JPWO2007129453A1 - 歯周軟組織再生用組成物及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

歯周軟組織を低侵襲的に再生するための組成物及び該組成物の製造方法を提供することを一つの目的とする。未分化・幹細胞及び歯肉形成能を有する芽細胞から選択される細胞とマトリックス材料と血小板血漿とを含有するように、歯周軟組織再生用組成物を調製する。この組成物によれば、低侵襲でしかも付着歯肉のみならず遊離歯肉も効果的かつ良好な審美性で再生できる。

Description

本発明は、歯周組織のうち軟組織の再生に用いる組成物及びその製造方法に関する。

近年、歯周病などに対して種々の口腔内外科的な治療が施されるようになっている。歯周病においては、疾患そのものや外科的治療によって歯周組織の一部が退縮又は欠損することがあるが、治療後の機能性や審美性を確保する観点から、こうした歯周組織を修復・再生する要請が高まってきている。

歯周組織は、歯を支持する歯槽骨などの硬組織と歯肉などの軟組織から構成されている。図１に示すように、歯周組織のうち軟組織としては、歯槽骨に裏打ちされた付着歯肉とこうした硬組織に裏打ちされていない遊離歯肉とがある。

歯周組織の修復・再生としては、例えば、歯槽骨やその結合部位の再生に関して、骨芽細胞などの細胞を移植することによる再生方法が開示されている（特開２００４−２０１６１２、特開２００４−４９７）。また、歯肉と歯根との間に歯周組織が再生するためのスペースを設けて新たな結合組織付着、歯槽骨及び結合組織等を再生を促進するＧＴＲ（Guided Tissue Regeneration）法や幼若豚の歯胚から採取したエナメルマトリックスタンパク質を含有する歯周組織再生誘導材料（エムドゲイン（商品名）、生化学工業株式会社製）を用いる手法などが知られている。

また、歯肉組織を修復する方法として、患者の口腔内あるいは他の組織から、結合組織片や上皮組織片を採取してそれを移植したり、歯肉を縫合することにより露出してしまった根面などを被覆するという手法が用いられている。

歯周組織のうちでも歯肉などの軟組織は、審美的観点からの修復や再生の要請が大きい。なかでも、遊離歯肉である辺縁歯肉及び歯間乳頭部歯肉は歯列及び歯茎の審美性に大きく影響する（図１参照）。特に、歯間乳頭部が退縮することによって生じた空隙は、ブラックトライアングルと称され、歯列及び歯茎の外観は著しく損なってしまう。また、こうした遊離歯肉は、歯周病のほか誤ったオーラルケアによっても退縮してしまい、一定期間以上遊離歯肉の退縮が放置された場合には、遊離歯肉の自然な再生は困難となる。

しかしながら、上記特許文献１及び２は、機能的に優先度の高い歯槽骨などの硬組織の再生を目的としたものであり、また、ＧＴＲ法や上記歯周組織再生誘導材料を用いても同様であって、歯肉組織を十分に回復できるものではなかった。また、上記組織片移植法は、その組織片の採取及び移植にあたっての侵襲性が問題であるほか、十分な審美性が得られない場合もあった。

以上のことから、歯周軟組織に対して低侵襲の再生方法は今のところ検討もされておらずまた見出されてもいない。また、歯間乳頭部などの遊離歯肉についても効果的な再生方法は検討されずまた見出されていなかった。

そこで、本発明は、歯周軟組織を低侵襲的に再生するための組成物及び該組成物の製造方法を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、歯間乳頭部などの遊離歯肉を効果的に再生するための移植用組成物及び該組成物の製造方法を提供することを他の一つの目的とする。審美性の高い歯茎を再生するための組成物及び該組成物の製造方法を提供することを他の一つの目的とする。

本発明者らは、歯周軟組織の付着歯肉や再生が困難とされる辺縁歯肉及び歯間乳頭部歯肉などの遊離歯肉の再生にあたり、間葉系幹細胞及び線維芽細胞を用いた再生手法を検討したところ、これらの細胞をマトリックス材料とともに再生させようとする軟組織部位に注入することによって、歯周軟組織を効果的に再生できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、上記した課題の少なくとも一つを解決できる以下の手段が提供される。

本発明によれば、間葉系幹細胞及び歯肉線維芽細胞から選択される細胞と、マトリックス材料と、を含有する、歯周軟組織再生用組成物が提供される。本発明の組成物においては、細胞増殖因子を含むこともできる。本発明の組成物において、前記歯周軟組織は付着歯肉であってもよいし、遊離歯肉であってもよいし、遊離歯肉は歯間乳頭部歯肉であってもよい。さらに、本発明の組成物は、歯周組織局所注入用とすることができる。また、前記歯周軟組織は歯間乳頭部であってもよい。

また、本発明の組成物は、前記マトリックス材料は、以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）ヒアルロン酸及びその誘導体
（ｂ）コラーゲン及びその誘導体
（ｃ）フィブリン及びフィブリノーゲン
（ｄ）血漿及び血小板
から選択される１種又は２種以上を含むことができる。また、前記マトリックス材料は、少なくとも前記（ａ）のヒアルロン酸及びその誘導体から選択されてもよい。この態様において、前記細胞は、間葉系幹細胞であってもよい。前記マトリックス材料は、少なくとも前記（ｂ）のコラーゲン及びその誘導体から選択されてもよい。この態様において、前記細胞は、歯肉線維芽細胞であってもよい。

また、前記マトリックス材料は、少なくとも前記（ｄ）の血漿及び血小板から選択されてもよい。さらに、前記マトリックス材料は、前記（ａ）のヒアルロン酸及びその誘導体、及び前記（ｄ）の血漿及び血小板のそれぞれから選択されてもよい。この態様においては、前記細胞は間葉系幹細胞とすることができる。さらに、前記マトリックス材料は、前記（ｂ）のコラーゲン及びその誘導体、及び前記（ｄ）の血漿及び血小板のそれぞれから選択されてもよい。さらにまた、前記（ｄ）の血漿及び血小板のマトリックス材料は多血小板血漿とすることができる。

本発明によれば、間葉系幹細胞及び歯肉線維芽細胞から選択される細胞を培養する工程と、該培養した間葉系幹細胞及び／又は歯肉線維芽細胞とマトリックス材料とを混合する工程と、を備える、歯周軟組織再生用組成物の製造方法が提供される。本発明の製造方法において、前記細胞は間葉系幹細胞又は歯肉線維芽細胞とすることができる。さらに、前記歯周軟組織は付着歯肉であってもよいし、前記歯周軟組織は遊離歯肉であってもよい。また、前記歯周軟組織は、歯間乳頭部であってもよい。

また、前記混合工程は、前記マトリックス材料として以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）ヒアルロン酸及びその誘導体
（ｂ）コラーゲン及びその誘導体
（ｃ）フィブリン及びフィブリノーゲン
（ｄ）血漿及び血小板
から選択される１種又は２種以上を用いる工程であってもよい。さらに、前記混合工程は、前記マトリックス材料として、少なくとも前記（ａ）のヒアルロン酸及びその誘導体から選択される１種又は２種以上を用いる工程とすることができる。また、前記混合工程は、前記細胞としての前記歯肉線維芽細胞を用い、前記マトリックス材料として、少なくとも前記（ｂ）コラーゲン及びその誘導体から選択される１種又は２種以上を用いる工程とすることもできる。さらにまた、前記混合工程は、前記マトリックス材料として、少なくとも前記（ｄ）の血漿及び血小板として多血小板血漿を用いる工程とすることもできる。

歯肉周辺組織の模式図である。 本発明の組成物の皮下注入部位（隆起部位）の計測箇所の模式図である。 ヌードマウス背部に試験液を注入して形成された注入部位の高さの経時変化（術後０日目、６日目及び１２日目）を示すグラフ図である。 ヌードマウス背部に試験液を注入して形成された注入部位の体積の経時変化（術後０日目、６日目及び１２日目）を示すグラフ図である。 ヌードマウス背部に試験液を注入して形成された注入部位の長径の経時変化（術後０日目、６日目及び１２日目）を示すグラフ図である。 ヌードマウス背部に試験液を注入して形成された注入部位の短径の経時変化（術後０日目、６日目及び１２日目）を示すグラフ図である。 実施例４の男性患者における歯間乳頭部歯肉再生経過を示す図である。ａは、術前、ｂは術直後、ｃは術後1週間及びｄは術後３ヶ月における歯間乳頭部を示す。 実施例３におけるマウスの隆起部の組織顕微鏡写真を示す図である。ａは、ＨＥ染色による顕微鏡写真画像（４０倍）を示し、ｂはＨＥ染色による顕微鏡写真画像（４００倍）を示し、ｃは蛍光染色による顕微鏡写真画像を示す。ｃにおいて、橙色は移植したＭＳＣを示し、青色は核を示し、緑色は産生されたコラーゲンを示す。

本発明の歯周軟組織再生用組成物は、間葉系幹細胞及び歯肉線維芽細胞から選択される細胞と、マトリックス材料と、を含有することを特徴としている。本発明の歯周軟組織再生用組成物によれば、移植用組織の採取及び移植に伴う患者の負担を回避して低侵襲的な歯周軟組織の再生が可能となる。また、本発明の組成物によれば、従来困難であった遊離歯肉の再生が可能となり、審美性の良好な歯茎を容易に再生することができる。

また、本組成物は、歯間乳頭部の再生に有用である。歯間乳頭部は炎症が生じやすく歯肉の退縮等により容易に空隙が生じやすい一方、歯間部は、遊離移植や有茎弁移植を行うにはスペースが狭く、移植片への血液供給が十分ではないこと及び歯根や歯冠に囲まれて制限されているため、手術操作が困難であった。しかしながら、本発明によれば、本組成物を歯周組織に注入することにより、歯槽骨や歯肉や移植等を施すことなく容易に歯間乳頭部を再生することができる。

以下、本発明の実施形態である歯周軟組織再生用組成物及びその製造方法等について説明する。

（歯周軟組織再生用組成物）
本発明の歯周軟組織再生用組成物（以下、単に本組成物ともいう。）は、間葉系幹細胞及び歯肉線維芽細胞から選択される細胞と、マトリックス材料とを含有している。本組成物は、ヒト及び非ヒト哺乳類に適用可能であるが、好ましくはヒト用である。

（間葉系幹細胞と歯肉線維芽細胞）
本組成物は、間葉系幹細胞を含むことができる。間葉系幹細胞とは、体性幹細胞の一つであり、自己複製能と複数の間葉系幹細胞へと分化する多分化能を有する細胞である。間葉系幹細胞は、常法に従い、骨髄、骨膜、末梢血、臍帯血及び脂肪細胞などから採取し、培養し、調製することにより得られる。骨髄については、Mark F. Pittenger, et. al., Science, (1999) vol.284, pp143-147，Katia Mareschei, et. al., Haematologica(2001) vol.6, pp1099-1100、、末梢血については、Sergei A. Kuznetsov, et al., The journal of Cell Biology, (2001)
vol.153, pp1133-1139、臍帯血については、Alejandro Erices, et al.,
British Journal of Haematology (2000) vol.109, pp235-242に記載され
、脂肪細胞については、Patricia A. Zuk, et al., Tissue Engineering (2001) vol.7(2),
pp211-228に記載がある。また、本発明では歯周組織を再生することを意図する観点又は採取容易性の観点から、口腔組織から採取されることも好ましい。口腔組織としては、例えば、歯槽骨の骨髄、口蓋、歯槽骨の骨膜、歯小嚢組織、歯根膜、歯槽骨の骨髄などが挙げられる。また、抜歯などに付随して取得される歯肉等に由来する歯嚢細胞又は歯髄細胞から採取されたものであってもよい。

本組成物は、歯肉線維芽細胞を含んでいてもよい。歯肉線維芽細胞としては、間葉系幹細胞などの未分化・幹細胞から歯肉線維芽細胞など歯肉形成能を発現するように分化誘導されたものであってもよい。例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）によって分化誘導することができる。

本発明においては、こうした間葉系幹細胞及び歯肉線維芽細胞から１種又は２種以上を選択することができる。すなわち、間葉系幹細胞のみを含んでいてもよいし、歯肉線維芽細胞のみを含んでいてもよいし、双方を含んでいてもよい。また、これらの細胞は、培養細胞であってもよい。さらに、本発明の発明において用いる細胞は、本組成物が適用される個体の関係において、自家細胞、同種細胞及び異種細胞を含むが、好ましくは同種細胞であり、より好ましくは自家細胞である。例えば、ヒトの歯周軟組織の再生する目的には、組織適合抗原の一致数の多い他家細胞又は自家細胞を用いることが好ましい。

（マトリックス材料）
本組成物に用いるマトリックス材料としては、適用（投与）前又は生体内において適度な粘度を有する流体ないしゲル状体を形成可能なものであればよいが、生体内で分解吸収されていく性質をもつものが好ましい。マトリックス材料としては、従来、細胞のスキャホールドとして用いられている高分子材料等を用いることができる。例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸との共重合体、ポリ−ε−カプロラクトン、ε−カプロラクトンと乳酸あるいはグリコール酸との共重合体、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ−α−シアノアクリレート、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレート、ポリオルソエステル、ポリオルソカーボネート、ポリエチレンカーボネート、ポリプロピレンカーボネート、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタメート、ポリ−Ｌ−アラニンなどの合成高分子、デンプン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ペクチン酸およびこれらそれぞれの誘導体などの多糖、あるいはゼラチン、コラーゲン（コラーゲンのタイプおよびその抽出法はいずれであってもよい）、アルブミン、フィブリン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン及びビトロネクチンなどのタンパク質やペプチドなどが挙げられる。また、これらの各種のマトリックス材料としては、これらの架橋体やその一部を化学修飾した誘導体であってもよい。また、商業的に入手可能な各種のゲル剤（マトリゲル（商品名）、ＢＤPuraMatrixペプチドハイドロゲル、いずれもＢＤ社製）なども用いることができる。こうしたマトリックス材料は、本組成物の注入部位における細胞や増殖因子等の保持担体として機能することができる。なお、これらのマトリックス材料を、以下に説明する血液凝固系マトリックス材料に対して非血液凝固性マトリックス材料というものとする。

本発明者らの知見によれば、これらの非血液凝固性マトリックス材料は、注入部位への浸透性及び注入部位における保持性（留置性）に優れ、本組成物を注入部位の組織に容易に浸透させることができる。これにより、効果的にかつ滑らかに隆起した表面を有するなど好ましい注入部位形態で、再生が必要な部位又はその近傍に本組成物を到達させることができる。本組成物が組織に浸透しにくい場合、注入部位で表面に複数の小さな隆起を伴う隆起部位を形成しやすくなり、組織再生に不向きな注入部位を形成してしまうとともに、再生しようとする欠損部位に本組成物を到達させて組織を再生させることが困難になる。

また、マトリックス材料としては、血漿及び／又は血小板を含む血液画分に由来する血液凝固系マトリックス材料も用いることができる。血漿には、軟組織における線維芽細胞や間葉系細胞のスキャホールドとして適したフィブリン、フィブリノーゲンやフィブロネクチンなどの接着因子が含まれており、血小板はフィブリンゲル形成を促進する因子が含まれており生体内においてあるいは生体外において所定の刺激によりこれらを放出して粘性のある流体やゲル状体を形成可能である。

本発明者らの知見によれば、血液凝固系マトリックス材料は、浸透性及び保持性は劣るが組織再生に有効であると考えられる。

血小板及び血漿は、それぞれ単独で用いてもよいが、血小板はフィブリン及び／又はフィブリノーゲンと組み合わせて使用することが好ましく、また、他の血液画分である血漿と組み合わせて使用することが好ましい。血漿及び血小板を含む血液画分としては、血小板を濃縮した多血小板血漿（Platelet Rich Plasma：PRP）を好ましく用いることができ
る。多血小板血漿は、血漿由来のフィブリン、フィブリノーゲンなどの接着因子を含み、塩化カルシウム／トロンビン等の添加により容易に粘性が向上され、ゲル化されるとともに、生体内において血小板や細胞の保持担体を形成できる。

ＰＲＰは、例えば、Whitmanらの方法（Dean H. Whitman et al.:J Oral Maxillofac Surg,55,1294-1299 (1997)）に準じて、採取した血液を遠心分離処理に供することにより調製することができる。PRPは、Platelet-derived Growth Factor（PDGF）、Transforming growth factor β１（TGF−β１）、Transforming growth factor β２（TGF−β２）等の成長因子を豊富に含むことが知られている（Jarry J. Peterson:Oral surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol
Endod,85,638-646(1998)）。

以下にＰＲＰの調製方法の一例を示す。まず、採取した血液にクエン酸ナトリウム等の凝固防止剤を添加し、室温で所定時間放置する。その後、血球及び軟膜が分離する条件（例えば約5,4000rpm）で遠心処理する。これにより、２層（上層はPlatelet-poor Plasmaと呼ばれる。下層には、血球及び軟膜が含まれる）に分離される。上層を取り除いた後、更に、赤血球が分離される条件（例えば、約2,400rpm）で遠心処理する。その結果得られた赤血球を実質的に含まない画分（Platelet-rich Plasma：PRP）を採取する。PRPの調製方法は当該方法に限定されるものではなく、必要に応じて修正を加えた方法により調製することができる。好ましくは自己血のＰＲＰを用いる。これにより、毒性ないし免疫拒絶反応の恐れがなくなる。

PRPに含まれる血小板の数（血小板濃縮率）についての一般的な定義はないが、採取した血液に比較して約150倍〜約1500倍の血小板を含有する血漿を本発明におけるPRPとして用いることができる。本発明においてPRPの「血小板濃縮率」は、次の式で表される。
血小板濃縮率（％）＝（PRP中の平均血小板数／出発材料である全血中の平均血小板数）×100

従って、例えばPRP中の平均血小板数が1,000,000であって、全血中の平均血小板数が300,000であるときの血小板濃縮率は約333％となる。PRPの血小板濃縮率は、好ましくは、約150％〜約1500％（平均血小板数に換算した場合には通常、約240,000個／μL〜約6,150,000個／μLに相当する）の範囲である。さらに好ましくは血小板濃縮率が約300％〜約600％（平均血小板数に換算した場合には通常、約480,000個／μL〜約2,460,000個／μLに相当する）の範囲である。

なお、ＰＲＰの血小板濃縮率は、ＰＲＰを調製する際の遠心処理の条件を適宜調節することによって調整することができる。例えば、既に記載したように二段階の遠心処理を実施することとし、最初の遠心処理を約500rpm〜約1500rpm（例えば1,100rpm）、約5分間〜約15分間（例えば約5分）の条件で実施し、２段階目の遠心処理を約2000rpm〜約5000rpm（例えば約2,500rpm）、約5分間〜約15分間（例えば約5分）の条件で実施することで、血小板濃縮率が約300％〜約600％の範囲にあるPRPを得ることができる。なお、ＰＲＰの血小板濃縮率の計測は常法（例えば、実施例に示すように市販のSysmex XE-2100（Sysmex、東京、日本）を使用）を利用して行うことができる。

ＰＲＰは、本組成物を適用しようとする個体から採取した末梢血から調製することができる自家材料である点においても好ましい。また、後述するように、ＰＲＰは、細胞増殖因子を豊富に含んでいる点においても好ましい。ＰＲＰは、採取した末梢血等から常法により調製することができるほか、当業者であれば、必要に応じて改変を加えることができる。なお、ＰＲＰを自家材料として調製する場合には、適用個体の末梢血から自己トロンビンや自己血清を採取して添加することが好ましい。また、ＰＲＰは、ＣａＣｌ₂／トロンビンと１：１〜１０：１の混合物として用いることができる。なお、ＰＲＰに替えて、血小板、血小板とフィブリン及び／又はフィブリノーゲンとの混合物、血小板と血漿との混合物（多血小板血漿以外の形態での）などの血液凝固系を誘導可能な組成物もＰＲＰ相当物として用いることができる。

こうしたマトリックス材料としては、上記したマトリックス材料を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。本発明者らの知見によれば、歯周組織における良好な組織浸透性や注入部位における保持性を効果的に得るには、マトリックス材料として非血液凝固系マトリックス材料を用いることが好ましい。より好ましくは、（ａ）ヒアルロン酸及びその誘導体、（ｂ）コラーゲン及びその誘導体、（ｃ）フィブリン及びフィブリノーゲンから選択することができる。さらに好ましくは、（ａ）ヒアルロン酸及びその誘導体、（ｂ）コラーゲン及びその誘導体からマトリックス材料を選択する。一方、歯周組織における細胞増殖・組織再生能を効果的に得るには、（ｄ）血小板及び血漿、好ましくはＰＲＰなどの血液凝固系マトリックス材料からマトリックス材料を選択することが好ましい。

また、審美性の高い歯肉を得るには、マトリックス材料を上記（ａ）ヒアルロン酸及びその誘導体から選択することが好ましい。ヒアルロン酸等を用いることにより、マトリックス材料自身による着色を抑制して、本来の歯肉の色があらわれた歯肉組織を速やかに再生させることができる。この場合には、間葉系幹細胞を用いることが好ましい。なお、ヒアルロン酸と間葉系幹細胞とを組み合わせる場合には、後述するようにＰＲＰ等の血液凝固性マトリックス材料を合わせ用いることが好ましい。

また、特に、遊離歯肉の再生の観点からは、マトリックス材料を上記（ｂ）コラーゲン及びその誘導体から選択することが好ましい。この場合には、歯肉線維芽細胞を用いることが好ましい。後述する実施例において示すように、マトリックス材料として上記（ｂ）コラーゲン及びその誘導体と歯肉線維芽細胞とを含む組成物は、上記（ｄ）の血液凝固性マトリックス材料を含まなくても高い歯肉再生量を示している。このことは、コラーゲンと歯肉線維芽細胞との組み合わせの相乗効果によるものであって、いずれかのみでは得られない効果である。こうした組成物によれば、ブラックトライアングルなどの歯間の歯肉等欠損部位であっても容易に充てんすることができる。

また、同様に遊離歯肉再生の観点からは、マトリックス材料を上記（ａ）ヒアルロン酸及びその誘導体並びに（ｂ）コラーゲン及びその誘導体から選択される１種又は２種以上と、（ｄ）ＰＲＰなど血漿及び血小板から選択される１種又は２種以上とを用いることが好ましい。この場合、細胞は、間葉系幹細胞及び／又は歯肉線維芽細胞を用いることができるが、マトリックス材料が（ａ）ヒアルロン酸及びその誘導体から選択される場合、間葉系幹細胞が好ましく、マトリックス材料が（ｂ）コラーゲン及びその誘導体から選択される場合、歯肉線維芽細胞が好ましい。この場合において、（ａ）ヒアルロン酸及びその誘導体と（ｂ）コラーゲン及びその誘導体のそれぞれからマトリックス材料を選択することもできるし、一方のみから選択してもよい。遊離歯肉の再生と審美的観点からは、（ａ）ヒアルロン酸及びその誘導体から選択されるマトリックス材料と（ｄ）ＰＲＰなどの血漿及び血小板から選択されるマトリックス材料とを用いることが好ましい。

血液凝固性マトリックス材料は、間葉系幹細胞及び／又は歯肉線維芽細胞と組み合わされるだけで歯肉を再生することもできるが、好ましくは、非血液凝固系マトリックス材料と組み合わせて用いることが好ましい。そうすることで、血液凝固性マトリックス材料は、細胞が目的部位に浸透、到達及び保持されて始めてその作用を奏するからである。

したがって、本組成物においては、マトリックス材料として（ｄ）の血液凝固系マトリックスとしてＰＲＰ及び／又はＰＲＰ相当物（以下、単にＰＲＰ等という。）を含むとともに、他のマトリックス材料（非血液凝固系マトリックス材料）を含むことが好ましい。非血液凝固系マトリックス材料としては、（ａ）ヒアルロン酸及びその誘導体並びに（ｂ）コラーゲン及びその誘導体から選択されることが好ましい。細胞とＰＲＰ等の血液凝固系マトリックス材料と非血液凝固系マトリックスとを含み、これらを均一に混合して得られる組成物を調製することで、注入に適切な粘性を容易に得ることができる。

こうした組成物においては、ＰＲＰ等の血液凝固系マトリックス材料と非血液凝固系マトリックス材料とを混合した複合マトリックス材料を有するため、本組成物を注入部位の組織に容易に浸透させることができる。これにより、効果的にかつ滑らかに隆起した表面を有するなど好ましい注入部位形態で、再生が必要な部位又はその近傍に本組成物を到達させることができる。また、ＰＲＰ等と他のマトリックス材料からなる複合マトリックスを有するため、注入部位において細胞とともにＰＲＰ等も良好に保持される。この結果、本組成物の注入部位において、良好な細胞の増殖能・組織再生能を確保することができ、付着歯肉のみならず遊離歯肉であっても効果的に再生させることができる。以上のことから、ＰＲＰ等と他のマトリックス材料とからなる複合マトリックスを有する場合には、ブラックトライアングルなどの歯間の歯肉等欠損部位であっても容易に充てんすることができる。

以上のことから、ＰＲＰ等の血液凝固性マトリックス材料と非血液凝固性マトリックス材料とを含む本組成物には、本組成物を組織に注入した際に浸透性と保持性とを確保できる程度に血液凝固性マトリックス材料と非血液凝固性マトリックス材料とを含有していることが好ましい。非血液凝固系マトリックス材料が少なすぎるかあるいは血液凝固性マトリックス材料が多すぎると、注入時において組織への浸透性が得られにくいため、細かい凹凸を有する注入部位形状並びに組織を形成する傾向があり、また、細胞やＰＲＰ等が注入部位に保持されにくいため注入部位での組織再生能が低下する傾向があるからである。

本組成物におけるＰＲＰ等の血液凝固性マトリックス材料と非血液凝固性マトリックス材料との好ましい混合比は、例えば、本組成物を注入して形成される注入部位の高さや体積を指標とする皮下注入部位の隆起形状維持能に基づいて決定することができる（後段にて記載する）。好ましくは、例えば、１〜３％のコラーゲン溶液（好ましくは２％コラーゲン溶液）又は３mg/ｍｌ〜１５mg/mlのヒアルロン酸溶液（好ましくは１０mg/ml）に対して正常範囲の血小板含有量のＰＲＰを１０ｖ／ｖ％以上９００ｖ／ｖ％以下の比率で用いることができる。より好ましくは、１００ｖ／ｖ％以上であり、さらに好ましくは２００ｖ／ｖ％以上である。１００ｖ／ｖ％以上であると、他のマトリックス材料とＰＲＰとの併用効果を確実に得ることができ、２００ｖ／ｖ％以上であれば、本組成物の注入時において良好な組織状態が得られやすい。また、好ましくは２５０ｖ／ｖ％以下である。２５０ｖ／ｖ％を超えても併用効果が得られにくいからである。なお、ＰＲＰを併用する場合においては、ビヒクル又は組成物中のコラーゲン濃度としては０．２％以上１．８％以下であることが好ましく、より好ましくは、１％以下であり、さらに好ましくは０．６％以下である。また、ビヒクル又は組成物中のヒアルロン酸濃度としては、１mg/ml以上９mg/ml以下であることが好ましく、より好ましくは、５ｍｇ/ml以下であり、さらに好ましくは３mg/ml以下である。

本組成物において好ましいマトリックス組成を表１に例示する。この組成は、歯周軟組織に好ましいが、なかでも遊離歯肉、特に歯間乳頭部歯肉の再生に好ましい組成である。また、間葉系幹細胞、ヒアルロン酸及びＰＲＰ等の組み合わせ並びに線維芽細胞及びコラーゲンの組み合わせは遊離歯肉を効率的に再生できる。なお、表１の各組成においては、間葉系幹細胞と線維芽細胞とを同時に含有していてもよい。

（細胞増殖因子）
本組成物は、細胞増殖因子を含むことができる。細胞増殖因子としては、本組成物に含める細胞による歯肉再生を促進するものであれば特に限定されないが、例えば、細胞増殖、創傷治癒を促進するものが挙げられ、例えば、血小板のα顆粒中に含まれているとされる増殖因子であることが好ましい。こうした増殖因子としては例えば、細胞増殖を促進するPDGF、細胞サイクルを刺激するIV型コラーゲンの産生を促進するTGF-βのほか、VEGF及びEGFのほか、bFGFなどの増殖因子が挙げられる。

本組成物は、こうした増殖因子として血小板を含んでいてもよく、血漿と血小板とを含んでいてもよく、好ましくはＰＲＰを含んでいる。ＰＲＰは、既に説明したように、本組成物においてマトリックス材料として利用できる一方、細胞増殖因子源としても利用できる。

本発明の組成物によれば、歯肉形成能を有する細胞をマトリックス材料とともに含むため、再生を要する部位に容易に到達されるとともに、当該部位において良好に細胞が保持される。この結果、歯周軟組織を容易に再生することができる。本発明の組成物を歯周軟組織のなかでも遊離歯肉の再生に用いる場合には、注入部位の隆起形状維持能を有することが好ましい。遊離歯肉は、自立ないし隆起状の形態を採っているからである。注入部位の隆起形状維持能は、例えば、マウスやラットなどげっ歯類、好ましくはげっ歯類実験動物の背部の皮下に本発明の組成物を注入して形成される注入部位の高さや体積を指標とすることができる。

指標の一つとしては、注入部位の注入時の高さに対する所定期間経過後の注入部位の高さの比率が挙げられる。高さは、移植組織の隆起性や自立性の好適な指標だからである。この高さの比率は例えば以下のようにして求めることができる。
（ａ）げっ歯類の背部皮下に前記組成物を注入したときに形成される隆起部位の注入時の高さに対する組成物の注入１４４時間経過後の前記隆起部位の高さの比率とする。

この計測方法においては、げっ歯類は、好ましくは実験動物、より好ましくはヌードマウスである。さらに、本発明の組成物の注入量は、０．５ｍｌ〜３．０ｍｌとすることができるが、好ましくは１．０ｍｌである。なお、隆起部位の高さは、背部の皮下に組成物を注入して隆起した領域の最高部としマーキングの上、ノギスを用いて計測するものとする。

こうして求めた高さの比率が１５％以上であることが好ましい。１５％以上であれば、隆起形態をその後においても維持しやすいからである。より好ましくは３０％以上である。

高さ比率の他の態様は、前記隆起部位の注入時の高さに対する本発明の組成物の注入２８８時間経過後の隆起部位高さの比率である。計測方法は上記と同様である。この高さ比率が１５％以上であることが好ましい。１５％以上であれば、隆起形態をより維持しやすいからである。より好ましくは、３０％以上である。この態様の本発明の組成物は、さらに、前記隆起部位の注入時の高さに対する前記組成物の注入２８８時間経過後の前記隆起部位高さの比率が１０％以上であることが好ましい。

他の指標としては、皮下注入部位の注入時の体積に対する所定期間経過後の注入部位の体積の比率が挙げられる。体積は、移植組織の隆起性や自立性の好適な指標だからである。この体積の比率は例えば以下のようにして求めることができる。
（ｂ）げっ歯類の背部皮下に前記組成物を注入したときに形成される隆起部位の注入時の体積に対する組成物の注入１４４時間経過後の前記隆起部位の体積の比率とする。

体積の計測方法においても上記高さの計測におけるときと同様の態様を採用できる。体積の計測にあたっては、本発明の組成物を注入して隆起した部位の輪郭に４箇所以上のマーキングを付与しておき、このマーキングに基づいて隆起部位の長径と短径とを計測するとともに高さを計測する。隆起部位を半球体若しくは半楕円球体といった形状とみなし、その直径または長径及び短径をデータをもとに隆起部位の体積の近似値を算出するものとする。好ましくはマーキングは長径と短径と隆起部位の輪郭が交差する部位に設けるものとする。長径や短径はノギスなど適切な装置で計測すればよい。

こうした求めた体積の比率は、１０％以上であることが好ましく、この比率が２０％以上であることがより好ましい。さらに好ましくは３０％以上である。

本組成物は、使用時において歯周組織局所、すなわち、局所皮下に注入可能であることが好ましい。本組成物において、特に細胞以外の成分は、用時溶解性の粉末であってもよいし、予め液体あるいはゲル状など注入可能な流動性を有するように調製されていてもよいし、用時において希釈を前提として調製された流動性体であってもよい。さらに、用時において混合して用いる二剤以上からなるキットであってもよい。本組成物は、注入時に使用する適当な液媒体を含むことができる。こうした液媒体は、例えば、生理的に適合する緩衝液、生理食塩水、各種注射用溶媒が挙げられる。また、本組成物の細胞以外の成分は、必要に応じて、安定化剤、保存剤、ｐＨ調整剤、増粘剤などを含むことができる。

（本組成物の製造方法）
本組成物の調製方法は、特に限定されないが、例えば、本組成物を構成する構成成分である細胞とマトリックス材料、さらに必要に応じて細胞増殖因子等を単に混合するだけでもよく、必要に応じて、緩衝液、生理食塩水、注射用溶媒を含んでいてもよい。本組成物に含まれる細胞数は、好ましくは、1.0×10^４cells／ｍｌ〜1.0×10¹⁰cells／ｍｌ程度である。

細胞を懸濁するマトリックスとしては、既に説明した各種のマトリックス材料を用いることができるが、好ましくは、（ａ）ヒアルロン酸及びその誘導体、（ｂ）コラーゲン及びその誘導体、（ｃ）フィブリン及びフィブリノーゲン、（ｄ）血漿及び血小板（典型的にはＰＲＰ）から選択される１種又は２種以上を用いる。また、本組成物に用いるマトリックス材料溶液は、例えば、ヒアルロン酸は、3mg/ml〜15mg/mlの濃度、好ましくは10mg/mlの濃度のものを用いることができ、コラーゲンは、０．５〜５ｗｔ％の濃度、好ましくは、1〜３ｗｔ％の濃度のものを用いることができる。

なお、本組成物を調製するのにあたっては、使用する細胞を採取し、必要量を予め準備しておく必要がある。採取した細胞を培養して増殖させるには、取得した細胞の種類に応じて常法に従って培養すればよい。すなわち、未分化間葉系幹細胞及び歯肉線維芽細胞から選択される細胞を培養し、該培養した未分化間葉系幹細胞及び歯肉線維芽細胞から選択される細胞と、マトリックス材料とを混合してもよい。

（細胞の採取、分離、培養等）
細胞の採取、分離、培養等については、常法に従えばよいが、例えば、間葉系幹細胞については、次のようにして実施することができる。
（１）骨髄由来間葉系幹細胞の分離採取方法
ヒト又は実験動物の骨髄は、例えば腸骨などから常法に従い採取することができる。また、口腔骨髄から採取する場合には、歯槽骨を骨髄液が滲み出るまで穿孔して骨髄液を採取すればよい。こうして採取した骨髄液は、適当な培地（例えば１０％ＦＢＳ又は自己血清含有ＤＭＥＭ培地）とともに組織培養用培養皿に播種して、数日後培養皿に接着した細胞のみを培養し、浮遊細胞は洗浄して除く。

（２）口腔骨膜細胞の分離採取方法
ヒト又は実験動物の口蓋若しくは上顎若しくは下顎の歯槽粘膜を剥離して、歯槽骨上の骨膜を露出させて適当な大きさで採取し、採取した骨膜を細かく切り刻んだ後、３７℃にてコラーゲナーゼとともにインキュベートする。ついで、例えばピペッティング等により細胞を分散させ、ろ過又は遠心分離によって細胞を収集する。得られた細胞数を計測して適当な培地（例えば１０％ＦＢＳ又は自己血清含有ＤＭＥＭ培地）とともに組織培養用培養皿に播種する。

（３）歯髄組織あるいは歯嚢組織由来幹細胞の分離採取方法
歯髄組織あるいは歯嚢組織から採取する場合には、抜歯に伴って歯胚を採取した後、肉眼的にこれらの組織を切離後に外植片培養に供し、付着細胞のみを培養し、浮遊細胞を洗浄して除く。

（４）間葉系幹細胞の培養
こうして得られた各種間葉系幹細胞は、該細胞の培養に適する任意の培地を用いればよい。なお、必要に応じて、ｂＦＧＦ等の細胞増殖因子を添加して培養することもできる（J. Bone Mineral Res. 20,(2005), p399-409, Biochm. Biophys. Res.
Commun. 288(2001), p413-419）。培養は、哺乳動物の培養に適する任意の条件で実施することができるが、一般的には３７℃で５％炭酸ガス存在下で行うのが好ましい。幹細胞の継代培養は、当該細胞培養の分野において公知の適する方法で行えばよい。

（５）歯肉線維芽細胞の分離、採取、培養方法
歯肉線維芽細胞は、例えば、ヒト又は実験動物の歯肉から採取した歯肉小片を、トリプシンで処理して細胞分散した後、上清を取り除いて細胞浮遊液を調製し、細胞数をカウントした上、細胞数が適数個（例えば、１×１０²個/ml）となるように培養液で希釈する
かエキスプラントカルチャーによってシャーレ等に播種し、３７℃、５％ＣＯ₂のインキュベーターに移して培養し、単層のシートを形成したら継代する。線維芽細胞の継代培養は、当該細胞培養の分野において公知の適する方法で行えばよい。

本組成物は、歯周組織局所注入用として用いることが好ましく、より好ましくはヒト歯周組織局所注入用である。投与部位は、歯周軟組織の縮退又は欠損部位の近傍とすることができ、また、従来の硬組織主体の再生術後において遊離歯肉が不足した部位などの近傍であってもよい。具体的には、歯肉の退縮によって露出された根面部位の近傍やブラックトライアングルなど欠損した歯間乳頭部の近傍が挙げられる。

本組成物は、投与部位１箇所あたり、細胞を1.0×10⁴〜1.0×10¹⁰cells/ml含有する濃度で、50〜5000μｌ、より好ましくは、500〜2000μｌを投与する。投与部位は、また、頬側、舌側のいずれであってもよく、双方であってもよい。投与は、経皮的に皮下に注入してもよいし、投与部位を切開した上、本組成物を注入又は充てんし、その後縫合するようにしてもよい。さらにまた、切開部位において別途スキャホールドとなりうるマトリックス材料を別途充てんしてもよい。また、同時に２箇所以上に投与してもよい。

本発明の歯周局所注入用組成物は、辺縁歯肉や歯間乳頭部歯肉など微小な再生部位を再生するのに好適である。また、本組成物を切開を伴うことなく経皮的に皮下に注入したときであって、本組成物を単独で投与した場合あるいは歯肉表面に他の施術の痕跡を伴っていない場合には、歯肉表面の外観は大きく乱れることなく、治療中においても審美性が維持されるようになっている。特に、マトリックス材料として、ヒアルロン酸を用いる場合には、注入当初から歯肉の外観（色等）への影響がほとんどなく好ましい審美性が維持される。また、本発明の組成物がマトリックス材料を含有するとき、細胞等の組織浸透性及び保持性に優れるため、多数回の投与をしなくても十分な組織再生効果を得ることができる。したがって、このような点においても低侵襲性である。なお、局所注入する場合、単回投与でも良好に付着歯肉や遊離歯肉を再生することができるとともに、歯間乳頭部を充填することができる。

また、本組成物は、従来のＧＴＲ法やエナメルマトリックスを用いる方法、組織片移植法や露出根面被覆術と独立して投与部位に投与してもよいし、こうした従来法を補完するものとして従来法を実施するのと同時に投与してもよいし又はこうした従来法の施術後、歯槽骨や付着肉がある程度修復された後に投与してもよい。

本組成物によれば、歯周軟組織、すなわち、付着歯肉及び遊離歯肉などの歯間乳頭部歯肉の再生・修復に低侵襲であってしかも有効である。さらに、本組成物によれば、従来再生が困難あるいは不十分であった辺縁歯肉や歯間乳頭部歯肉などの遊離歯肉を効果的に再生することができる。この結果、本組成物によれば、審美的に良好な歯茎を再生することができる。したがって、本組成物は、遊離歯肉再生用組成物、個別には、辺縁歯肉再生用組成物及び歯間乳頭部歯肉再生用組成物として用いることができる。

（歯周軟組織の再生方法）
本組成物の実施形態の一つとして、歯周軟組織の再生方法が挙げられる。すなわち、本組成物をヒトなど歯周軟組織の再生を要する個体の歯周軟組織退縮部位又は欠損部位に投与することによって、これらの部位において付着歯肉や遊離歯肉を再生し、機能的で審美性の良好な歯茎を再建できる。本組成物の再生方法は、縮退部位や欠損部位そのものに投与するわけではなく、実際には空間を取り巻く残存する組織に本組成物を投与して、これら欠損部位等を充填するように歯周軟組織を再生する。したがって、欠損部位等の空間自体に組成物を供給して当該部位を再生するのとは根本的に相違している。特に、本発明の組成物、なかでも、コラーゲンと繊維芽細胞、又は、ヒアルロン酸と間葉系幹細胞とＰＲＰとを用いることにより、歯間乳頭部歯肉を効果的に再生することができる。なお、こうした再生方法の実施にあたっては、歯槽骨を中心とする硬組織の再生術（例えば、ＧＴＲ法、エナメルマトリックス法、細胞移植、組織片移植）と組み合わせて実施することができる。例えば、これらの再生術と同時にあるいはこれらの施術後に行ってもよい。また、再生方法に用いる本組成物の組成、投与方法等は、既に述べたとおりである。

なお、歯周組織の再生方法では、本組成物を用いたが、本組成物に含まれる個別の構成成分を組成物としてではなく別個の薬剤として別々にあるいは２種以上を組み合わせて注入等してもよい。例えば、予めマトリックス材料を注入したうえで、細胞懸濁液あるいは細胞と増殖因子を含む液を注入してもよいし、この逆であってもよい。本組成物の構成成分の１種又は２種以上を別個に投与する方法は、適宜設定されればよい。

（歯周組織再生用組成物の評価方法）
本発明によれば、歯周組織再生用組成物の評価方法も提供される。すなわち、既に説明した遊離歯肉又は歯間乳頭部歯肉の再生の指標を用いることにより、各種組成物について遊離歯肉の再生能評価工程を実施して、遊離歯肉の再生に適した組成物を得ることができる。評価の対象は、本発明の組成物とすることができる。評価の指標は既に述べた皮下注入時の隆起部位の「高さ比率」及び／又は「体積の比率」とすることが好ましい。そして、評価も、これらの指標について既に説明した数値を用いる。例えば、高さ比率が上記数値以上のとき、遊離歯肉形成能を肯定するとし、高さ比率が上記数値未満のときには、遊離歯肉形成能を否定するものとすることができる。

さらに、本発明によれば、こうした評価方法の評価工程を備える、遊離歯肉再生用組成物の製造方法が提供される。すなわち、こうした評価方法により、ある組成物の遊離歯肉形成能が肯定されたときには、当該組成物の組成に基づいて遊離歯肉再生用組成物を製造することができる。

以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

（実施例１：ヒト間葉系幹細胞の調製）
術前に患者の腸骨から常法に従い採取した。採取した骨髄液を適当な培地とともに組織培養用培養皿に播種した。浮遊細胞を除去し、一定期間毎に培養液を交換し細胞を培養増殖させた。

（実施例２：ヒト歯肉線維芽細胞の調製）
術前に患者の歯肉から採取し、エキスプラントカルチャーによって培養皿に播種し、37℃、5％CO₂のインキュベーターに移し培養する。通法（未分化間葉系幹細胞と同法）にて培養増殖、細胞塊を調整した。

（実施例３：細胞移植）
本実施例では、マウスに各種系列のマトリックス材料と細胞とを注入し、隆起部位におけるサイズの経時変化を測定して、付着歯肉や遊離歯肉の再生材料として使用できるかどうかを評価した。
（１）実験動物の準備
ヌードマウスにジエチルエーテルによって麻酔導入後、予め１０倍希釈しておいたペントバルビタールナトリウム（商品名ソムノペンチル）をツベルクリン接種用シリンジにて腹腔内注射（ただし、限度量は１０倍希釈を０．６ｍｌとする。）して麻酔状態を維持した。麻酔後、市販除毛クリームで除毛した。

（２）再生用組成液の調製
実験動物に移植する再生用組成液を予め調製しておいたヒト間葉系幹細胞(MSCs)又はヒト歯肉線維芽細胞（FB）を用いて全量１．０ｍｌの組成液を調製した。なお、各系列は、それぞれ細胞成分以外の成分（コラーゲン、ヒアルロン酸、PRP並びにヒアルロン酸及びPRP）のみの液を対照として含んでいる。また、注入前にＰＫＨ２６染色を行った。

調製した各液を表２に併せて示すように、各一体のヌードマウスの背部に３種類の液を２２G針のシリンジにて、それぞれ1.0ｍｌ注入した。注入部位を明示するために注入部位の周囲に墨汁にてマーキングした。すなわち、図２に示すように、注入部位（腫脹部位）の辺縁上の腫脹部位の基部の長径及び短径が直交する部位にマーキングし、注入部位の長径、短径及び高さをそれぞれ計測し、術後０日目の計測値とした。なお、各寸法の計測には、ノギスを用いた。

（３）術後６日目
注入時と同様にして各ヌードマウスを麻酔し、注入時におけるマーキングに部位に基づいて注入部位のサイズを計測した。
（４）術後１２日目
各ヌードマウスにジエチルエーテルを過吸入させてと殺した。注入部位のサイズを計測後、マウス背部から取り出して、摘出切片を顕微鏡下で観察した。

術後０日目、６日目及び１２日目における各計測値から得られる注入部位の高さ、体積、長径及び短径の変化をそれぞれ図３〜６に示す。隆起部位を半球体若しくは半楕円球体といった形状とみなし、その直径または長径及び短径のデータをもとに隆起部位の体積の近似値を算出した。

図３〜図６に示すように、全ての系列において、試験液注入後、当初腫脹していた注入部位は縮小し、その高さ、短径及び長径は減少した。

（高さについて）
図３に示すように、マトリックス材料としてコラーゲンを用いたコラーゲン系列においては、間葉系幹細胞含有液及び線維芽細胞含有液のいずれにおいても術後６日後（１４４時間後）時点ではほぼ同定度の注入部位高さ（５０〜６５％）を維持していたが、術後１２日後（２８８時間後）時点で、間葉系幹細胞含有液では退縮し（１０％）、線維芽細胞含有液では４０％を維持していた。すなわち、コラーゲンと線維芽細胞とは高さ維持率に好適な組成であるといえる。また、ヒアルロン酸系列では、間葉系幹細胞であっても線維芽細胞であっても、術後６日目において既に高さは１０％以下であり、ほぼ注入部位の高さは消失していた。ＰＲＰ系列でもヒアルロン酸系列と同様の傾向が観察された。これに対して、（ヒアルロン酸＋PRP）系列では、術後６日目（１４４時間後）において、間葉系幹細胞含有液では約６０％、線維芽細胞含有液では約２０％、術後１２日目（２８８時間後）では間葉系幹細胞含有液で約５０％、線維芽細胞含有液では１０％未満の維持率であった。すなわち、（ヒアルロン酸＋ＰＲＰ）系列では、間葉系幹細胞及び線維芽細胞が双方良好な高さ維持率を示すが、間葉系幹細胞がより高さ維持率において好ましいことがわかった。

（体積について）
図４に示すように、マトリックス材料としてコラーゲンを用いたコラーゲン系列においては、間葉系幹細胞含有液及び線維芽細胞含有液のいずれにおいても術後６日後時点ではほぼ同様の注入部位体積を維持していたが、術後１２日（２８８時間後）で、間葉系幹細胞含有液では、注入部位はほとんど退縮してしまった。これに対し線維芽細胞含有液では、術後０日後の体積に対して３０％程度の体積を維持していた。すなわち、コラーゲンと線維芽細胞とは体積維持率に好適な組成であるといえる。また、ヒアルロン酸系列では、間葉系幹細胞であっても線維芽細胞であっても、術後６日目（１４４時間後）において既にほぼ注入部位の体積は消失していた。PRP系列でもヒアルロン酸系列と同様の傾向が観察された。これに対して、（ヒアルロン酸＋PRP）系列では、術後６日目（１４４時間後）において、間葉系幹細胞含有液では約４０％、線維芽細胞含有液では約１６％、術後１２日目（２８８時間後）では間葉系幹細胞含有液で１０％超、線維芽細胞含有液では５％未満の維持率であった。すなわち、（ヒアルロン酸＋ＰＲＰ）系列では、間葉系幹細胞及び線維芽細胞が双方良好な維持率を示すが、間葉系幹細胞がより体積維持率において好ましいことがわかった。

（長径及び短径について）
さらに、図５及び図６に示すように、いずれの系列においても、短径及び長径とも減少したが、全ての系列において一定以上維持されており、高さや体積ほど系列内においてまた系列間において差がなかった。

以上の結果から、間葉系幹細胞又は歯肉線維芽細胞とマトリックス材料とを少なくとも含有する組成物は、隆起部位の短径及び長径が一定以上保持されていることから歯周軟組織のうち付着歯肉を再生できることがわかった。また、特に、コラーゲンと線維芽細胞との組み合わせ、ヒアルロン酸とＰＲＰとを含む組み合わせ（特に、間葉系幹細胞との組み合わせ）についての隆起部位の高さ及び体積の維持率が他の組み合わせよりも明らかに有効であり、これらの隆起部位のプロファイルによれば付着歯肉のみならず自立する遊離歯肉などの歯間乳頭部歯肉の再生に好適であることがわかった。また、注入部位の高さと体積とが対応しており、注入部位の体積のほか注入部位の高さは簡易な指標として遊離歯肉の再生効果の指標として用いることができることがわかった。

また、皮下の注入部位を観察した結果から、ヒアルロン酸を用いることにより粘膜表面の色が周囲とほとんど変わらない外観の良好な再生部位を形成できることがわかった。

（実施例４：歯間乳頭部歯肉の再生）
本実施例は、歯間乳頭部歯肉が欠損してブラックトライアングルを生じた患者３名に間葉系幹細胞を含有する試験液を注入し、歯間乳頭部歯肉を再生した例である。患者は、下顎歯牙の歯間乳頭部（詳しくは下顎インプラント補綴後の周囲歯間乳頭部）が欠損してブラックトライアングルが生じた男性Ａ（５４歳）、上顎前歯の歯間乳頭部が欠損してブラックトライアングルが生じた男性Ｂ（２２歳）、上顎歯牙の歯間乳頭部が欠損してブラックトライアングルが生じた女性（４８歳）であった。術前、各患者の骨髄より採取したMSCsを培養した。また、術当日、各患者から50ｍｌ採血し、採取した血液を遠心分離してPRPを準備した。ヒアルロン酸溶液（ヒアルロン酸ナトリウム10mg/ml）に対してＰＲＰが１００ｖ／ｖ％〜２３０ｖ／ｖ％、MSCsが1×10^７cells／mlとなるように調製した混液に対し１０ｗｔ％ＣａＣｌ_２＋トロンビンを添加し混合して試験液を調製した。各試験液調製後速やかに、各患者の上記欠損部位近傍に対してそれぞれ合計1.0ｍｌを注入した。いずれの患者においても注入から６日間経過後、上記欠損部位において歯間乳頭部歯肉が再生されはじめ、ブラックトライアングルは消失していた。

５４歳の男性Ａについて術前及び術後経過の観察結果を図７に示す。図７に示すように、術前にはブラックトライアングルが生じていた（図７中ａ参照）が、術後日数を追うごとに歯肉が再生されはじめ、歯間乳頭部が再生歯肉により充てんされ、ブラックトライアングルは消失した。

（実施例５：実施例３のマウス皮下注入部位の組織観察）
実施例３で作製した、ヒアルロン酸＋ＰＲＰ系列である（ＭＳＣｓ／ＨＡ／ＰＲＰ）の組成物及び（ＦＢ／ＨＡ／ＰＲＰ）の組成物をそれぞれ注入したヌードマウスの各注入部位から採取した組織切片のＨＥ染色及び蛍光染色による染色結果を図８及び図９に示す。図８のａ及びｂは、ＨＥ染色による顕微鏡写真画像であり、図８ｃは、蛍光染色による顕微鏡写真画像である。図８のａ〜ｃに示すように、（ＭＳＣｓ／ＨＡ／ＰＲＰ）の注入部位は良好な組織を形成しているとともに、移植したＭＳＣｓ（橙色）の周囲においてＩ型コラーゲンがよく産生されていることがわかった。これに対して、同じヒアルロン酸＋ＰＲＰ系列である（ＦＢ／ＨＡ／ＰＲＰ）の注入部位から採取した組織は、図９に示すように、Ｉ型コラーゲンの産生は、（ＭＳｃ／ＨＡ／ＰＲＰ）に比べて少なかった。以上の結果から、（ＭＳｃ／ＨＡ／ＰＲＰ）組成物は、注入部位におけるコラーゲン産生量に優れること及びコラーゲン産生量と注入部位における高さ比率及び体積比率（図３及び図４参照）の結果に対応していることがわかった。

以上の結果から、良好な隆起形状維持能を有する再生用組成物を用いることにより、歯間乳頭部歯肉など再生の困難な部位であっても簡易にかつ審美的に良好に再生できることがわかった。

本出願は、２００６年４月１９日に出願された日本国特許出願特願２００６−１１５９３２を優先権主張の基礎としており、その内容の全てが本明細書に含まれる。

Claims (34)

1. 間葉系幹細胞及び歯肉線維芽細胞から選択される細胞と、
   マトリックス材料と、
   を含有する、歯周軟組織再生用組成物。
2. 細胞増殖因子を含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記マトリックス材料は、以下の（ａ）〜（ｄ）：
   （ａ）ヒアルロン酸及びその誘導体
   （ｂ）コラーゲン及びその誘導体
   （ｃ）フィブリン及びフィブリノーゲン
   （ｄ）血漿及び血小板
   から選択される１種又は２種以上を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 前記マトリックス材料は、少なくとも前記（ａ）のヒアルロン酸及びその誘導体から選択される、請求項３に記載の組成物。
5. 前記細胞は、間葉系幹細胞である、請求項３又は４に記載の組成物。
6. 前記マトリックス材料は、少なくとも前記（ｂ）のコラーゲン及びその誘導体から選択される、請求項３に記載の組成物。
7. 前記細胞は、歯肉線維芽細胞である、請求項３又は６に記載の組成物。
8. 前記マトリックス材料は、少なくとも前記（ｄ）の血漿及び血小板から選択される、請求項３〜７のいずれかに記載の組成物。
9. 前記マトリックス材料は、前記（ａ）のヒアルロン酸及びその誘導体、及び前記（ｄ）の血漿及び血小板のそれぞれから選択される、請求項３に記載の組成物。
10. 前記細胞は間葉系幹細胞である、請求項９に記載の組成物。
11. 前記（ｄ）の血漿及び血小板のマトリックス材料は多血小板結晶である、請求項１０に記載の組成物。
12. 前記マトリックス材料は、前記（ｂ）のコラーゲン及びその誘導体、及び前記（ｄ）の血漿及び血小板のそれぞれから選択される、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記細胞は歯肉線維芽細胞である、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記マトリックス材料は、前記（ｂ）のコラーゲン及びその誘導体、及び前記（ｄ）の血漿及び血小板のそれぞれから選択される、請求項１３に記載の組成物。
15. げっ歯類の背部の皮下に前記組成物を注入したときに形成される隆起部位の注入時高さに対する前記組成物の注入から１４４時間経過後の前記隆起部位の高さの比率が１５％以上である、請求項１〜１４のいずれかに記載の組成物。
16. 前記高さの比率が３０％以上である、請求項１５に記載の組成物。
17. げっ歯類の背部の皮下に前記組成物を注入したときに形成される隆起部位の注入時高さに対する前記組成物の注入から２８８時間経過後の前記隆起部位の高さの比率が１５％以上である、請求項１〜１６のいずれかに記載の組成物。
18. 前記高さの比率が３０％以上である、請求項１７に記載の組成物。
19. げっ歯類の背部皮下に前記組成物を注入したときに形成される隆起部位の注入時の体積に対する組成物の注入１４４時間経過後の前記隆起部位の体積の比率が１０％以上である、請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物。
20. 前記比率が２０％以上である、請求項１９に記載の組成物。
21. 前記歯周軟組織は付着歯肉である、請求項１〜２０のいずれかに記載の組成物。
22. 前記歯周軟組織は遊離歯肉である、請求項１〜２１のいずれかに記載の組成物。
23. 前記歯周軟組織は歯間乳頭部である、請求項１〜２２に記載の組成物。
24. 歯周組織局所注入用である、請求項１〜２３のいずれかに記載の組成物。
25. 間葉系幹細胞及び歯肉線維芽細胞から選択される細胞を培養する工程と、
    該培養した間葉系幹細胞及び／又は歯肉線維芽細胞とマトリックス材料とを混合する工程と、を備える、歯周軟組織再生用組成物の製造方法。
26. 前記細胞は間葉系幹細胞又は歯肉線維芽細胞である、請求項２５に記載の製造方法。
27. 前記歯周軟組織は付着歯肉である、請求項２５又は２６に記載の製造方法。
28. 前記歯周軟組織は遊離歯肉である、請求項２５〜２７のいずれかに記載の製造方法。
29. 前記混合工程は、前記マトリックス材料として以下の（ａ）〜（ｄ）：
    （ａ）ヒアルロン酸及びその誘導体
    （ｂ）コラーゲン及びその誘導体
    （ｃ）フィブリン及びフィブリノーゲン
    （ｄ）血漿及び血小板
    から選択される１種又は２種以上を用いる工程である、請求項２５〜２８のいずれかに記載の製造方法。
30. 前記混合工程は、前記マトリックス材料として、少なくとも前記（ａ）のヒアルロン酸及びその誘導体から選択される１種又は２種以上を用いる工程である、請求項２９に記載の製造方法。
31. 前記混合工程は、前記細胞としての前記歯肉線維芽細胞を用い、前記マトリックス材料として、少なくとも前記（ｂ）コラーゲン及びその誘導体から選択される１種又は２種以上を用いる工程である、請求項２９に記載の製造方法。
32. 前記混合工程は、前記マトリックス材料として、少なくとも前記（ｄ）の血漿及び血小板として多血小板血漿を用いる工程である、請求項２９〜３１のいずれかに記載の製造方法。
33. 歯周軟組織再生用組成物の評価方法であって、
    間葉系幹細胞及び歯肉線維芽細胞から選択される細胞と、マトリックス材料と、を備える被験用の歯周軟組織再生用組成物を調製する工程と、
    前記歯周軟組織再生用組成物は、げっ歯類の背部の皮下に前記被験用の歯周軟組織再生用組成物を注入したときに形成される隆起部位の注入時高さに対する前記被験用組成物の注入から所定時間経過後の前記隆起部位の高さの比率及び／又は前記隆起部位の注入時体積に対する前記被験用組成物の注入から所定時間経過後の前記隆起部位の体積の比率を取得する工程と、
    前記取得した高さの比率及び／又は体積の比率に基づいて遊離歯肉再生能を評価する工程と、
    を備える、方法。
34. 歯周軟組織再生用組成物の製造方法であって、
    間葉系幹細胞及び歯肉線維芽細胞から選択される細胞と、マトリックス材料と、を備える被験用の前記歯周軟組織再生用組成物を調製する工程と、
    げっ歯類の背部の皮下に前記被験用の歯周軟組織再生用組成物を注入したときに形成される隆起部位の注入時高さに対する前記被験用組成物の注入から所定時間経過後の前記隆起部位の高さの比率及び／又は前記隆起部位の注入時体積に対する前記被験用組成物の注入から所定時間経過後の前記隆起部位の体積の比率を取得する工程と、
    前記取得した高さの比率及び／又は体積の比率に基づいて遊離歯肉再生能を評価する工程と、
    前記遊離歯肉再生能に基づいて前記歯周軟組織再生用組成物の組成を決定し、当該決定した組成に基づいて前記歯周軟組織再生用組成物を製造する工程と、
    を備える、方法。