CN106267354A - 一种牙髓间充质干细胞制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞制剂技术领域，特别涉及一种牙髓间充质干细胞制剂及其制备方法和应用。该牙髓间充质干细胞制剂包括牙髓间充质干细胞、富血小板血浆和微载体。本发明通过改进，将微小化的组织工程支架与牙髓间充质干细胞联合并在制剂中添加自身PRP可明显减少注射间充质干细胞的死亡并促进骨细胞的增殖及基质分泌，该牙髓间充质干细胞制剂可有效修复牙槽骨退化。

Description

一种牙髓间充质干细胞制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及细胞制剂技术领域，特别涉及一种牙髓间充质干细胞制剂及其制备方法和应用。
背景技术
牙槽骨是人体骨骼系统中唯一特殊的一部份，因为牙槽骨是没有骨髓的一个突出部，当人体的骨骼系统发育定型后，牙槽骨基本依赖包裹它的牙龈组织来供养。当牙龈老化萎缩后，对牙槽骨输送营养的能力日趋下降，牙槽骨也就随之萎缩变短，口腔医学称为“骨吸收现象”。牙龈萎缩导致这一“微动关节”的包裹维系强度降低，牙齿开始松动，同时牙槽骨被吸收，使牙齿根基变浅，牙齿变长，随着骨吸收现象的日趋加剧，牙齿自然也就脱落了。牙结石、牙周炎、牙龈炎等疾病也会使得牙龈萎缩，进而出现牙槽骨退化，最终牙齿松动脱落。
目前治疗牙槽骨退化的一般策略是使用支架或注射细胞制剂，但效果并不理想。通过工程支架实现牙槽骨修复，存在组织相容性排斥并且很难控制支架的降解速度，存在创口较大恢复慢等缺点。直接通过活细胞注射治疗软骨损伤，会出现细胞存活率偏低，细胞增殖困难的缺点，以及制剂外漏等缺点。
随着生物技术的发展，干细胞在治疗各种疾病模型中的研究愈来愈多，由于它具有自我更新并可分化成多种类型的细胞，有着广泛的应用前景，因此也被作为治疗牙槽骨退化的主要研究对象。但直接通过干细胞注射治疗牙槽骨退化存在细胞存活率偏低、细胞增殖困难的缺点。因此，急需提供一种可有效治疗牙槽骨退化的干细胞制剂。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种牙髓间充质干细胞制剂及其制备方法和应用。本发明通过改进，将微小化的组织工程支架与牙髓间充质干细胞联合并在制剂中添加自身PRP可明显减少注射间充质干细胞的死亡并促进骨细胞的增殖及基质分泌，该牙髓间充质干细胞制剂可有效修复牙槽骨退化。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种牙髓间充质干细胞制剂，包括牙髓间充质干细胞、富血小板血浆和微载体。
本发明通过将组织工程支架微小化，并有大量细胞粘附，此外添加富血小板血浆(PRP)是自体血提取的血小板浓缩物，含有丰富的生长因子及其他组织再生必须的细胞因子，可为骨细胞生存提供良好的微环境，无免疫原性，该干细胞制剂可有效修复牙槽骨退化。
作为优选，牙髓间充质干细胞制剂中各组分的用量为：
牙髓间充质干细胞：(1～10)×107细胞；
PRP：1～10mL；
微载体：0.01～0.1g。
优选地，牙髓间充质干细胞制剂中各组分的用量为：
牙髓间充质干细胞：(1～10)×107细胞；
PRP：1mL；
微载体：0.01～0.06g。
作为优选，牙髓间充质干细胞制剂的pH值为6.5～7.5。
作为优选，牙髓间充质干细胞制剂的pH值为7.2～7.4。
作为优选，牙髓间充质干细胞制剂的渗透压为280～320毫渗当量/升。
在本发明提供的实施例中，牙髓间充质干细胞制剂的渗透压为285～315毫渗当量/升。
作为优选，牙髓间充质干细胞为自体牙髓间充质干细胞。
作为优选，富血小板血浆为自体富血小板血浆。
作为优选，微载体为交联猪明胶微载体。
本发明还提供了该牙髓间充质干细胞制剂在制备修复牙槽骨退化的药物中的应用。
本发明还提供了该牙髓间充质干细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：
采用微载体培养牙髓间充质干细胞，得到负载牙髓间充质干细胞的微载体；
采用PRP重悬负载牙髓间充质干细胞的微载体，得到牙髓间充质干细胞制剂。
在本发明提供的实施例中，富血小板血浆的制备方法为：将外周血400g离心10min，分为3层；取上层和中层液体400g离心5min，分为3层；取上层和中层液体1200g离心5min，得到富血小板血浆。
本发明提供了一种牙髓间充质干细胞制剂及其制备方法和应用。该牙髓间充质干细胞制剂包括牙髓间充质干细胞、富血小板血浆和微载体。本发明至少具有如下优势之一：
1、本发明通过改进，将微小化的组织工程支架与牙髓间充质干细胞联合并在制剂中添加自身PRP可明显减少注射间充质干细胞的死亡并促进骨细胞的增殖及基质分泌，该牙髓间充质干细胞制剂可有效修复牙槽骨退化；
2、无论是牙髓间充质干细胞还是PRP完全是自身的，无毒、无免疫原性，对患者损伤小，不存在免疫排斥问题和传播疾病的危险；
3、PRP释放多种高浓度的生长因子，其比例与体内正常比例相符，具有最佳的协同作用，既有单一因子的生物学效应，又有各种生长因子之间的相互作用；
4、牙槽骨修复在牙龈组织内，可以防止负载牙髓细胞的微载体和血小板的流失，使其在局部长时间分泌生长因子，保持较高的生长因子浓度有利于牙髓细胞归巢；
5、PRP中的血小板有促进凝血的作用，可刺激骨组织再生，促进伤口愈合。
具体实施方式
本发明公开了一种牙髓间充质干细胞制剂及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
微载体以细小的颗粒作为细胞载体，通过搅拌悬浮在培养液内，使细胞在载体表面繁殖成单层的一种细胞培养技术；
牙槽骨(alveolarbone)是上、下颌骨包围和支持牙根的部分，又称为牙槽突(alveolar proces)；
PRP(Platelet Rich Plasma)中文的意思是富含血小板、血浆或富含生长因子的血液。
本发明提供的牙髓间充质干细胞制剂及其制备方法和应用中所用生物材料、试剂和仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 自体牙髓间充质干细胞的分离及培养
①无菌条件下分离牙髓，放入含有双抗的PBS缓冲液的离心管中清洗。
②将分离得到的牙髓组织剪碎成0.1-0.3mm3的组织块，移入15mL离心管。
③加入牙髓体积19-15倍的0.3％的I型胶原酶+0.4％中性蛋白酶，37℃消化40min后终止消化。
④在倒置显微镜下观察，当游离出单个细胞后，加入DMEM/F12完全培养基将混合酶稀释终止消化。
⑤将细胞团吹打成单个细胞，1500rpm/min离心5min。
⑥弃上清，加入DMEM/F12完全培养基重悬，0.2％台盼蓝染色，活细胞率大于90％，把细胞悬液稀释成(2～3)*105细胞/mL，接种于培养瓶放入CO2培养箱中培养。
⑦原代培养：将消化所得的细胞悬液以(2～3)*105细胞/mL接种于T25培养瓶中，每平加入5mL细胞悬液。把培养瓶置于CO2培养箱中培养(37℃，饱和湿度，5％CO2，95％空气)。48h后视细胞贴壁情况更换培养液，以后每两天更换培养液1次。
⑧传代培养：当倒置显微镜观察软骨细胞汇合度达90％，倾去培养液，加入0.25％胰蛋白酶2mL，室温下静止5～10min，在倒置显微镜下若观察到细胞皱缩变圆，个别细胞开始浮游，此时应迅速加入新鲜培养液终止消化，吹打细胞使其分散形成单个牙髓细胞悬液，1500rpm/min离心5min，按照前述方法分瓶培养或冻存以备用。
⑨交联猪明胶微载体培养牙髓间充质干细胞，获得负载自体牙髓间充质干细胞的组织工程微载体材料。
交联猪明胶微载体培养牙髓间充质干细胞的具体操作如下：
1、配制培养液
在1L DMEM(高糖型)培养基中添加60mL胎牛血清和35mmol HEPES。
2、交联猪明胶微载体预处理：将0.25g交联猪明胶微载体置于50mL塑料离心管中，用0.lmol/L、pH为7.0无钙续磷酸续缓冲液(PBS)浸泡过夜后，吸去PBS，再用PBS洗涤3次，经121℃高压灭菌30分钟后，吸出PBS，用培养基洗涤2次，最后用以上配制的培养液浸泡10小时以上，备用。
3、浓缩静止接种法接种细胞：消化收集2维培养的牙髓间充质干细胞悬液，总量为2×107的细胞悬液放入上述微载体中，轻轻混匀，在无菌条件下取出50mL无菌高横截面微重力旋转培养瓶，打开瓶盖和两个孔阀门，用注射器将含交联猪明胶微载体的牙髓间充质干细胞悬液经注射孔缓缓注入微重力旋转培养瓶中，继续添加上述培养液至15-20mL(接种细胞至终体积1/3的培养液中，以增加细胞与微载体接触的机会)，取出两个注射器，盖上瓶盖并将其稍稍扭松，静止横放于二氧化碳孵箱中，培养条件为温度:37℃，二氧化碳浓度:5％。每8小时取出轻轻摇晃1分钟。24小时后取出微重力旋转培养瓶置于紫外消毒后的超净台中，用75％酒精擦拭瓶盖和瓶壁3次，打开瓶盖，将两支无菌10mL注射器(其中一支装有培养液，另一支不装培养基)分别连接在两个取样孔上，打开取样孔阀门，将注射器中的培养液缓慢注入容器内，容器内气泡从另一支空的注射器中排出(培养过程中始终保持容器内无气泡，以避免形成涡流)，将整个容器充满后再用75％酒精擦拭瓶口和瓶壁3次，最后将其移入二氧化碳培养箱中，安装在培养装置上，并根据所接种微载体和细胞的量调整容器的转速(随着细胞增殖，微球变得越来越重，需要增加搅拌速度，保证完全均质混合)，以微载体在旋转过程中不贴附在容器的内外壁上为宜。本试验中设定旋转初速度为7.6rpm/min。
4、经过3d左右，培养液开始呈酸性，需要换液：停止搅拌，让微珠沉淀5min，弃掉适宜体积的培养液，缓慢加入新鲜培养液(37℃)，重新置于二氧化碳孵箱中开始搅拌培养。
5、收获细胞：根据牙髓间充质干细胞的增殖速度大概5-7天即可使微载体表面铺满，细胞收获量约为(5～8)×106个/mL，排干培养液后，至少用PBS缓冲液或生理盐水清洗2次，弃掉清洗液即可与PRP混合备用。
实施例2 PRP的制备
①无菌采集获取自身外周全血10mL；
②转入15mL离心管，400g离心10min，此时分为3层，上层乏血小板血浆，中层富血小板，下层血细胞；
③转移上层和全部中层到新的15mL离心管，400g离心5min，此时分为3层，上层乏血小板血浆，中层富血小板，下层有少量血细胞；
④将上层和中层转移入新的15mL离心管，尽量不要吸到血细胞，1200g离心5min，留取需要体积的血浆，并重悬底部血小板，即得PRP。
实施例3 注射制剂的制备
将实施例1获得的粘附有自体牙髓间充质干细胞的组织工程微载体材料经实施例2获得的PRP重悬为(1～2)×107细胞/mL，用于注射到患处。该注射制剂的pH为7.2-7.4；渗透压范围为285-315毫渗当量/升。该注射制剂中：载体重量：细胞个数：PRP体积＝0.01g：(1～2)×107：1mL。
实施例4 注射制剂的制备
将实施例1获得的粘附有自体牙髓间充质干细胞的组织工程微载体材料经实施例2获得的PRP重悬为(3～5)×107细胞/mL，用于注射到患处。该细胞制剂的pH为7.2-7.4；渗透压为295-305毫渗当量/升。该注射制剂中：载体重量：细胞个数：PRP体积＝0.03g：(3～5)×107：1mL。
实施例5 注射制剂的制备
将实施例1获得的粘附有自体牙髓间充质干细胞的组织工程微载体材料经实施例2获得的PRP重悬为(6～10)×107细胞/mL，用于注射到患处。该细胞制剂的pH为7.2-7.4；渗透压为305-315毫渗当量/升之间。该注射制剂中：载体重量：细胞个数：PRP体积＝0.06g：(6～10)×107：1mL。
实施例6 牙槽骨退化修复的治疗研究
采用本发明实施例3～5制得的注射制剂进行牙槽骨退化修复的治疗研究具体试验方法如下：
取健康大鼠25只，随机分为5组：
实验组1：采用实施例3注射制剂进行治疗；
实验组2：采用实施例4注射制剂进行治疗；
实验组3：采用实施例5注射制剂进行治疗；
阳性对照组：牙髓间充质干细胞+5％人血清白蛋白；
阴性对照组：生理盐水组。
各组制剂的组成如下：
表1 各组制剂的组成
通过牙线结扎法迫使牙龈萎缩(结扎实验持续8周左右)，建立牙槽骨退化模型。造模后，实验组颊侧牙龈注射本发明注射制剂0.15mL，阳性对照组颊侧牙龈注射5％人血清白蛋白+牙髓间充质干细胞0.15mL，阴性对照组颊侧牙龈注射生理盐水0.15mL，一周1次，连续8周完成治疗。治疗结束后处死动物，进行病理学观察，对牙槽骨退化情况进行测量，记录。
阳性对照组干细胞制剂制备方法：采用5％人血清白蛋白1mL重悬牙髓间充质干细胞，细胞浓度为2×107细胞/mL，pH为7.35，渗透压为295毫渗当量/升。
阴性对照生理盐水的pH为6.9，渗透压为312毫渗当量/升。
实验结果如下：
表2 大鼠牙槽骨病理情况表
动物组别 牙槽骨丧失高度
实验组1 300μm
实验组2 220μm
实验组3 180μm
阳性对照组 500μm
阴性对照组 900μm
由上表可以看出，实验组和阳性对照组均可显著改善大鼠牙槽骨退化，且试验组较阳性对照组亦有显著性差异，说明本发明注射制剂较人血清白蛋白联合牙髓间充质干细胞治疗效果显著。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种牙髓间充质干细胞制剂，其特征在于，包括牙髓间充质干细胞、富血小板血浆和微载体。
2.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞制剂，其特征在于，所述牙髓间充质干细胞制剂中各组分的用量为：
牙髓间充质干细胞：(1～10)×107细胞；
PRP：1～10mL；
微载体：0.01～0.1g。
3.根据权利要求1或2所述的牙髓间充质干细胞制剂，其特征在于，所述牙髓间充质干细胞制剂中各组分的用量为：
牙髓间充质干细胞：(1～10)×107细胞；
PRP：1mL；
微载体：0.01～0.06g。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的牙髓间充质干细胞制剂，其特征在于，所述牙髓间充质干细胞制剂的pH值为6.5～7.5。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的牙髓间充质干细胞制剂，其特征在于，所述牙髓间充质干细胞制剂的渗透压为280～320毫渗当量/升。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的牙髓间充质干细胞制剂，其特征在于，所述牙髓间充质干细胞为自体牙髓间充质干细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的牙髓间充质干细胞制剂，其特征在于，所述富血小板血浆为自体富血小板血浆。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的牙髓间充质干细胞制剂，其特征在于，所述微载体为交联猪明胶微载体。
9.如权利要求1至8中任一项所述牙髓间充质干细胞制剂在制备修复牙槽骨退化的药物中的应用。
10.如权利要求1至9中任一项所述牙髓间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用微载体培养牙髓间充质干细胞，得到负载牙髓间充质干细胞的微载体；
采用PRP重悬所述负载牙髓间充质干细胞的微载体，得到牙髓间充质干细胞制剂。
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