disco de implante não tratado (isto é, sem a composição bioativa óssea) e sob condições não diferenciadas. - Células Saos com disco de implante não tratado (isto é sem a composição bioativa óssea). - DPPSCs cultivadas com disco de implante não tratado (isto é, sem a composição bioativa óssea) e sob condições de diferenciação de osteoblastos. - DPMSCs cultivadas com disco de implante não tratado (isto é, sem a composição bioativa óssea) e sob condições de diferenciação de osteoblastos. - DPPSCs cultivadas com disco de implante tratado (isto é, com a composição bioativa óssea) e sob condições não diferenciadas durante 24 horas. - DPMSCs cultivadas com disco de implante tratado (isto é, com a composição bioativa óssea) e sob condições não diferenciadas durante 24 horas. - Células Saos com disco de implante tratado (isto é, com a composição bioativa óssea) durante 24 horas. - DPPSCs cultivadas com disco de implante tratado (isto é, com a composição bioativa óssea) e sob condições de diferenciação de osteoblastos durante 24 horas. - DPMSCs cultivadas com disco de implante tratado (isto é, com a composição bioativa óssea) e sob condições de diferenciação de osteoblastos durante 24 horas. - DPPSCs cultivadas com disco de implante tratado (isto é, com a composição bioativa óssea) e sob condições não diferenciais durante 30 dias. - DPMSCs cultivadas com disco de implante tratado (isto é, com a composição bioativa óssea) e sob condições não diferenciais durante 30 dias. - Células Saos com disco de implante tratado (isto é, com a composição bioativa óssea) durante 30 dias. - DPPSCs cultivadas com disco de implante tratado (isto é, com a composição bioativa óssea) e sob condições de diferenciação de osteoblastos durante 30 dias. - DPMSCs cultivadas com disco de implante tratado (isto é, com a composição bioativa óssea) e sob condições de diferenciação de osteoblastos durante 30 dias. - osso humano. - Os mesmos grupos foram também analisados sem disco de implante, isto é, cultivando as células com discos de placa de titânio recobertos por fosfato de cálcio (o que causa calcificação).

[0111] Para ver a expressão de RNA dos marcadores mencionados acima, o RNA total foi extraído com 1 e 30 dias de diferenciação (e para os controles quando foi extraído com RNA) usando Trizol (Invitrogen, Estados Unidos). A amostra foi tratada com DNAse (Promega, Estados Unidos) e o RNA foi isolado seguindo as instruções do fabricante do Kit de Isolamento de RNA UltraCleanTM & Cells (MoBio, Estados Unidos). Dois (2) μg de alíquotas de RNA foram tratados com DNAase I (Invitrogen, Estados Unidos) e transcritos inversamente utilizando o kit de síntese de cDNA de Primeiro Filamento de Transcrição (Roche, Sui). RT-PCR foi realizada utilizando os iniciadores na Tabela 1 seguinte para a amplificação de OC, COL I, RUNX-2, ALP, ITGα4 e GAPDH. Tabela 1. Iniciadores utilizados para a amplificação de OC, COL I, RUNX-2,

[0112] As referidas amplificações de RT-PCR foram executadas e o gel de agarose a 2%. Os resultados foram visualizados sob luz UV e são mostrados na FIG. 1

[0113] Além disso, a FIG. 2 mostra os resultados da expressão relativa para os genes COL I, BMP2 e OCN no dia 0 e 30.

[0114] Os iniciadores utilizados para COL I foram os mesmos identificados na Tabela 1.

[0115] A expressão diferente dos genes mostrados nas Figuras 1 e 2 está correlacionada com o favorecimento da formação óssea. Além disso, quando o implante é tratado com a composição bioativa óssea da presente invenção, a produção de osso é aumentada e a qualidade do osso produzido é maior.

Exemplo 2. Influência da composição bioativa óssea na excreção de cálcio e atividade da fosfatase Alcalina (daqui em diante, ALP) durante a formação óssea em culturas celulares in vitro.

[0116] A concentração de cálcio no meio de cultura de células (i.e., cálcio secretado) foi medida em DPPSCs e DPMSCs cultivadas com discos de implante tratados ou não com composição bioativa óssea sob condições de diferenciação, de acordo com o que foi previamente explicado. O referido cálcio secretado está relacionado com a formação óssea.

[0117] A concentração de cálcio foi medida analisando o sobrenadante de cada população de células nos dias 3, 11 e 20 de diferenciação. A análise foi realizada utilizando um kit de ensaio colorimétrico de cálcio (BioVision, Estados Unidos) através de um complexo cromogênico (À = 575 nm) formado entre íons de cálcio e 0- cresolftaleína. Esta análise fornece um comprimento de onda detectado em 575 nm e este valor determina a concentração de cálcio.

[0118] Os resultados obtidos para a concentração de cálcio estão resumidos na FIG. 3. Pode-se observar que, no caso de culturas celulares com discos de implantes tratados com a composição bioativa óssea, o pico de excreção de cálcio pode ser visto mais cedo (vide aumento no dia 3), mostrando uma formação anterior do osso.

[0119] Em relação à ALP, um aumento na atividade da referida proteína também está relacionado com a formação óssea. Assim, a atividade de ALP foi medida no sobrenadante das culturas de células acima mencionadas também nos dias 3, 11 e 20. A referida atividade foi medida utilizando um Kit de fosfatase alcalina (BioSystems, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A absorvência de cada amostra foi medida a um comprimento de onda de 405 nm em momentos diferentes (dia 3, 11 e 20 durante a diferenciação celular), em que um aumento na atividade de ALP é observado no grupo tratado vs não tratado.

[0120] Os resultados obtidos para a atividade de ALP aparecem resumidos na FIG. 4. Uma tendência semelhante à que se vê na FIG. 3 pode ser vista na FIG. 4, isto é, o pico precoce no dia 3 da atividade de ALP mostrando a formação óssea inicial.

[0121] Portanto, os resultados obtidos para a concentração de cálcio e a atividade de ALP se correlacionam perfeitamente e são consistentes com uma formação óssea precoce induzida pela composição bioativa óssea da presente invenção.

Exemplo 3. Influência da composição bioativa óssea no enxerto de implante ósseo em coelhos.

[0122] Para este estudo foram utilizados 60 implantes dentários divididos em três grupos (n = 20 por grupo). O tratamento para cada um dos três grupos de estudo aparece descrito na Tabela 2. Tabela 2. Detalhes do tratamento adicional aplicado aos implantes nos diferentes grupos do estudo.

[0123] Os implantes foram tratados com jateamento com partículas de 50-100 μm de TÍO2, seguido de limpeza ultrassónica com solução alcalina de Riozyme IV-E Neutro Gold, lavagem com água destilada e decapagem com ácido maleico (HO2CCH2CHOHCO2H). Para os implantes utilizados no grupo A, o único tratamento foi aplicado. Para os grupos experimentais B e C: os implantes foram tratados inicialmente usando o procedimento acima e depois com a composição bioativa óssea correspondente usando 100 μL por 1 h.

[0124] Quinze coelhos adultos da Nova Zelândia (Oryctolagus cuniculus) com aproximadamente 4,5 ± 0,5 kg foram utilizados neste estudo. Quatro implantes foram instalados por animal (2 por tíbia). Os animais foram sacrificados 15, 30, 45 e 60 dias após a cirurgia.

[0125] Para a análise histomorfométrica, blocos ósseos das tíbias, com implantes inseridos, foram removidos de cada animal, fixados em solução de formaldeído a 10% por 7 dias, e desidratados em soluções crescentes de etanol (60%, 70%, 80% e 99 %) por 24-56 h, como descrito anteriormente (Yang J et al. "Effects of oestrogen deficiency on rat mandibular and tibial microarchitecture" Dentomaxillofac Radiol 2003 Jul,32(4):247-51). Posteriormente, as amostras foram embebidas em resina VLC Technovit 7200 (Kultzer & Co., Wehrhein, Alemanha) e, após a cura, as amostras foram seccionadas usando um cortador metalográfico (Isomet 1000; Buehler, Alemanha). As amostras de disco foram polidas usando uma sequência de papel abrasivo (Metaserv 3000; Buehler, Alemanha) para uma espessura de ~ 30 μm e analisadas usando microscopia de luz (Nikon E200, Japão). O crescimento ósseo foi medido em relação à plataforma do implante no contato ósseo com o encosto de cicatrização, de acordo com o esquema usando o software Image Tool, versão 5.02 para o Microsoft Windows ™. Dois pesquisadores diferentes fizeram as medições em momentos diferentes e uma média única desses valores foi calculada. Quando os valores medidos eram muito diferentes, ambos os pesquisadores repetiram as medidas.

[0126] Os resultados obtidos são mostrados na FIG. 5, 6 e 7 correspondendo aos grupos A, B e C respectivamente.

[0127] Além disso, a análise histológica das amostras para medir o contato osso-implante (doravante, BIC) foi realizada. Os resultados estão resumidos na Tabela 3. Tabela 3. Resultados do BIC para os três grupos do estudo aos 15, 30, 45 e 60 dias.

[0128] Como pode ser visto nas FIGs. 5 a 7, os implantes estavam em contato com o osso predominantemente cortical ao longo dos fios superiores na região cortical, enquanto os fios na medula óssea estavam em contato com osso recém formado ou com medula óssea normal. Uma linha de demarcação foi consistentemente vista entre o osso recém formado e o tecido ósseo antigo. Em termos gerais, a partir das referidas figuras, pode-se ver que uma formação anterior de osso é induzida nos Grupos B e C (ainda mais cedo e maior no último). Isso difere foi mantida durante todo o período experimental (isto é, até ao dia 60).

[0129] Além disso, da tabela 3 é também derivado um BIC anterior e aumentado nos grupos B e C comparado ao grupo A. Além disso, e surpreendentemente, como também visto nas Figuras 5 a 7, o grupo C também mostrou um aumento em todos os pontos de tempo quando comparado com o grupo B.

[0130] Finalmente, a quantidade de osso novo formado foi medida também aos 15, 30, 45 e 60 dias.

[0131] Os resultados estão resumidos na FIG. 8 e são consistentes com o que foi discutido acima. Pode-se observar uma formação anterior de osso nos grupos B e C (o grupo C mostra uma formação óssea ainda maior no dia 15 quando comparado com o grupo B). Além disso, o grupo C é o único grupo que surpreendentemente mostrou um aumento no novo osso formado no dia 60 (no referido dia, a quantidade de osso formado nos grupos A e B evoluiu para ser semelhante).

Exemplo 4. Comparação entre tratamentos

[0132] 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4, 0,80 g de MgCl2, 1,20 g de CaCl2 e 20 g de EDTA foram dissolvidos em 800 ml de água.

[0133] Para analisar a capacidade osteogênica relativa de PBS, CaCl2, MgCl2 e EDTA, DPPSC (1x103 células por cm2) foram semeados em discos de titânio Ti6Al4V.

[0134] Grupo 1: tratado com PBS (8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4, dissolvidos em 800 ml de água).

[0135] Grupo 2: tratado com PBS + CaCl2 + MgCl2 (8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4, 0,80 g de MgCl2, 1,20 g de CaCl2 dissolvidos em 800 ml de água).

[0136] Grupo 3: tratado com PBS + CaCl2 + MgCl2 + EDTA (8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4, 0,80 g de MgCl2, 1,20 g de CaCl2 e 20 g de EDTA foram dissolvidos em 800 ml de água):

[0137] Grupo 4: tratado com PBS + EDTA (8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4 e 20 g de EDTA foram dissolvidos em 800 mL de água).

[0138] Controle: sem discos tratados.

[0139] Os discos foram tratados e incubados durante uma hora antes da sementeira de células em placas de 24 poços a uma densidade de 1x103 células por cm2. RT-PCR foi realizada no dia 7 de diferenciação de osteoblastos usando OC, OCN e ALP. As diferenças na expressão mostradas na FIG. 9 mostram que os discos de titânio tratados com PBS com adição de CaCl2 e MgCl2 apresentam maior capacidade osteogênica em comparação ao tratamento com apenas PBS ou PBS + EDTA e que a combinação de PBS, CaCl2, MgCl2 e EDTA mostra uma capacidade osteogênica ainda mais surpreendente comparada aos outros tratamentos.

[0140] Valores da FIG. 9 são expressos como expressão relacionada a discos não tratados no dia 7.

[0141] Dois PBS comerciais foram também testados e os resultados foram semelhantes aos do PBS utilizado no Grupo 1 acima referido. Os referidos PBS comerciais foram: Sigma Aldrich P3813 SIGMA - solução salina tamponada com fosfato (Conteúdo de uma bolsa, quando dissolvido em um litro de água destilada ou deionizada, produzirá solução salina tamponada com fosfato a 0,01 M (NaCl 0,138 M; KCl - 0,0027 M); pH 7,4, a 25 °C ). Thermo Fisher CatNum 18912 - Pastilhas PBS. (Fosfato (como fosfatos de sódio) 10,0 mM, cloreto de potássio (KCl), 2,68 mM, cloreto de sódio (NaCl) 140,0 mM, a ser dissolvido com 500 ml de água destilada).

Exemplo 5. Aplicação da composição

[0142] Aplicação da composição em um paciente ao usar um implante: Para a colocação de implantes usando a composição bioativa óssea, a sequência de perfuração do osso deve seguir as recomendações do fabricante, subsequentemente colocando o implante e com uma inserção muito baixa entre 20 a 50 Newtons. Isto é aplicável para implantes dentários, bem como para implantes de traumatologia.

[0143] Aplicação da composição em um paciente com periodontite ou peri- implantite: Para o tratamento periodontal usando a composição bioativa óssea, primeiramente o tratamento periodontal convencional deve ser feito; remoção de placa bacteriana e tecido de granulação por raspagem supragengival e subgengival. Na mesma intervenção, a área do defeito ósseo tem que estar bem seca antes de aplicar a composição bioativa óssea usando uma escova convencional; depois disso, o sangramento é causado até que o coágulo seja formado. Este processo deve ser feito mais de uma vez até recuperar todos os ossos perdidos.

Exemplo 6. Estudo in vivo da influência da composição óssea bioativa no uso de biomateriais em cães Materiais e métodos. Animais

[0144] Para este estudo foi utilizada cadela de 3 anos de idade com um peso de 12 kg. Um especialista em cirurgia veterinária observou o animal. O Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade de Murcia aprovou o protocolo de estudo que seguiu as diretrizes estabelecidas pela Diretiva do Conselho da União Européia de 1 de fevereiro de 2013/53 / CEE.

Projeto de estudo

[0145] O estudo foi concebido como um ensaio in vivo. A extração dentária de todos os molares superiores e inferiores posteriores foi realizada três meses antes do estudo com composição bioativa óssea e biomateriais. Depois disso, 12 defeitos ósseos foram feitos usando uma trefina de 5 mm, 3 em cada zona: - 3 defeitos para testar apenas o Straumann® XenoGraft, - 3 para composição bioativa óssea com Straumann® XenoGraft, - 3 defeito para Dentum e - 3 para Dentum com composição bioativa óssea.

[0146] O Straumann® XenoGraft é um osso bovino e uma lenta taxa de reabsorção semelhante ao osso humano, com baixa cristalinidade, elevada porosidade e um óptimo equilíbrio de cálcio e fosfato, concebido para alcançar um volume ósseo fiável na regeneração óssea guiada.

[0147] Dentum é usado nesta descrição para nomear um biomaterial formado pela dentina autóloga. A dentina autóloga é utilizada nos procedimentos clínicos como um autoenxerto, por sua composição quase idêntica a do osso humano em íons de cálcio e fósforo organizados como hidroxiapatita e TCP. O dentum foi obtido com o Smart Dentin Grinder (distribuído pela Bioner, Espanha, de KometaBio, EUA). Os dentes extraídos da cadela, depois de limpos e secos, foram imediatamente moídos utilizando o Smart Dentin Grinder. As partículas dentárias que foram obtidas foram 300-1200 μm, que foram posteriormente peneiradas através de um sistema especial de classificação de dois compartimentos. As partículas de dentes foram imersas em um limpador básico de álcool em um vaso estéril para dissolver todos os resíduos orgânicos e bactérias durante 15 minutos. As partículas foram então lavadas com solução salina estéril durante 5 minutos e secas.

[0148] O controle de RX e de hilling de zonas cirúrgicas foi feito após 15 dias e 2 meses de cirurgia (FIG. 10).

Procedimento cirúrgico

[0149] O cão recebeu uma medicação pré-anestésica que consiste em 0,01 mg/kg de atropina (Atropuinsulfat, Braun, B. Braun Melsungen, Melsungen, Alemanha), 20 mg/kg de cloridrato de ketamina (Ketamin 10%, Essex, Munique, Alemanha) e 0,1 mg/kg de xilazina (Rompun, Bayer Vital, Leverkusen, Alemanha) por via intramuscular, seguido por um propofol intravenoso de 2 a 4 mg/kg (Propofol 1% MCT Fresenius, Fresenius Kabi, Bad Homburg, Alemanha) para induzir a anestesia. A manutenção da anestesia após a intubação traqueal foi realizada pela aplicação de isoflurano com uma concentração expirada de 1,8% em oxigênio / ar e um bolus de 0,002 mg/kg / hora de citrato de fentanila (Fentanyl-Janssen, Janssen-Cilag, Neuss, Alemanha) seguida de infusão contínua de 0,001 mg/kg/hora de citrato de fentanila. Para reduzir a dor pós-operatória, a analgesia foi induzida pela aplicação de carprofeno subcutâneo (Rimadyl, Pfizer, Karlsruhe, Alemanha) 4 mg/kg a cada 24 horas por 4 dias, começando com a primeira dose após a indução anestésica. Para sacrificar os animais, foi aplicada uma injeção intravenosa de 50 mg/kg de tiopental (Trapanal, Nycomed, Konstanz, Alemanha) e 2 mmol/kg de cloreto de potássio a 7,45% (B. Braun, Melsungen, Alemanha).

Avaliação histológica

[0150] Após o sacrifício, as amostras foram obtidas e fixadas em solução de formaldeído a 4% (Merck, Darmstadt, Alemanha) por 5 a 7 dias. Em seguida, as amostras foram desidratadas em uma série de etanol de 70%, 80%, 90% e 100%, permanecendo 24 horas em cada concentração de etanol e desengorduradas em Xileno por 24 horas (Merck, Darmstadt, Alemanha). Para fatiar as amostras, elas foram infiltradas, embebidas e polimerizadas em Technovit 9100 (Heraeus Kulzer, Wehrheim, Alemanha) seguindo o manual de instruções. As fatias obtidas foram cortadas a 500 μm por uma serra de diamante rotativo de baixa velocidade (Microslice, Metals Research, Cambridge, UK). As seções foram colocadas em lâminas acrílicas opacas (Maertin, Freiburg, Alemanha) e a espessura foi reduzida para os 60 μm finais por uma placa de moagem rotativa (Stuers, Ballerup, Dinamarca). Para análise histológica e histométrica, microscopia de luz incandescente e polarizada e análise de imagem baseada em PC foram utilizadas para a avaliação da densidade óssea.

Resultados:

[0151] Homogeneidade foi detectada do tecido ósseo e do biomaterial com a composição bioativa óssea em relação à área de controle sem composição bioativa óssea. O osso cortical que consiste em osteons primários e secundários formou-se completamente. Além disso, os grupos tratados apresentavam osteoblastos e osteócitos mais maduros quando comparados com os controles (FIG. 11).

[0152] No tecido ósseo neoformado, os osteócitos dentro das lacunas puderam ser detectados. Um novo osso foi formado integrando o biomaterial e o osso original na zona do defeito com uma conexão firme. (Figuras 11, 12 e 13). FIG. 13 mostra que em (A) o defeito ósseo se regenerou em 80% no grupo teste (Dentum + composição bioativa óssea (BBL)) devido ao crescimento do tecido ósseo em detrimento do crescimento do tecido conjuntivo - fibroblastos. Em (B) com apenas Dentum, a regeneração do defeito está em 40% e uma extensa presença de tecido conjuntivo - não desejável - pode ser observada.

Exemplo 7. Estudo in vivo da influência da composição óssea bioativa na periodontite. Processamento de amostras de dente

[0153] Dentes humanos (n = 13) foram limpos e as coroas foram eliminadas. Seções transversais foram obtidas após o corte das raízes. Os blocos de dentes foram limpos utilizando um protocolo anteriormente descrito (Galler KM, et al. "Bioengineering of dental stem cells in a PEGylated fibrin gel" Regen Med. 2011, 6(2):191-200) As raízes foram então lavadas 3 vezes em PBS estéril, e então novamente imersas em EDTA a 0,5 M por 10 min, seguidas por mais 3 lavagens em BBL. Posteriormente as raízes foram mantidas incubadas com DPPSC para diferenciação periodontal por 21 dias.

Diferenciação do tecido periodontal na superfície do dente

[0154] As seções transversais dos dentes foram colocadas em placas de cultura de 6 poços, a DPPSC foram semeadas a 20000 células por poço em 4 ml de meio osteogênico e incubadas a 37 °C durante 3 semanas. O meio osteogênico consiste em α-MEM (Gibco) contendo 10% de FBS inativado pelo calor (Biochrom), 10 mM de fosfato de β-glicerol (Sigma-Aldrich), 50 μM de ácido L ascórbico (Sigma- Aldrich), 0,01 μM de dexametasona e 1X solução de penicilina / estreptomicina. Meio foi trocado a cada 3 dias durante um período de 21 dias. Análise por microscopia eletrônica de varredura

[0155] Após 3 semanas de cocultura das células, as folhas dos dentes foram processadas para SEM. As amostras foram fixadas com glutaraldeído a 2,5% (Ted Pella Inc.) em EMS de tampão de codilato Na-ca a 0,1 M, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) (pH 7,2) durante 1 hora em gelo. Após a fixação, as amostras foram tratadas com 1% de tetróxido de ósmio (OsO4) por 1 hora. As amostras foram então desidratadas em soluções em série de acetona (30-100%) com os sequestrantes montados em tocos de alumínio. As amostras foram examinadas com um microscópio eletrônico de varredura Zeiss 940 DSM.

Análise histológica

[0156] Os dentes que foram cultivados por 21 dias, foram fixados com formol a 10% por 24 horas, e então levados para o departamento de Anatomia Patológica do Instituto Universitário Dexeus (Barcelona, Espanha). As amostras colhidas foram embebidas em parafina e cortadas em seções de 4 μm de espessura. As seções foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E), azul de Alcian e tricromo de Masson para determinar a formação de novas fibras de colágeno, vasos sanguíneos e células semelhantes a cementoblastos. Foi utilizado um sistema de análise de imagem (Image-Pro PlusTM, Media Cybernetic, SilverSprings, MD).

Resultados Cultura celular de DPPSC / diferenciação de tecido periodontal

[0157] Depois de as células terem sido cultivadas in vitro durante 21 dias, os sequestrantes semeados com células foram submetidos a um exame de microscopia eletrônica de varredura (SEM). SEM em diferentes aumentos (5000X, 15000X e 30000X) em raízes com cimento mostrou uma massa celular de alta densidade na superfície da raiz para todas as amostras de DPPSC (FIG. 14 A1, A2, A3), indicando que as células aderiram e cresceram favoravelmente. Após 3 semanas de diferenciação, a microscopia eletrônica de varredura permitiu imagens de alta resolução da integração do tecido fibroso de fibrilas de colágeno com as matrizes de raiz. Alguns vasos sangüíneos e algumas células semelhantes a cementoblastos foram produzidos nas amostras do grupo DPPSC tratado com BBL que comparado com controle positivo (tecido periodontal humano) (FIG. 14 B1, B2, B3), e com controle negativo (superfície dos dentes sem ligamento periodontal) (Fig. 14 C1, C2, C3), onde não havia presença de células nem tecidos.

Avaliação histológica das raízes dentárias

[0158] A análise histológica usando coloração nuclear de seções não descalcificadas apoiou ainda mais as descobertas de SEM. De modo a visualizar a formação precoce de aglomerados de células, coloração tricrômica de Masson (FIG. 15 A1, A2, A3); azul de Alcian (FIG. 15, B1, B2, B3) e hematoxilina e eosina (H&E) (FIG. 15 C1, C2, C3). A seção histológica do grupo DPPSC (FIG. 15 A2-3; B2-3; C2- 3) mostrou a formação de fibras de colágeno inseridas perpendicularmente aos tecidos do tipo cemento, que se assemelhavam às fibras de Sharpey em contraste com o grupo de controle (Figura 15 A1, B1, C1). Maior ampliação (FIG. 15 A3, B3, C3) revelou a homogeneidade das fibras de colágeno reparativas recentemente formadas que se ligaram bem às superfícies aos 21 dias.

[0159] Os resultados experimentais mostram, devido ao uso da composição bioativa óssea, uma melhor calcificação das células tipo cementoblastos em conjunto com uma recuperação das fibrilas de colágeno do ligamento periodontal, que é o principal defeito na periodontite. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Literatura de Patentes US20070213832 (Wen Hai B) Literatura não patenteada Albrektsson T, et al. “Osseointegrated titanium implants Requirements for ensuring a long-lasting, direct bone-to-implant anchorage in man” Acta Orthop Scand 1981,52:155-170 Anselme K “Osteoblast adhesion on biomaterials” Biomaterials 2000,21:667 Galler KM, et al. "Bioengineering of dental stem cells in a PEGylated fibrin gel" Regen Med. 2011, 6(2):191-200 García AJ “Get a grip: integrins in cell-biomaterial interactions” Biomaterials 2005,26:7525 Howlett CR, et al. “Mechanism of initial attachment of cells derived from human bone to commonly used prosthetic materials during cell culture” Biomaterials1994,15:213 Kilpadi KL, et al. “Hydroxylapatite binds more serum proteins, purified integrins, and osteoblast precursor cells than titanium or steel” J Biomed Mater Res 2001,57:258 Lindahl C. "Biomimetic deposition of hydroxyapatite on titanium implant materials" Uppsala Univ. 1 Janeiro de 2012, páginas 978-91 Lindberg F. et al., "Hydrohylapatite growth onf single crystal rutile substrates" Biomaterials, Elsevier Science Publishers BV, Barking GB, vol. 29, no 23, 1 Agosto de 2008 páginas 3317-23 Mohan S, et al. “Bone growth factors” Clin Orthop Relat Res 1991,263:30-48 Scotchford CA, et al. “Chemically patterned, metal-oxide-based surfaces produced by photolithographic techniques for studying protein- and cell-interactions. II: Protein adsorption and early cell interactions” Biomaterials 2003,24:1147 Sheikh Z, et al. "Natural graft tissues and synthetic biomaterials for periodontal and alveolar bone reconstructive applications: a review" Biomater Res. 2017; 21: 9. Steele JG, et al. “Attachment of human bone cells to tissue culture polystyrene and to unmodified polystyrene: the effect of surface chemistry upon initial cell attachment” J Biomater Sci Polym Ed 1993,5:245 Urist MR, et al. “Bone cell differentiation and growth factors” Science 1983,220:680-686 Wozney JM, et al. “Growth factors influencing bone development” J Cell Sci Suppl 1990,13:149-156 Yang J et al. "Effects of oestrogen deficiency on rat mandibular and tibial microarchitecture" Dentomaxillofac Radiol, Julho de 2003,32(4):247-51

Claims (11)

1. Uso de uma composição bioativa óssea CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um produto farmacêutico, um medicamento, um suplemento alimentar ou um produto de higiene bucal para promover a osteogênese, em que a composição bioativa óssea compreende uma solução salina à base de água compreendendo hidrogenofosfato dissódico em uma concentração de 8 a 12 mM na solução, cloreto de sódio em uma concentração de 130 a 140 mM na solução, hidrogenofosfato de potássio em uma concentração de 1,4 a 2,2 mM na solução, e cloreto de potássio em uma concentração de 2,3 a 3,1 mM na solução; em que o pH da composição está entre 7,0 e 7,8.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a solução compreende ainda um sal de cálcio e um sal de um metal divalente diferente de cálcio.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o sal de cálcio está em uma concentração de 7 a 15 mM na solução e o sal de um metal divalente diferente de cálcio está em uma concentração de 2 a 12 mM na solução.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o sal de cálcio é cloreto de cálcio e o sal de um metal divalente diferente de cálcio é cloreto de magnésio.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a solução compreende ainda um agente quelante, como EDTA.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a concentração de EDTA na composição é de 25 mM a 100 mM.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um produto farmacêutico, um medicamento, um suplemento alimentar ou um produto de higiene bucal para promover a osteogênese quando um implante, particularmente um implante de titânio dentário, é usado.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um produto farmacêutico, um medicamento, um suplemento alimentar ou um produto de higiene bucal para promover a osteogênese no tratamento de uma doença periodontal.

9. Composição bioativa óssea CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma solução salina à base de água compreendendo hidrogenofosfato dissódico em uma concentração de 8 a 12 mM na solução, cloreto de sódio em uma concentração de 130 a 140 mM na solução, hidrogenofosfato de potássio em uma concentração de 1,4 a 2,2 mM na solução, cloreto de potássio em uma concentração de 2,3 a 3,1 mM na solução, um sal de cálcio em uma concentração de 7 a 15 mM na solução, um sal de um metal divalente diferente de cálcio em uma concentração de 2 a 12 mM na solução e um agente quelante, em que o pH da composição está entre 7,0 e 7,8.

10. Composição bioativa óssea, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que o sal de cálcio é cloreto de cálcio e o sal de um metal divalente diferente de cálcio é cloreto de magnésio.

11. Composição bioativa óssea, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende 10 mM de hidrogenofosfato dissódico, 137 mM de cloreto de sódio, 1,8 mM de hidrogenofosfato de potássio, 2,7 mM de cloreto de potássio, 8,4 mM de cloreto de magnésio, 10,81 mM de cloreto de cálcio e 68,4 mM de EDTA.

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